ANTITHROMBOTIC EFFECT OF A COMPOUND RU-1144 ON THE MODEL OF SYSTEMIC ARTERIAL THROMBOSIS

Full Text

Важным фактором, который определяет исход Химический класс замещенных гетероциклизаболеваний сердечно-сосудистой системы, явля- ческих азотосодержащих соединений считается ются артериальные тромбозы. В случае развития перспективным для создания на его основе новых атеросклеротического повреждения сосудистой препаратов, о чем свидетельствует широкий спектр стенки происходит фиксирование скоплений тромбо- пр°являем°й би°л°гической активности [4, 5]. цитов на поврежденном эндотелии сосудов, проис- В ранее проведенных исследованиях была установ-ходящее с помощью фибриновых нитей, и, в итоге, лена способность химического соединения РУ-1144, образуются белые тромбы [9]. Несмотря на то, что содеРжащего в своей структуре пространственно изначально тромбоциты рассматривались лишь затрудненный фенол, проявлять выраженную анти-как элементы, участвующие в образовании гемо- аФегантную и антиоксидантную активности. статического тромба в месте повреждения сосудистой стенки, в настоящее время доказано, что ЦЕЛЬ РАБОТЫ они являются ключевыми медиаторами патогенеза Изучить антитромботическую активность на артериальных тромбозов и атеросклероза. Кроме модели артериального адреналин-коллагенового того, в последние годы сформировалась концепция тромбоза у мышей in т°. о важнейшей роли перекисного окисления липидов в патогенезе повышения тромбогенного потенциала МЕТОДИКА ИССЛЕД°ВАНИЯ крови, определены источники активных форм кис- Эксперименты выполнены на 40 белых бесполорода и азота, которые вносят вклад в развитие родных мышах обоего пола массой 20-25 г, содер-данной патологии [7, 8]. Все вышеперечисленное жащихся в условиях вивария (температура 22-24 °С, является теоретическим обоснованием использова- относительная влажность воздуха 40-50 %) с естения антиагрегантных и антиоксидантных препаратов ственным световым режимом на стандартной в качестве средств патогенетической терапии. диете (ГОСТ Р 50258-92) при соблюдении правил лабораторной практики проведения доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Эксперименты были одобрены региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области (протокол № 2022-2016 от 7 октября 2015 г.). Данное исследование выполнено в соответствии с требованиями действующего «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (под ред. Миронова А.Н., 2012 г.) [3]. Изучение антитромботической активности соединения 1 -(2,6-дитретбутил-4-(1 -гидроксиэтил)-фенил-пиримидобензимидазол гидрохлорид (НИИ ФОХ ЮФУ, г. Ростов-на-Дону) in vivo проводили на модели клеточного адреналин-коллагенового тромбоза в соответствии с методикой Di Minno G. (1983) [6]. В качестве тромботического агента использовали смесь растворов коллагена и адреналина в дозе 0,5 и 0,06 мг/кг соответственно. Данную смесь в объеме 0,1 мл вводили в хвостовую вену животного в течении 10 с. Соединение Ру-1144 растворяли в дистиллированной воде и вводили перорально при помощи атравматичного металлического зонда за 2 часа до моделирования тромбоза. В качестве препаратов сравнения использовали лекарственные средства с высоким уровнем доказательности - ацетилсалициловую кислоту (Sigma, США) и клопидогрел (Sanofi, Франция). Тестируемые образцы вводили в дозах ED50, полученных при изучении антиагрегантной активности in vivo согласно методу [1]. Для соединения РУ-1144 доза составила 18,8 мг/кг, а для ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела -28,5 и 13,8 мг/кг соответственно. Животным контрольной группы вводился растворитель в эквивалентном объеме. Для оценки эффективности тестируемых образцов отмечалось количество выживших животных по сравнению с контрольной группой, а также наличие тромбов в сосудах легких. В течение суток устанавливалось наблюдение за выжившими животными. Погибшие и выжившие мыши (для эвтаназии применялся эфирный наркоз) подвергались вскрытию для гистологической оценки легких. У животных контрольной группы была также проведена гистологическая оценка печени, сердца, почек, головного мозга. После забора материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (pH 7,4) на 24 часа, обезвоживали и заливали в парафин. Затем из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм и окрашивали их по методу Саркисова (1996) гематоксилином и эозином. Фотографирование гистологических препаратов осуществляли цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) с использованием объектива *10, х40 и окуляра *10. При морфологическом исследовании проводили оценку наличия признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel 2007 (среднее значение и стандартная ошибка средней величины), а также программы GraphPad Prism 5.0 с использованием критерия one-way ANOVA с поправкой Бонферрони и критерия Фишера. При исследовании гистологических срезов микропрепаратов оценивали наличие признаков тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа. Статистическую обработку данных гистологических исследований проводили с использованием программы «Видео Тест Морфо-4». