РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЯ «ОСТАТОЧНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ РАСТВОРИТЕЛИ» В СУБСТАНЦИИ ГСБ-106
- Авторы: Дуденкова М.Е.1, Гоушевская Л.Н1, Сергеева М.С1, Гаевая Л.М1, Денисенко Е.Д1, Минаев С.В1, Тарасюк А.В1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
- Выпуск: Том 17, № 1 (2020)
- Страницы: 46-50
- Раздел: Статьи
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/119375
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2020-1(73)-46-50
- ID: 119375
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Полный текст
Для внедрения субстанции в медицинскую практику в рамках доклинических испытаний необходимо доказательство ее чистоты. Одним из показателей контроля качества субстанции является содержание остаточных органических растворителей (ООР), которые могут влиять на фармакологическую активность лекарственного препарата. К ООР относят летучие растворители, которые используются или образуются на любой стадии производства фармацевтических субстанций, вспомогательных веществ или лекарственного препарата и полностью не удаляются после завершения технологического процесса. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка и валидация методики определения содержания остаточных органических растворителей в субстанции ГСБ-106 методом газожидкостной хроматографии c учетом современных требований. В ходе синтеза и выделения субстанции ГСБ-106, представляющий собой замещенный димерный дипептид, гексаметилендиамид бис(Ы-моносукцинил^-серил^-лизина) [4, 7] используют следующие растворители: метанол (второй класс токсичности, содержание не более 0,3 % / 3000 ppm), спирт этиловый (третий класс токсичности, содержание не более 0,5 % / 5000 ррм), пиридин (второй класс токсичности, содержание не более 0,02 % / 200 ppm). Содержание в образце субстанции ледяной уксусной кислоты (ЛУК) должно быть обосновано производителем [5]. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Поиск и идентификация остаточных органических растворителей осуществлялись на газовом хроматографе Varian 450-GC c пламенно-ионизационным детектором и автосамплером Varian PAL Autosampler. Традиционным методом ввода пробы в газовой хроматографии является прямой ввод микрошприцем раствора в испаритель, но в данном исследовании этот способ имеет ряд недостатков. Большое количество воды может привести к разрушению (гидролизу) некоторых неподвижных жидких фаз, содержащих полиэтиленгликоль [1]. Попадание в хроматографическую колонку нелетучего вещества субстанции может привести к блокированию активных центров неподвижных жидких фаз продуктами термического разложения. Чтобы исключить перечисленные негативные факторы, для извлечения летучих остаточных растворителей был применен метод «анализа равновесного пара» (АРП), или «парофазный анализ» (ПФА), в зарубежной литературе получивший название Head-Space Analysis (HSA) [3]. Парофазный анализ в зависимости от условий применения различают на статический и динамический [2]. Нами был применен статический метод, заключающийся в термостатировании определенного количества раствора субстанции, содержащего остаточные летучие растворители в герметично закрытой виале. После установления фазового равновесия (20 мин), при котором часть летучего вещества переходила в газовую фазу, хроматографическим шприцом отбиралась часть газовой фазы и вводилась в испаритель хроматографа. Валидация аналитической методики проводилась в соответствии с ГФ XIV и нормами руководства Международной конференции по гармонизации (ICH) Q2(R1) [6, 9]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ С целью выбора оптимальных условий проведения анализа была изучена хроматографическая подвижность указанных выше растворителей, которые могут присутствовать в субстанции ГСБ-106. Выбор условий хроматографирования основывался на физико-химических свойствах анализируемых