Comparative study of methods for the modernization of mesh prostheses as a matrix for the cultivation of fibroblasts

Ilya S. Ivanov; Иванов Илья Сергеевич; Alexander A. Ushanov; Ушанов Александр Александрович; Ekaterina S. Mishina; Мишина Екатерина Сергеевна; Vladislav A. Plotnikov; Плотников Владислав Александрович; Alexandra R. Bobkova; Бобкова Александра Руслановна; Kirill S. Tolkachev; Толкачев Кирилл Сергеевич

doi:10.19163/1994-9480-2023-20-3-148-152

Сравнительное изучение методов модернизации герниопротезов как матрицы для культивирования фибробластов

Авторы: Иванов И.С.¹, Ушанов А.А.¹, Мишина Е.С.¹, Плотников В.А.¹, Бобкова А.Р.¹, Толкачев К.С.¹
Учреждения:
1. Курский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 20, № 3 (2023)
Страницы: 148-152
Раздел: Оригинальные исследования
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/611042
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2023-20-3-148-152
ID: 611042

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель исследования – провести сравнительное изучение методов модернизации герниопротезов как матрицы для культивирования фибробластов.

Материалы и методы. В условиях эксперимента было выполнено нанесение на поверхность сетчатых герниоэндопротезов вещества поликапролактона по оригинальной методике, предложенной В.В. Берещенко и коллективом соавторов (2019 г.). В качестве объекта изучения был выбран поливинилиденфторидный герниоэндопротез «Унифлекс Cтандартный» (ООО «Линтекс», Санкт-Петербург, Россия). После нанесения полимера выполняли обработку низкотемпературной плазмой с характеристиками: частота – 5 кГц, напряжение импульса – 10 кВ, плотность мощности – 2 Вт/см², время экспозиции – 5 минут. После этого выполнялась стерилизация образцов с помощью рентгеновского излучения с мощностью 150 кВ и экспозицией 3 мин. Нанесение клеток осуществлялось путем внесения образцов в среду DMEM с культурой фибробластов на 5 дней. Полученные образцы изучали при помощи сканирующей электронной микроскопии. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Манна – Уитни в программе Statistica 10 (Dell Software Company, Round Rock, Texas, United States of America).

Результаты. Полученные данные свидетельствуют об успешном прикреплении фибробластов на поверхность модифицированных герниопротезов.

Выводы. Описанный процесс модификации герниопротеза может применяться с целью улучшения его свойств в ходе течения процессов репарации соединительной ткани in vivo.

Ключевые слова

грыжи, герниопротезирование, низкотемпературная плазма, поликапролактон, дермальные аутофибробласты

Полный текст

Проблема вентральных грыж остается одной из самых актуальных в абдоминальной хирургии. Согласно данным литературы, во всей человеческой популяции от данной патологии страдают от 3,9 до 4,5 % [1]. В связи с этим не прекращается поиск как способов профилактики, так и лечения грыж. В наше время «золотым стандартом» лечения грыж передней брюшной стенки является герниоэндопротезирование сетчатым герниопротезом [2]. Однако имплантация синтетических материалов связана с риском развития ряда экссудативных осложнений, например, сером. Кроме того, научное сообщество пришло к выводу, что сама по себе имплантация сетчатого протеза не является единственно достаточным средством лечения, так как эта патология является лишь одни из проявлений дисколлагенозных состояний [3]. В случае же послеоперационных вентральных грыж имеются научные данные о несостоятельности самой соединительной ткани в области дефекта, что также ставит под вопрос полноценность и законченность исключительно хирургического лечения [4]. С этой целью предпринимаются попытки как системного, так и местного улучшения результатов оперативного вмешательства. Одним из примеров такого подхода является усовершенствование самого имплантируемого протеза с помощью модификации его поверхности и применения клеточных технологий [5]. Имплантации клеточного материала при герниопластиках (в том числе фибробластов) базируются на многочисленных научных работах, позволяющих судить как об эффективности такого метода модифицирования оперативного вмешательства, так и о перспективности всего направления в целом. Позитивные данные получены при использовании стромальных клеток, полученных из подкожно-жировой клетчатки, костного мозга, фетальной ткани, эмбрионального материала и некоторых других субстанций [6]. Множество данных получено и при попытках улучшения поверхностных свойств герниопротезов и при обработке их низкотемпературной плазмой. Обработку производили уже улучшенных герниопротезов с помощью нанесения поликапролактона на поверхность имплантов [7, 8]. Поликапролактон является полимером с гидрофобными свойствами, однако фибробласты могут успешно закрепляться на его поверхности, особенно с учетом последующей модификации его поверхности [9].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить способность фибробластов к прикреплению на поверхность покрытого поликапролактоном сетчатого протеза.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнялось на базе лаборатории морфологии и клеточных технологий НИИ Экспериментальной медицины ФГБОУ ВО «Курского государственного медицинского университета» в период с июня по декабрь 2022 года. Объектом исследования выбран сетчатый полимерный эндопротез «Унифлекс стандартный» (поливинилиденфторидная мононить диаметром 0,12 мм, толщина сетки 0,5 мм, поверхностная плотность 0,73 г/м², объемная пористость около 90 %) производства ООО «Линтекс» (Санкт-Петербург, Россия). Во 2-й группе наблюдения в асептических условиях на материал сетки наносился 10%-й раствор поликапролактона в хлороформе согласно методике, описанной В.В. Берещенко и соавторами (2019 г.) [10].