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При исследовании антитромботического действия соединения РУ-1144 на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза была продемонстрирована его высокая активность. После введения тромботических агентов в группе контрольных животных наблюдалось увеличение частоты дыхания, выраженный экзофтальм, парез задних конечностей и характерные тетанические судороги: мыши не были способны отдергивать задние лапы при сильном нажатии и принимали характерную позу, при которой задние лапы были выпрямлены и отведены назад. Через 1-3 минуты после внутривенного введения смеси адреналина и коллагена животные погибали от удушья. В группе контрольных животных наблюдалась гибель 95 % животных. Введение соединения РУ-1144 и препаратов сравнения ацетилсалициловой кислоты и клопидо-грела достоверно повышало выживаемость мышей при создании данной модели тромбоза до 80, 60 и 50 % соответственно (рис. 1). ^ Число выживших животных в % *Данные, достоверные по отношению к контролю (точный критерий Фишера, p < 0,01). Рис. 1. Выживаемость мышей на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза под действием соединения РУ-1144 и препаратов сравнения ацетилсалициловой кислоты и клопидогрела При этом дыхательная и двигательная активность выживших животных полностью восстанавливались через 1-2 минуты, а у погибших животных смерть наступала только спустя 5-10 минут. При этом у мышей наблюдались менее выраженные симптомы дыхательной недостаточности. Таким образом, было показано, что соединение РУ-1144 обладает выраженной антитромботи-ческой активностью, при этом превосходя препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел в 1,3 и 1,6 раз соответственно. Согласно литературным данным [2] гибель животных в результате введения тромботических агентов наступает в результате массивной окклюзии микрососудов легких тромбоцитарными агрегатами. Поэтому было выполнено гистологическое исследование легких, а также печени, сердца, почек и головного мозга животных. В результате было показано наличие тромбов только в микрососудах легких. Во всех остальных органах повреждений не обнаружено, что соответствует данным, полученным другими исследователями [2]. При исследовании срезов легких (рис. 2) контрольных животных при помощи электронномикроскопического исследования было выявлено преобладание альвеол средних размеров, в значительной части сосудов микроциркуляторного русла были обнаружены тромбы, адгезированные к сосудистой стенке и находящиеся в просвете сосуда. Отмечалось выраженное расширение межальвео-лярных перегородок за счет полнокровия и отека, обнаружены также явления диапедеза эритроцитов в межальвеолярные перегородки, в просвет некоторых альвеол, явления стаза и очаговые мелкие кровоизлияния. Выявлялась слабо выраженная лимфоидная инфильтрация в периваску-лярных отделах и в стенках мелких бронхов. Также в контрольных образцах наблюдалось большое количество тромбов в просветах сосудов. При проведении морфометрического исследования срезов легких контрольных животных выявлено, что относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (4,15 ± 1,12) %, а средняя площадь тромба на срезах составила (9858,41 ± 2261,26) мкм2 (табл.). Рис. 2. Тромбообразование в легких под влиянием внутривенного введения смеси коллагена и адреналина. Окраска гематоксиллином и эозином Ув. 100 Антитромбогенная активность соединения РУ-1144 и препаратов сравнения на модели генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза в дозах ED50, полученных в тестах ex vivo Тестируемые образцы Доз а , мг/кг Средняя площадь тромбов, мкм2 Относительная площадь тромбов, % Контроль - 9858,41 ± 2261,26 4,15 ± 1,12 РУ-1144 18,8 3590,17 ± 1097,21* 1,51 ± 0,42* Ацетилсалициловая кислота 28,5 4372,69 ± 1237,61* 1,83 ± 0,58* Клопидогрел 13,8 4768,83 ± 1479,71* 1,98 ± 0,67* *Данные достоверны