соединений. В качестве растворителя был выбран диметил-сульфоксид (ДМСО), поскольку данный растворитель обладает высокой температурой кипения и крайне медленно испаряется при нормальном атмосферном давлении. Это делает его очень удобным растворителем для экстракции более летучих органических растворителей [8]. В качестве внутреннего стандарта был выбран бутанол-1, так как он схож по своему строению с другими определяемыми остаточными растворителями, присутствие которых наиболее вероятно в субстанции (метанол, этанол). На этапе разработки методики были исследованы модельные смеси органических растворителей и внутреннего стандарта (бутанол-1) с концентрациями, соответствующими нормам содержания ООР в субстанции [5]. Для извлечения анализируемых соединений из растворов 2 мл раствора модельной смеси помещали в хроматографическую виалу объемом 15 мл и термостатировали. При выборе между различными режимами термостатирования образца было установлено, что необходимым условием достижения равновесного распределения анализируемых органических растворителей между жидкой и газовой фазами является выдерживание пробы при 80 °С в течение 20 минут. Нами была проведена разработка условий хроматографирования, позволяющих эффективно разделить пики всех остаточных органических растворителей, присутствие которых возможно после завершающей стадии очистки субстанции ГСБ-106. Наилучшего разделения всех веществ удалось добиться при использовании температурного градиента в следующих условиях: колонка капиллярная CP-WAX 52 CB, 50 м * 0,32 мм, 1,2 мкм (Agilent); скорость потока газа носителя (азота) 1,5 мл/мин; скорость потока водорода 30 мл/мин; скорость потока воздуха 300 мл/мин; температура инжектора 130 °С; температура детектора 190 °С; температура термостата в градиентном режиме (рис. 1); объем пробы 1000 мкл; внутренний стандарт бутанол-1; растворитель для проб ДМСО; время анализа 32 мин. Условия термостатирования пробы: температура 80 °С; время установления равновесия 20 мин. Рис. 1. Температурный градиент нагрева термостата Т (мин) -1 Разработанные условия обеспечивают четкое разделение хроматографических пиков всех анализируемых остаточных растворителей. Времена удерживания анализируемых оста-точ ных растворителей, параметры разделения, пределы обнаружения (ПО) и пределы количественного определения (ПКО) представлены в табл. 1. Таблица 1 Соединение Метанол Этанол Бутанол-1 Пиридин ЛУК Время удерживания (RT), мин 9,80 ± 0,03 10,59 ± 0,04 14,64 ± 0,04 15,95 ± 0,04 20,23 ± 0,04 Относительное время удерживания (RTT) 0,670 ± 0,004 0,723 ± 0,006 1,0 1,089 ± 0,003 1,382 ±0,005 Коэффициент асимметрии (As) 1,37 ± 0,01 1,31 ± 0,01 1,27 ± 0,01 2,35 ± 0,01 1,25 ± 0,01 Число теоретичес-ких тарелок (N) 123016± 345 162289±237 925250 ± 547 492567,18 ± 326,00 655230 ± 231 Разрешение соседних пар (Rs) - 2,05 23,24 16,94 46,17 ПО, мкг/мл * 0,914 0,668 0,738 0,664 10,18 ПКО, мкг/мл * 3,02 2,0 2,44 2,2 33,6 * Пределы обнаружения определены экспериментально по соотношению сигнал/шум (уровень шума ±30 мВ). Типичная хроматограмма раствора модельной смеси органических растворителей представлена на рис. 2. Результаты оценки характеристик пиков определяемых ООР и их ПО и ПКО Рис. 2. Хроматограмма модельной смеси остаточных органических растворителей и внутреннего стандарта в предельно допустимых концентрациях: 1 - метанол, 0,3 мг/мл; 2 - этанол, 0,5 мг/мл; 3 - бутанол-1, 0,01 мг/мл; 4 - пиридин, 0,02 мг/мл; 5 - ЛУК, 5,0 мг/мл; 6 - ДМСО Для установления линейности методики были от 0,0005 до 5,0 мг/мл. Линейная зависимость наблю-приготовлены и проанализированы модельные далась во всем изучаемом диапазоне, коэффициент смеси растворителей в диапазоне концентраций корреляции составил не менее 0,999 (рис. 3). Рис. 3. Линейные регрессионные зависимости между концентрацией испытуемых соединений и площадью пика Результаты оценки правильности и