В 3-й группе наблюдения следующим этапом модификации была обработка сеток низкотемпературной плазмой с характеристиками: частота – 5 кГц, напряжение импульса – 10 кВ, плотность мощности – 2 Вт/см², время экспозиции – 5 минут. Так как заданные характеристики не обеспечивают стерильность, выполнялась последующая стерилизация образцов с помощью рентгеновского излучения с мощностью 150 кВ и экспозицией 3 мин.

Во всех группах наблюдения на сетчатый протез наносились дермальные аутофибробласты, выделенные методом теплого трипсина из кожи лабораторного животного. С этой целью образцы помещались в среду DMEM + пенициллин + L-глутамат с культивированными в ней дермальными аутофибробластами в количестве 1,5 × 10⁵ клеток. Период инкубации фибробластов вместе с протезом составлял 5 дней. С целью определения факта прикрепления и количественного подсчета фибробластов на модифицированных герниопротезах выполняли сканирующую электронную микроскопию полученных образцов при помощи сканирующего электронного микроскопа JEOL 6610LV (JEOL, Япония).

Ввиду небольших размеров выборки в экспериментальных группах исследования при выполнении расчетов было принято решение в качестве основной методики определения уровня статистической значимости отличий использовать непараметрический критерий Манна – Уитни. В качестве программной среды использовали программу Statistica 10 (производитель Dell Software Company, Round Rock, Texas, United States of America).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате полученных исследований было выявлено, что после культивирования дермальных аутофибробластов в течение 5 суток происходит их прикрепление к нитям эндопротеза. В группе с использованием герниопротеза «Унифлекс стандартный» на нитях синтетического материала визуализировались единичные клетки округлой или овальной формы. Большая часть клеток прикреплялась ко дну флакона, приобретая характерную распластанную форму с большим количеством отростков (рис. А).

В группе «Унифлекс стандартный» с последующей обработкой поликапролактоном вокруг нитей протеза визуализировались группы фибробластов. Большая часть клеток имели распластанную или вытянутую форму, что свидетельствует о прочности прикрепления к материалу (рис. Б, Д). Важно, что клеточный рост определялся как вокруг мест переплетения, так и между прямыми нитями.

Рис. Микрофотография при электронной микроскопии поверхности сетчатого эндопротеза «Унифлекс стандартный». СЭМ: А – без предварительной обработки протеза (ув. ×200 × 10-6); Б – с обработкой поликапролактоном (ув. ×250 × 10-6); В – с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма (ув. . ×400 × 10-6); Г – с обработкой поликапролактоном (ув. ×500 × 10-6; Д – с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма (ув. ×400 × 10-6)

В группе «Унифлекс стандартный» с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма также определялось прикрепление фибробластов к герниопротезу. При этом клетки преимущественно располагались поодиночке, имели округлую форму и локализовались только на прямых нитях, а в местах плетения отсутствовали (рис. В, Г). С учетом достаточно упорядоченного клеточного «рисунка» можно предположить, что клетки плотно фиксировались в местах насечек, полученных в результате обработки низкотемпературной плазмой. Такой способ обработки синтетического материала подходит для исключительно стерильных условий, так как данные насечки могут служить местом локализации не только клеток соединительной ткани, но и бактерий.

При морфометрии клеток фибробластов, прикрепленных на нитях герниопротеза, было показано достоверное увеличение их количества после обработки поликапролактоном в 3,3 раза и в 3,4 раза с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма по сравнению с группой «Унифлекс стандартный» (табл.).

Количественные показатели прикрепленных на нитях герниопротеза фибробластов

Экспериментальная группа	Количество клеток на поверхности нитей протеза
«Унифлекс Стандартный»	1,5 × 10⁴ ± ١٠٥,٩
«Унифлекс Стандартный» с обработкой поликапролактоном	4,9 × 10⁴± 376,3^*
«Унифлекс Стандартный» с обработкой поликапролактон + низкотемпературная плазма	5,1 × 10⁴± 544,9^*

*p < 0,01 по сравнению с группой «Унифлекс стандартный».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оба способа обработки синтетического материала сетки стимулируют хорошее прикрепление и пролиферацию фибробластов. Однако выбор метода модернизации должен быть определен в зависимости от конкретной хирургической цели и условий оперативного вмешательства.

Капельное нанесение поликапролактона позволяет увеличить потенциальную поверхность колонизации фибробластами поверхности модифицированного импланта. Применение клеточных технологий в комбинации с усовершенствованием поверхности сетки, приводящей к улучшению тканевой реакции на нее, является логичным продолжением развития человеческих знаний в этой области. Обработка плазмой поверхности полимера позволяет нивелировать его гидрофобность и сделать доступной поверхность для клеточной колонизации. Фибробласты обладают способностью к прикреплению к модифицированной с помощью поликапролактона поверхности сетчатого герниопротеза.