NEPHROPROTECTIVE EFFECT OF A COMBINATION OF THE PEPTIDE MIMICKING THE a-SPATIAL STRUCTURE OF THE p ERYTHROPOIETIN CHAIN AND INFLIXIMAB IN RENAL ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY

Full Text

Одними из наиболее перспективных препаратов для коррекции ишемически-реперфузионной травмы почек являются эритропоэтин и его производные [1, 2]. Активация гетеродимерного рецептора обуславливает развитие цитопротективных эффектов [3, 4]. В практике лечение высокими дозами эритропоэтина привело к увеличению риска тромботических событий в первый год после трансплантации (эритропоэтин 24,4 % по сравнению с плацебо 6,4 %). С целью предотвращения этих нежелательных явлений были разработаны производные эритропоэтина, которые активируют только цитопротективное действие и не влияют на эритропоэз [5]. pHBSP - это синтетический пептид, который селективно связывается с гетеродимерным рецептором. Уже было показано, что pHBSP не является эритропоэтическим. Значимую роль в патофизиологии повреждения при ишемии/реперфузии почек играют провоспалительные цитокины, включая фактор некроза опухоли-a (TNF-a) [6]. В фармакологии известны препараты, снижающие активность фактора некроза опухоли-альфа. Одним из них является инфликсимаб [7]. Он обладает высокой аффинностью к фактору некроза опухоли-a, а также блокирует ряд провоспалительных интерлейкинов: интерлейкин-1, интерлейкин-6, интерлейкин-8, моноцитарный хемоатрактант-ный белок-1 и другие активные факторы, участвующие в процессах воспаления и деструкции в тканях. Таким образом, это исследование было предпринято, чтобы выяснить, превосходят ли ренопротек-тивные эффекты комбинации пептида, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина-бета (pHBSP), и инфликси-маба при ишемии-реперфузии почек от использования этих веществ в монорежиме. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Исследовать нефропротективные эффекты комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритро-поэтина-бета (pHBSP), и инфликсимаба в условиях моделирования ишемически-реперфузионной травмы почек. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на базе Центра доклинических и клинических исследований ФГАОУ ВО НИУ БеЛГУ. Этические нормы обращения с лабораторными животными соответствовали Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22Sep2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Эксперимент проводился на 50 белых лабораторных крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 г. Животные были разделены на 5 групп, по 10 особей в каждой: 1. Ложнооперированные животные. 2. Ишемия/реперфузия (I/R (контроль). 3. Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина-бета (pHBSP), 25 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии. 4. Ишемия/реперфузия + Инфликсимаб (Remicade®, MSD Ireland (Brinney) 10 мг/кг внутрибрюшинно за 1 час до моделирования ишемии. 5. Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина-бета (pHBSP), 25 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 минут до моделирования ишемии + Инфликсимаб (Remicade®, MSD Ireland (Brinney) 10 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии. Под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) после предварительной обработки операционного поля выполнялась срединная лапаротомия. Путем мобилизации петель кишечника, вскрытия забрюшинного пространства выделялись почки с элементами почечной ножки. Производилось наложение атравматичных сосудистых зажимов на левую почечную ножку на 40 мин. Эффективность наступления ишемии оценивалась по изменению цвета почки. Нефрэктомия справа. Используя аппаратно-программный комплекс MP100 (Biopac System, Inc., США) с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и поверхностный датчик TSD143, измеряли уровень микроциркуляции паренхиме почки. Измерение микроциркуляции производили до ишемии, через 5 мин после реперфузии. Регистрация и обработка результатов производилась с помощью программного обеспечения AcqKnowledge версии 3.8.1. Значения показателей выражались в перфузионных единицах (PU). Далее в брюшную полость вводили 4-5 мл теплого 0,9%-го раствора натрия хлорида, затем рану послойно ушивали. В послеоперационном периоде животные находились в специальных метаболических клетках для сбора мочи в течение 72 часов с обеспечением свободного доступа к воде. Через 72 часа после реперфузии крыс повторно наркотизировали описанным ранее методом, производили релапаротомию, измеряли показатели микроциркуляции, производили забор крови из правого желудочка для биохимических исследований. Клиренс эндогенного креатинина (скорость клубочковой фильтрации) рассчитывался по следующей формуле: Креатинин мочи(мкмоль / л) х объем мочи(мл) Креатинин сыворотки крови (мкмоль/ л)хвремя(мин) Фракционная экскреция натрия (ФЭН) рассчитывалась следующим способом: ^ _ натрий мочи(ммольIл)х креатинин крови(мкмольIл) ..... ФЭН =---- ---х 100% натрий сыворотки крови(ммоль/л) х креатинин мочи(мкмолъ!л) Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро - Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий - с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела - Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна - Уитни соответственно, с поправкой Бенджамини - Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p ^ 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Спустя 72 ч после снятия зажимов с почечных сосудов у животных в группе pHBSP скорость клубочковой фильтрации составила (0,38 ± 0,02) мл/мин. Введение инфликсимаба оказало менее значимый эффект, сохранив СКФ на уровне (0,33 ± 0,02) мл/мин. Применение комбинации pHBSP + инфликсимаб для профилактики ишемически-реперфузионных повреждений по эффективности достоверно превосходило раздельное использование вышеуказанных веществ, зарегистрирован уровень СКФ (0,59 ± 0,05) мл/мин (рис. 1). В монорежиме введение pHBSP и инфликсимаба до ишемии оказало положительный эффект на состояние почечных канальцев: фракционная экскреция натрия составила (2,1 ± 0,16) и (1,5 ± 0,14) % соответственно, по сравнению с группой ишемии/ реперфузии (р < 0,05). На фоне совместного введения пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина-бета, и ин-фликсимаба устранялось нарушение функции почечных канальцев, что подтверждалось уменьшением фракционной экскреции натрия до уровня (0,84 ± 0,12) %. Эффект от комбинированного применения данных препаратов достоверно отличался от показателей при коррекции инфликсимабом или pHBSP в монорежиме (рис. 2). Введение комбинации pHBSP + инфликсимаб оказало наибольшее положительное влияние на показатель микроциркуляции, который был максимально приближен к показателю ложнооперированных животных. Раздельное применение pHBSP и инфликсимаба менее эффективно сохраняло уровень микро-ци р куляции при ишемии/реперфузии (табл.). Рис. 1. Показатели скорости клубочковой фильтрации через 72 часа реперфузии в условиях ишемически-реперфузионной травмы почек Рис. 2. Показатели фракционной экскреции натрия через 72 ч реперфузии в условиях ишемически-реперфузионной травмы почек Влияние pHBSP и инфликсимаба на микроциркуляцию в почке при ишемически-реперфузионном повреждении через 72 ч реперфузии, PU Защитная роль эритропоэтина продемонстрирована в многочисленных доклинических исследованиях на моделях ишемии/реперфузии различных органов и тканей. В своем исследовании мы доказали, что комбинированное использование pHBSP и инфликсимаба в значительной степени способствует сохранению нормальной функциональной активности почек после моделирования ишемически-реперфузионной травмы. Способность pHBSP селективно связываться с гетеродимерным рецептором эритропоэтина и обуславливает активацию плейотропных эффектов: противоишемического, антиапоптотического, противовоспалительного, оказывая защитное действие на паренхиму почки и снижая образование гуморальных факторов, приводящих к клубочковой и канальцевой дисфункции и активации eNOS. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Комбинированное профилактическое применение пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэти-на-бета (pHBSP), в дозе 25 мкг/кг и инфликсимаба в дозе 10 мг/кг при моделировании ишемически -реперфузионной травмы почки продемонстрировало достоверное превосходство нефропротективных свойств, в сравнении с монотерапией данным препаратами. Введение до ишемии pHBSP в дозе 25 мкг/кг и инфликсимаба в дозе 10 мг/кг приводило к восстановлению адекватного функционирования почечных канальцев и улучшению микроциркуляции в почечной паренхиме. Следует отметить, что указанные вещества влияют на разные звенья патологического процесса при ишемической и реперфузионной травме почки: введение pHBSP обуславливает активацию механизмов фармакологического прекондиционирования, в свою очередь инфликсимаб блокирует каскад патологических реакций, обусловленных воспалением и тканевой деструкцией. Таким образом, комбинированная терапия пептидом, имитирующим альфа-спираль эритропоэтина-бета (pHBSP), и инфликсимабом является наиболее перспективной в плане нефропротекции при моделировании острого ишемически-реперфузионного повреждения почек в эксперименте. Экспериментальная группа До ишемии 5 мин 72 ч Ложнооперированные животные 897 ± 45 903 ± 43 890 ± 36 Ишемия/реперфузия 900 ± 42 217 ± 15 410 ± 20 pHBSP (25 мкг/кг) 899 ± 35 681 ± 20 625 ± 36 Инфликсимаб (10 мг/кг) 906 ± 67 688 ± 25 631 ± 30 Инфликсимаб + pHBSP 899 ± 53 806 ± 42 762 ± 41

