Comparative morphological characteristics of the proliferative activity and DNA content in the nuclei of cells of different lung cancer phenotypes

Viktor V. Ermilov; Ермилов Виктор Владимирович; Mikhail V. Bukatin; Букатин Михаил Владимирович; Maria S. Zatyamina; Затямина Мария Сергеевна; Olga N. Barkanova; Барканова Ольга Николаевна; Vyacheslav B. Barkanov; Барканов Вячеслав Борисович; Natalia A. Kolobrodova; Колобродова Наталья Александровна; Olga Yu. Kuznetsova; Кузнецова Ольга Юрьевна; Tatyana N. Shcherbakova; Щербакова Татьяна Николаевна; Anastasia V. Sokolova; Соколова Анастасия Витальевна

doi:10.19163/1994-9480-2023-20-2-125-130

Сравнительная морфологическая характеристика пролиферативной активности и содержания ДНК в ядрах клеток различных фенотипов злокачественных опухолей легкого

Авторы: Ермилов В.В.¹, Букатин М.В.¹, Затямина М.С.¹, Барканова О.Н.¹, Барканов В.Б.¹, Колобродова Н.А.¹, Кузнецова О.Ю.¹, Щербакова Т.Н.¹, Соколова А.В.¹
Учреждения:
1. Волгоградский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 20, № 2 (2023)
Страницы: 125-130
Раздел: Оригинальные исследования
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/567867
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2023-20-2-125-130
ID: 567867

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Выбор метода лечения рака легкого напрямую зависит от диагностики и верификации гистологического типа опухоли. Важными диагностическими критериями служат определение индекса накопления (ИН) ДНК и индекса пролиферации (ИП) Ki-67. Материалы и методы. ИН ДНК оценивали по 200 наблюдений рака легкого микроспектрофотометрическим методом. Подсчет ИП Ki-67 проводили на гистологическом материале иммуногистохимическим методом с использованием антител к Ki-67, Cytokeratin 5/6, TTF-1, Chromogranin A, Synaptophysin, Keratin.Pan, CD56. Результаты. По мере снижения степени дифференцировки опухоли увеличивается ИН ДНК и ИП Ki-67, что служит критериями агрессивного поведения опухоли. Выводы. Корреляционный анализ выявил статистически значимую взаимосвязь между ИН ДНК и ИП Ki-67 (r = 0,987, p < 0,05). Полученные данные могут быть полезны для диагностики и прогнозирования у больных раком легкого.

Ключевые слова

раковые клетки, рак легкого, пролиферативная активность клеток, индекс накопления ДНК, индекс пролиферации Ki-67

Полный текст

Рак легкого представляет собой актуальную проблему в современной онкологии. Вместе со злокачественными новообразованиями трахеи и бронхов он имеет высокий удельный вес в структуре заболеваемости и летальности населения Российской Федерации от онкологической патологии [1].

Обозначенное состояние вопроса требует правильного выбора метода лечения, который напрямую зависит от диагностики и достоверной верификации гистологического типа опухоли. Прямым доказательством этого является выход в свет новой гистологической классификации ВОЗ опухолей легких пятого пересмотра (The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors). В данной классификации произошли существенные изменения, которые связаны с широким спектром накопленных данных, касающихся иммунофенотипа различных опухолей легкого, в том числе, применения молекулярно-генетических методов для выявления генетических мутаций. Авторы классификации подчеркивают необходимость расширения сферы применения иммуногистомического (ИГХ) исследования для установления диагноза при раке легкого [2].

В настоящее время установлено, что рак легкого характеризуется многочисленными генетическими изменениями [3]. Содержание ДНК в ядрах клеток различных гистологических типов опухолей легкого выявляет взаимосвязь между показателями среднего содержания ДНК и степенью дифференцировки новообразования. По мере нарастания степени анаплазии опухоли увеличивается обобщенный индекс накопления ДНК (ИН ДНК – взвешенное среднее арифметическое содержания ДНК на ядро клетки) и число клеток с полиплоидными значениями содержания ДНК в ядрах, что может быть использовано при решении вопросов прогноза [4].

Некоторые исследования показали, что уровень экспрессии белка-индикатора клеточной пролиферативной активности Ki-67 является важным прогностическим фактором при различных видах рака, включая и рак легкого [5, 6]. Ki-67 – это ядерный белок, который экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, за исключением фазы G0 (фазы покоя). Высокий уровень индекса клеточной пролиферации (ИП Ki-67) характеризует агрессивность опухолевого процесса, отрицательно влияя на дальнейший прогноз и выживаемость. Кроме того, недостаточный биопсийный материал может не отразить в полной мере выраженность внутриопухолевой гетерогенности и вызвать ошибки при морфологической диагностике [7].