сходимости методики на модельных растворах остаточных растворителей представлены в табл. 2. Таблица 2 Результаты определения ООР в модельных растворах для оценки правильности и сходимости методики Содержание в % от концентрации исп. раствора Взято, г (m-i) Найдено, г (m2) Абсолютная ошибка, А (m2 - m-i) Отн. ошибка А х 100/m1 Найдено, % Метрологические характеристики Метанол 0,005 0,0065 0,0063 0,0002 3,08 96,92 Хср = 99,47 S = 1,43 RSD = 1,44 % ЛХ = 1,33 £ = 1,33 % tвыч = 1,12 ^абл. = 2,45 0,01 0,0132 0,0134 -0,0002 1,52 101,52 0,02 0,0269 0,0265 0,0004 1,49 98,51 0,05 0,0657 0,0655 0,0002 0,31 99,70 0,1 0,1013 0,1009 0,0004 0,39 99,61 0,15 0,1507 0,151 -0,0003 0,21 100,20 0,2 0,2013 0,2009 0,0004 0,21 99,80 Этанол 0,01 0,0103 0,0104 -0,0001 0,97 100,97 Хср = 99,76 S = 1,06 RSD = 1,06 % ЛХ = 0,92 £ = 0,92 % tвыч = 1 ,53 ^абл. = 2,45 0,02 0,0206 0,0201 0,0005 2,43 97,57 0,05 0,0525 0,0522 0,0003 0,57 99,43 0,1 0,1032 0,1028 0,0004 0,39 99,61 0,15 0,1514 0,1517 -0,0003 0,20 100,20 0,2 0,2021 0,2019 0,0002 0,10 99,90 0,5 0,5012 0,5018 -0,0006 0,10 100,1 Пиридин 0,005 0,0053 0,0054 -0,0001 1,89 101,89 Хср = 99,76 S = 1,42 RSD = 1,42 % ЛХ = 1,32 £ = 1,32 % tвыч = 1,13 ^абл. = 2,45 0,01 0,0107 0,0104 0,0003 2,80 97,20 0,02 0,0217 0,0215 0,0002 0,92 99,08 0,05 0,0535 0,0537 -0,0002 0,37 100,37 0,1 0,1071 0,1068 0,0003 0,28 99,72 0,15 0,1526 0,1525 0,0001 0,07 99,93 0,2 0,2003 0,2005 -0,0002 0,10 100,10 Ледяная уксусная кислота 0,1 0,1153 0,1147 0,0006 0,520382 99,45 Хср = 99,95 S = 0,27 RSD = 0,27 % ЛХ = 0,25 £ = 0,25 % tвыч = 2,21 ^абл. = 2,45 0,2 0,2304 0,2313 -0,0009 -0,39063 100,39 0,37 0,3711 0,3709 0,0002 0,053894 99,95 0,5 0,5008 0,5004 0,0004 0,079872 99,92 1,0 1,0002 0,9993 0,0009 0,089982 99,91 2,0 2,0341 2,0338 0,0003 0,014749 99,99 3,0 3,0012 3,0017 -0,0005 -0,01666 100,02 Критерием приемлемости при определении правильности методики определения остаточных органических растворителей являются величина относительной ошибки среднего результата и отсутствие значимой систематической ошибки. Численные значения коэффициента нормированных отклонений t (коэффициент Стьюдента), рассчитанные по результатам анализа, составили не более 2,2. Табличное значение коэффициента Стьюдента при 95%-й доверительной вероятности и степени свободы f = 6 равно 2,45, то есть соблюдается неравенство 4ыч < f^. (95 %, 6). Как видно из данных, приведенных в табл. 2, относительная ошибка среднего результата для всех примесей не превышает 5,0 %, что приемлемо. Эти данные позволяют считать, что результаты, полученные с помощью разработанной методики определения остаточных органических растворителей в субстанции ГСБ-106 методом ГЖХ, являются правильными и не отягощены систематической ошибкой. Нами была оценена прецизионность (сходимость) методики. Сходимость оценивали при выполнении анализа в одной лаборатории одним аналитиком на одном и том же оборудовании в течение одного дня. Относительные стандартные отклонения (RSD) для всех обнаруженных оОр не превышали 2,0 %, что свидетельствует об удовлетворительной прецизионности методики [6]. Для проверки пригодности хроматографической системы было предложено готовить раствор всех определяемых ООР в предельно допустимых концентрациях. Проверка пригодности проводится по следующим параметрам: эффективность хроматографической колонки, выраженная числом теоретических тарелок (N), фактор асимметрии пика бута-нола (As), величина относительного стандартного отклонения площади пика (RSD), а также по разрешению (Rs) между соседними парами пиков. На основании полученных результатов были установлены следующие критерии приемлемости: числом теоретических тарелок (N) для пика бута-нола не менее 900000; фактор асимметрии пика бутанола (As) не более 1,5; величина относительного стандартного отклонения площади пика бутанола (RSD) не более 2,0 %; разрешение пиков метанола и этанола 2,0 ± 0,05. С помощью