DESIGNING AN EXPERIMENTAL ELISA KIT BASED ON MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST 200 KDA ANTIGEN OF THE MELIOIDOSIS AGENT

Full Text

Мелиоидоз - опасное и потенциально смертельное заболевание людей, распространенное в эндемичных регионах юго-восточной Азии и Северной территории Австралии. Этиологический агент мелиоидоза, Burkholderia pseudomallei, широко распространен в почве и воде эндемичных зон [10]. Летальность при несвоевременно начатой терапии у больных мелиоидозом может достигать 90 %, а при лечении самыми современными препаратами в условиях стационара составляет от 19 °% (Австралия) и до 51 °% (Таиланд) [9]. Согласно принятой в нашей стране классификации, возбудитель мелиоидоза является микроорганизмом II группы патогенности для человека. С 2005 г. мелиоидоз внесен в перечень инфекций, требующих постоянного надзора в связи с расширением зон эндемичного распространения этого патогена, отсутствием зарегистрированных средств специфической профилактики, а также эффективных схем лечения данного заболевания. Для экспресс- и ускоренного обнаружения возбудителя мелиоидоза применяют ряд иммунодиагности-ческих тестов: метод флуоресцирующих антител (МФА), твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФМ), а также реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) [2]. В последние годы возрос интерес к созданию им-мунодиагностических препаратов на основе моноклональных антител (МКА) к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei. Установлено, что выявление вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза, их дифференциация от авирулентных штаммов, обусловлено присутствием в капсуле бактерий гликопротеина с м. м. 200 kDa [5]. В связи с этим, одним из актуальных направлений в совершенствовании лабораторной диагностики мелиоидоза является разработка средств дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов B. pseudomallei, выделяемых из проб клинического материала и объектов внешней среды [4]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка экспериментальной тест-системы иммуноферментной на основе МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei и оценка ее диагностических возможностей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали различные антигены (АГ) буркхольдерий II и III групп патогенности и гетерологич-ных микроорганизмов. Все этапы работы с живыми куль- Выпуск 3 (51). 2014 93 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ турами бактерий были проведены в соответствии с СП 1.3.1285-03. Водно-солевые экстракты (ВСЭ) получали из обеззараженных и высушенных ацетоном клеток B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia, Pseudomonas aeruginosa, Brucella melitensis, B. abortus, B. suis. Гликопротеин капсулы B. pseudomallei 100 с м.м. 200 kDa был получен с помощью модифицированного метода Фуллера [3]. Основу тест-системы составляли МКА к гликопротеину 200 kDa различной эпитопной направленности, вырабатываемые гибридомами-продуцентами из коллекции лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. С целью последующего культивирования клеток и накопления МКА в препаративных количествах in vitro гибридомы были выведены из состояния глубокого холода (-196 oC). Клетки культивировали при 37 oC в атмосфере 5 % СО2 и 70-80 % влажности с использованием среды RPMI-1640 с добавлением 15 % эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамина, пиру-вата натрия. Отбор клонов, секретирующих МКА в среду выращивания, проводили после регистрации положительных результатов непрямого варианта ТИФМ, применявшегося в качестве метода скрининга антителопродукции гибридом. Контрольным АГ служил гликопротеин 200 kDa B. pseudomallei 100. Накопление МКА in vivo осуществляли внутрибрю-шинным введением 1-5-106 клеток гибридом линейным мышам BALB/c, предварительно праймированным пристаном за 5-7 дней до введения клеток. МКА получали из асцитической жидкости (АЖ) мышей. Иммуноглобулины выделяли из АЖ методом трехкратного переосаждения белка сульфатом аммония. В непрямом методе флюоресцирующих антител оценивали специфическую активность МКА, а в реакции иммунодиффузии подтверждали их гомогенность и видовую принадлежность. Иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) получали по методу Nakane P. K., Kawaoi A. [8]. Рабочее разведение каждого из них определяли, используя методику шахматного титрования. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Экспериментальная тест-система представляла собой сэндвич-вариант ТИФМ. Первый ее компонент - индивидуальные образцы МКА или их смеси, используемые в качестве лигандов, сорбируемых на твердой фазе, второй - антиген 200kDa B. pseudomallei 100, третий - ИПК. Оптимальный состав смеси первого порядка определяли, основываясь на данных о конкурентном взаимоотношении антител и величинах констант аффинности МКА с контрольным образцом АГ. Данные о конкурентных взаимоотношениях МКА были получены с помощью методики определения индексов аддитивности различных пар МКА, предложенной Friguet B. с соавторами [7]. Подробные сведения о выполнении этого раздела были опубликованы ранее [1]. Аффинность МКА в отношении контрольного АГ определяли по методике, предложенной Beatty J. D. [6]. В результате выполнения этой серии экспериментов было установлено, что наибольшая чувствительность иммуноферментной реакции достигалась при использовании смеси МКА 3C6 + 5C2+2A6 с концентрацией белка от 10 до 20 мкг/мл. При повышении нагрузки до 50 мкг/мл чувствительность реакции существенно снижалась. При подборе детектирующих антител, на основе которых были приготовлены ИПК, были апробированы четыре варианта моноклональных иммуноглобулинов к антигену 200 kDa. Наибольшая чувствительность тест-системы обеспечивалась при использовании ИПК на основе МКА 5С2. Таким образом, после завершения этапов оптимизации условий подготовки твердой фазы, выбора МКА для получения ИПК, была сконструирована экспериментальная тест-система и созданы условия для проверки ее чувствительности при работе с различными образцами АГ. Чувствительность тест-системы в реакции со стандартным АГ составляла 0,34 мкг/мл. Все этапы постановки реакции выполняли согласно общепринятым рекомендациям. Экспериментальную тест-систему использовали для контроля качества различных серий антигена 200 kDa, приготовленных по стандартной методике, но из различных партий сырья. Результаты реакции выявили существенные колебания в содержании АГ в ряде серий препарата гликопротеина - от 0,98 до 46 мкг/мл. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при изготовлении контрольных образцов гликопротеина 200 kDa необходимо применять не только методы анализа химического состава, но и определять уровень иммунологически активного АГ. Вторая серия опытов была посвящена определению концентрации антигена 200 kDa в смесях водорастворимых АГ, экстрагированных из обеззараженных ацетоном микробных клеток (ВСЭ) различных штаммов патогенных видов буркхольдерий (B. pseudomallei и B. mallei), а также гетерологичных видов микроорганизмов. Всего было проверено 29 образцов ВСЭ, изолированных из 17 штаммов B. pseudomallei, 3 штаммов B. mallei, 9 штаммов гетерологичных видов буркхольдерий. В 11 образцах ВСЭ B. pseudomallei из 17 проверенных (71 %) был выявлен антиген 200 kDa. Минимальная детектируемая концентрация АГ при этом составляла 2,17 мкг/мл (B. pseudomallei 56812). При постановке реакции с тремя образцами ВСЭ B. mallei в одном случае реакция была положительной. При постановке ТИФМ с ВСЭ штаммов гетерологичных микроорганизмов (B. thailandensis, B. cepacia, P. aeruginosa, B. melitensis, B. abortus, B.suis) чувствительность обнаружения была значительно ниже. 94 Выпуск 3 (51). 2014 ЦэеипрВз При работе со взвесью живой культуры слабовирулентного штамма B. pseudomallei 107 чувствительность экспериментальной тест-системы составляла 5106 м.к./мл. При постановке реакции со взвесью близкородственных буркхольдерий B. thailandensis264 был получен отрицательный результат. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Разработана технология изготовления экспериментальной тест-системы, пригодной для обнаружения гликопротеина капсулы с м.м. 200 kDa в водорастворимых антигенных смесях и взвесях живых культур патогенных буркхольдерий. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

T. V. Zamarina

Email: vari2@sprint-v.com.ru

N. P. Khrapova

I. I Korsakova

E. V. Pimenova

References

Supplementary files