Опубликованные данные наших предыдущих исследований и последнего десятилетия [6, 7] позволяют считать, что среднее содержание ДНК и уровень экспрессии белка Ki-67 коррелируют с пролиферативной активностью опухолевых клеток, однако, насколько нам известно, ни в одном исследовании не изучалась корреляция между данными показателями в зависимости от фенотипа злокачественных опухолей легкого.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Выявить корреляцию между ИН ДНК и ИП Ki-67 на основании различных вариантов фенотипа клеток злокачественных опухолей легкого в прогностическом аспекте.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе в работе были использованы результаты анализа 200 наблюдений рака легкого в областном онкологическом диспансере г. Волгограда за 10 лет с оценкой данных микроспектрофотометрического исследования содержания ДНК в ядрах клеток злокачественных опухолей легкого определенных гистологических типов.

На втором этапе была проведена морфологическая оценка операционного материала, полученного у пациентов, которые проходили обследование в ГБУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер» в 2017–2018 гг. и не получали специфического лечения. Полученный материал после фиксации в растворе 10%-го нейтрального формалина и проводки по спиртам возрастающей концентрации заливали в парафин. Изготавливали серийные срезы толщиной 4–5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также применяли ИГХ-исследование в случаях умеренно- и низкодифференцированных опухолей, классифицировать которые не удавалось с помощью обзорной рутинной окраски. Для дальнейшего исследования были выбраны случаи эпителиальных опухолей легкого и сформированы следующие группы: 1-я – неороговевающая плоскоклеточная карцинома (n = 12); 2-я – базалоидная плоскоклеточная карцинома (n = 3); 3-я – солидная аденокарцинома (n = 9); 4-я – нейроэндокринная мелкоклеточная карцинома (n = 15). Все группы представлены малыми выборками.

На гистологических срезах, приготовленных из операционного материала, проводили ИГХ-исследование. Использовали моноклональные мышиные антитела к Ki-67 (клон SP 6 в разведении 1 : 100, Thermo Scientific), Cytokeratin 5/6 (клон D5/16B4 в разведении 1 : 50, Thermo Scientific), TTF-1 (клон 8G7G3/1 в разведении 1 : 50, Thermo Scientific), Chromogranin A (клон SP 12 в разведении 1 : 400, «Thermo Scientific), Synaptophysin (клон SP 11 в разведении 1 : 200, Thermo Scientific), Keratin.Pan (клон AE1/AE3 в разведении 1 : 50, Thermo Scientific), CD56 (клон 56C04 в разведении 1 : 200, Thermo Scientific) для подтверждения соответствующего фенотипа клеток опухоли. Демаскировку антигенов проводили в PT MODULE Thermo Scientific c цитратным буфером Hier Buffer L (pН = 6,0) в течение 40 мин для Ki-67, TTF-1, Chromogranin A, Synaptophysin, CD56 с последующим охлаждением до 60 °С и с цитратным буфером Hier Buffer М (pН = 8,0) в течение 40 мин для Cytokeratin 5/6, Keratin.Pan с последующим охлаждением до 60 °С. В качестве системы визуализации использовали UltraVision Quanto Detection System (Thermo Scientific, USA) в аппарате Autostainer 480 S (Thermo Fisher Scientific, United Kingdom) с последующим докрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера и заключением под покровное стекло при помощи автоматизированной системы Leica CV 5030 (Leica Geosystems, Switzerland).

Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали по ИП Ki-67, который представляет собой долю Ki-67-позитивных клеток (%) во всей клеточной популяции опухоли, при подсчете 1000 клеток. Подсчет клеток выполняли при помощи программного комплекса ImageJ для обработки изображений. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью стандартного пакета статистических программ Statistica 10.0 и Microsoft Excel 2010. Результаты представлены в виде средних арифметических значений и ошибки средней величины (M ± m). Корреляционная зависимость оценивалась при помощи коэффициента корреляции Пирсона. Статистические данные считались достоверными при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты микроспектрофотометрического исследования срезов, окрашенных по Фельгену, позволили судить о динамике изменения количества ДНК в ядрах клеток ростковых зон опухолевой ткани. В случаях умереннодифференцированной неороговевающей плоскоклеточной карциномы легкого модальным классом представлены октоплоидные и параоктоплоидные клетки (50,0 %). Сдвиг гистограммы вправо достигает значений 15с. ИН ДНК этой опухоли составляет 6,2 (рис., см. A, B). В случаях низкодифференцированной плоскоклеточной карциномы число клеток с содержанием ДНК выше 8с увеличивается до 55,3 %, причем гетерогенность, полиплоидия, анеуплоидия были более выражены по сравнению с умереннодифференцированной формой плоскоклеточной карциномы. ИН ДНК низкодиференцированной плоскоклеточной карциномы равен 7,3 (рис., см. 2A, 2B).