разработанной методики был проведен анализ образца субстанции ГСБ-106. Для приготовления испытуемого раствора 0,2 г субстанции ГСБ-106 (точная навеска) помещали в хроматографическую виалу объемом 15 мл, добавляли 2 мл раствора В (внутреннего стандарта -раствора бутанола-1 с концентрацией 0,01 мг/мл). Для приготовления раствора внутреннего стандарта около 0,01 г бутанола-1 (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, содержащую заранее отмеренные 5 мл ДМСО. Доводили объем раствора ДМСО до метки (Раствор А). Затем 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора ДМСО до метки и тщательно перемешивали. Концентрация 0,01 мг/мл (Раствор В). Для приготовления стандартного раствора около 0,03 г метанола, 0,05 г этанола, 0,002 г пиридина, 5,0 г ледяной уксусной кислоты (точные навески) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, содержащую заранее отмеренные 50 мл ДМСО, далее добавляют 1 мл раствора А. Доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Тщательно перемешивают. В экспериментальном образце субстанции ГСБ-106 нами были обнаружены и количественно определены такие остаточные органические растворители, как: метанол - не более 0,11 %, этиловый спирт - не более 10,1 %, пиридин - не более 0,01 % и ледяная уксусная кислота - не более 3,2 %. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Разработана и валидирована методика определения ООР в субстанции ГСБ-106 с помощью метода ГЖХ с применением парофазного анализа. Разработанная методика позволяет обнаружить все органические растворители, используемые в ходе синтеза и очистки субстанции: метанол, этанол, пиридин и ЛУК при их совместном присутствии. Доказана линейность зависимости площадей пиков всех изученных растворителей от их концентрации в пробе в диапазоне применения методики, определены их пределы обнаружения и количественного определения. Показано отсутствие систематической ошибки методики на модельных смесях. Полученные результаты позволяют сделать заключение о специфичности, линейности, правильности и прецизионности (сходимости) разработанной методики, что позволяет рекомендовать ее для включения в проект НД на субстанцию ГСБ-106.Об авторах
Мария Евгеньевна Дуденкова
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
Email: otopharm@mail.ru
к. ф. н., старший научный сотрудник опытно-технологического отдела
Л. Н Гоушевская
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
М. С Сергеева
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
Л. М Гаевая
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
Е. Д Денисенко
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
С. В Минаев
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
А. В Тарасюк
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова»
Список литературы
- Вигдергауз М.С. Расчеты в газовой хроматографии. - М.: Химия, 1978. - С. 246.
- Гольберт К.А., Вигдергауз М.С. Введение в газовую хроматографию. - М.: Химия, 1990. - С. 344.
- Гольберт K.A., Вигдергауз M.C. Курс газовой хроматографии. - М.: Химия, 1974. - С. 376.
- Гудашева Т.А., Тарасюк А.В., Помогайбо С.В. и др. Дизайн и синтез дипептидных миметиков мозгового нейротрофического фактора // Биоорган. химия. - 2012. -Т. 38, № 3. - С. 280-290.
- ОФС 1.1.0008.15 Остаточные органические растворители // ГФ XIV. - Т. 1. - С. 203.
- ОФС 1.1.0012.15. Валидация аналитических методик // ГФ XIV. - Т. 1. - С. 276.
- Середенин С.Б., Воронина Т.А., Гудашева Т.А. и др. Антидепрессивный эффект оригинального низкомолекулярного миметика BDNF, димерного дипептида ГСБ-106 // Acta Naturae. - 2013. - Т. 5, № 4 (19). - С. 116-120.
- Bordwell F.G., Equilibrium acidities in dimethyl sulfoxide solution // Acc. Chem. Res. - 1988. - P. 21.
- Validation of analytical procedures: text and methodology. Q2 (R1) // ICH Harmonized Tripartite Guideline. - 2005.
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)