About the authors

A. S Netrebenko

Belgorod State National Research University

Email: alexnetrebenko@mail.ru
Postgraduate Student of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology Belgorod, Russia

V. V. Elagin

Kursk State Medical University

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department Kursk, Russia

D. A Kostina

Belgorod State National Research University

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology Belgorod, Russia

V. V Gureev

Belgorod State National Research University

Email: produmen@yandex.ru
Doctor of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology Belgorod, Russia

M. V Pokrovsky

Belgorod State National Research University

Email: mpokrovsky@yandex.ru
Doctor of Medical Sciences, Professor, Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Head, Research Institute of Pharmacology of Living Systems Belgorod, Russia

V. I Yakushev

Belgorod State National Research University

Email: vladiyakush@yandex.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology Belgorod, Russia

E. G Saprykina

Belgorod State National Research University

Email: lena.saprykina5555@yandex.ru
Resident of the Department of Hospital Surgery Belgorod, Russia

M. A Zatolokina

Kursk State Medical University; I.S. Turgenev Orel State University

Email: marika1212@mail.ru
Doctor of Medical Sciences, Professor, Professor of the Department of Histology, Embryology, Cytology Kursk, Russia; Orel, Russia

T. V Orlova

Kursk State Medical University

Email: tam-orlova@yandex.ru
Professor of the Department of Pharmaceutical Technology, Doctor of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor Kursk, Russia

References

Supplementary files