В случаях низкодифференцированной аденокарциномы легкого наблюдалась более выраженная полиплоидия, сдвиг гистограммы вправо увеличивался до 23с, а ИН ДНК составлял 9,5 (рис., см. 3A, 3B). Наиболее выраженный сдвиг гистограммы вправо наблюдается в случаях недифференцированной мелкоклеточной карциномы и достигает значений 52с. Подавляющее количество опухоли составляли клетки с содержанием ДНК в ядрах выше 8с (64,0 %). ИН ДНК повышается до 10,0 (рис., см. 4A, 4B). Модаль-ные классы в гистограммах не устанавливаются.

Рис. Содержание ДНК в ядрах клеток злокачественных опухолей легкого с различной степенью дифференцировки (микроспектрофотометрическое исследование) и иммуногистохимическая экспрессия фактора клеточной пролиферации Ki-67: 1 – неороговевающая плоскоклеточная карцинома; 2 – базалоидная плоскоклеточная карцинома; 3 – солидная аденокарцинома; 4 – нейроэндокринная мелкоклеточная карцинома. A – ИН ДНК, по оси ординат – количество клеток (%), по оси абсцисс – значения плоидности (с); B – реакция Фельгена, ×400; C – экспрессия Ki-67, иммунопероскидазная реакция с DAB, ×400

По результатам ИГХ-исследования значения ИП Ki-67 в случаях умереннодифференцированной неороговевающей плоскоклеточной карциномы (1-я группа, рис., см. 1C) колебались от 27,7 до 39,5 %, при этом значения ИП Ki-67 <30 % наблюдались в двух случаях, в остальных десяти случаях значения превосходили 30 %, и среднее значение ИП Ki-67 в данной группе составило (33,1 ± 2,11) %. Всего три случая составили группу низкодифференцированной базалоидной плоскоклеточной карциномы (2-я группа, рис., см. 2C). Значения ИП Ki-67 были равными 43,8; 48,4 и 50,6 % соответственно, среднее значение составило (47,6 ± 2,00) %. Кроме того, при отборе в данную группу учитывалась сплошная дольчатая архитектоника опухоли с палисадным расположением клеток на периферии, небольшие размеры клеток, высокая частота митозов.

В данных двух группах иммунофенотип плоскоклеточных карцином был подтвержден по наличию интенсивной экспрессии Cytokeratin 5/6, а также отрицательной окраски на TTF-1, Chromogranin A, Synaptophysin. Наше исследование продемонстрировало, что в 13 случаях плоскоклеточных карцином опухолевые клетки обладали соответствующим иммунофенотипом и высокой степенью клеточной пролиферации: ИП Ki-67 >30 %, что согласуется с литературными данными [8].

Случаи низкодифференцированной солидной аденокарциномы (3-я группа, рис., см. 3С) были подтверждены хорошо выраженной экспрессией фактора транскрипции TTF-1, и отрицательной реакцией с другими антителами первичной дифференциально-диагностической панели: Cytokeratin 5/6, Chromogranin A, Synaptophysin. Солидная аденокарцинома характеризуется высоким уровнем экспрессии Ki-67, в наших наблюдениях значения ИП Ki-67 колебались от 59,8 % до 79,2 %, среднее значение составило (66,03 ± 2,18) %.

Нейроэндокринная мелкоклеточная карцинома (4-я группа, рис., см 4С) является низкодифференцированной опухолью и характеризуется высокой степенью злокачественности с ИП Ki-67 обычно >50 %, высокой митотической активностью, диффузным ростом в виде широких тяжей и пучков клеток [9, 10]. Иммунофенотип опухолей данной группы включал в себя позитивные реакции на Keratin.Pan, CD 56, Chromogranin A, Synaptophysin. Значения ИП Ki-67 колебались от 69,8 до 87,2 %, среднее значение составило (78,57 ± 1,39) %.

Микроспектрофотометрическое исследование содержания ДНК в ядрах клеток опухолей легкого выявило взаимосвязь между показателями среднего содержания ДНК и степенью дифференцировки новообразования. По мере ее снижения увеличивается ИН ДНК и резко изменяется клональный состав опухоли в сторону увеличения числа клеток с полиплоидными значениями содержания ДНК в ядрах. Анализ пролиферативной активности Ki-67 выя- вил аналогичную закономерность: по мере снижения степени дифференцировки опухоли увеличивается ИП Ki-67 с учетом экспрессии соответствующих ИГХ-маркеров дифференциально-диагностических панелей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, оба оцениваемых индекса позволяют разграничить злокачественные образования легкого различной степени дифференцировки и агрессивности. При этом корреляционный анализ демонстрирует статистически значимую сильную взаимосвязь (r = 0,987, p < 0,05) между содержанием ДНК в ядрах и пролиферативной активностью различных типов эпителиальных злокачественных опухолей легкого в зависимости от иммунофенотипических характеристик их клеток. Полученные данные подтверждают целесообразность сравнительного анализа ИН ДНК и ИП Ki-67 в целях диагностики, прогнозирования, а также могут быть учтены при выборе тактики лечения с позиции персонифицированной медицины.