относительно контроля, one-way ANOVA с поправкой Бонферрони (р < 0,05). На срезах легких мышей, получавших соединение РУ-1144, наблюдались единичные тромбы в венах, адгезированные к сосудистой стенке. Кровоизлияния отсутствовали (рис. 3). Относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (1,51 ± 0,42) %, то есть снижалась на 2,64 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, а средняя площадь тромба на срезах составила (3590,17 ± 1097,21) мкм2, то есть снижалась на 63,58 % (р < 0,05) по сравнению с контролем (см. табл.). Рис. 3. Влияние соединения РУ-1144 на тромбообразование в легких мышей, вызванное внутривенным введением смеси коллагена и адреналина. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100 У животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, наряду с альвеолами средних размеров, встречались эмфизематозно-расширенные альвеолы и альвеолы меньших размеров. Преобладали нарушения кровообращения по типу полнокровия капилляров межальвеолярных перегородок и других сосудов микроциркуляторного русла. Выявляли сь небольшие единичные тромбы, преимущественно, в сосудах венозного типа. Отмечалось При проведении морфометрического исследования срезов легких животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, выявлено, что относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (1,83 ± 0,58) %, то есть снижалась на 2,32 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, а средняя площадь тромба на срезах составила (4372,69 ± 1237,61) мкм2, то есть снижалась на 55,65 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. У животных, получавших клопидогрел, преобладали нарушения кровообращения по типу полнокровия капилляров межальвеолярных перегородок и других сосудов микроциркуляторного русла. Были выявлены небольшие единичные тромбы. Отмечалось утолщение межальвеоляр-ных перегородок за счет полнокровия. Мелкоочаговые кровоизлияния в стенку капилляров и просвет альвеол (рис. 5). При проведении морфометрического исследования срезов легких животных, получавших Рис. 5. Влияние клопидогрела на тромбообразование в легких мышей, вызванное смесью коллагена и адреналина. Окраска гематоксиллином и эозином. Ув.100 клопидогрел, выявлено, что относительная площадь тромбов на срезах легкого составила (1,98 ± 0,67) %, то есть снижалась на 2,17 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, а средняя площадь тромба на срезах составила (4768,83 ± 1479,71) мкм2, то есть снижалась на 51,63 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. ЗАКЛЮЧЕНИЕ утолщение межальвеолярных перегородок за счет полнокровия (рис. 4). Рис. 4. Влияние ацетилсалициловой кислоты на тромбообразование в легких мышей, вызванное смесью коллагена и адреналина. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100 Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что в результате изучения влияния соединения РУ-1144 на процессы тромбообразования, вызванные повреждением стенки артерий введением тромботических агентов, установлена его высокая способность увеличивать в ыживае мость животных в эксперименте при однократном внутрижелудочном введении, превосхо-д я щая ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел в 2 и 1,6 раза соответственно. В инициации данной модели тромбоза ключевую роль играют именно тромбоциты, в мембранах которых при их активации происходит усиление ПОЛ. Следовательно, полученные данные подтверждают, что способность соединения РУ-1144 угнетать процессы агрегации тромбоцитов и ПОЛ приводит к предотвращению тромбообразования. Это подтверждают и данные морфологического исследования срезов легких мышей. Так, соединение РУ-1144 снижает среднюю и относительную площадь тромбов на срезе легкого в 3,8 и 2,7 раза соответственно по отношению к контролю, при этом превосходя по данным показателям препараты сравнения - ацетилсалициловую кислоту и клопидогрел.

About the authors

A. A Spasov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

A. F Kucheryavenko

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

A. V Smirnov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

K. A Gaidukova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: ksenijagajjdukva@rambler.ru

V. S Sirotenko

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

N. G Panshin

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

O. N Zhukovskaya

Research Institute of physical and organic chemistry, Southern Federal University

References

Supplementary files