Морфофункциональная характеристика печени после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита

Полный текст

Лучевой гепатит развивается как при непосредственном облучении злокачественных новообразований печени, так и органов брюшной полости. Кроме того, радиационно-индуцированная дисфункция печени может развиваться при воздействии радиации на организм человека вследствие техногенных катастроф. Контроль радиоактивности регламентируется множеством документов, однако меры профилактики и лечения острой и хронической лучевой болезни еще нуждаются в уточнении и оптимизации [1, 2].

В некоторых исследованиях продемонстрировано изменение гистоархитектоники печени при использовании Х- или γ-облучения. Воздействие γ-излучения в дозе 30 Гр в 5–10 % случаев приводит к поражению печени, а увеличение дозы до 43 Гр – в 50 % случаев. Эффективной при радиотерапии рака печени считается доза выше 60 Гр, однако она увеличивает риск летальности до 76 % из-за постлучевой печеночной недостаточности. К настоящему времени не существует эффективного лечения лучевого гепатита, который приводит к необратимой печеночной недостаточности и смерти [3]. Однократное Х-облучение уже в дозе 8 Гр приводит к отеку гепатоцитов, множественным геморрагиям и застою синусоидов [3]. В другом исследовании, воздействие однократного общего γ-облучения даже в низкой дозе (4 Гр) вызывало повреждения на клеточном и субклеточном уровнях: разрушение структуры ДНК и митохондрий, приводящее к апоптозу гепатоцитов [4].

Исследования воздействия электронов на печень в современной специализированной литературе единичны, а их результаты, как правило, противоречивы. Необходимо проведение комплексной морфофункциональной оценки изменений паренхимы печени с выявлением степени сенсибилизации гепатоцитов к ИИ вне опухоли, а также при облучении злокачественных новообразований соседних органов. Не менее важной задачей современной радиобиологии является разработка методов профилактики острых и хронических постлучевых осложнений, например, введение протекторов и др.

Известно, что эффекты ионизирующего излучения опосредованы прямым (разрывы и сшивки ДНК) и косвенным (оксидативный стресс) путями [5]. При разработке методов профилактики лучевой болезни точкой приложения протекторных средств являются именно косвенные эффекты: антиоксиданты наиболее выраженно снижают концентрацию свободных радикалов, способных повреждать органы и ткани локально или системно (при распространении в кровотоке) [6]. В качестве препарата, снижающего степень лучевого гепатита и печеночной недостаточности, была выбрана аскорбиновая кислота, обладающая доказанным антиоксидантным свойством [7].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Морфологическая оценка печени после введения аскорбиновой кислоты в модели лучевого гепатита.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n = 40) были поделены на четыре экспериментальные группы:

- I – контрольная (n = 10), которым вводили раствор NaCl 0,9%-й;

- II (n = 10) – фракционное локальное облучение электронами в суммарной облучающей дозе (СОД) 30 Гр;

- III (n = 10) – интраперитонеальное введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг/кг за 1 ч до локального облучения электронами в СОД 30 Гр;

- IV (n = 10) – интраперитонеальное введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг/кг.

Локальное облучение электронами животных проводили на линейном акселераторе NOVAC-11. Живот-ных всех групп (I–IV) выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика через неделю после последней фракции. Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Биохимический анализ сыворотки крови. В крови, полученной от животных, измеряли уровни аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и общего билирубина при помощи биохимического анализатора.

Исследование маркеров оксидативного стресса. Ткани печени (200 мг) гомогенизировали и центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g на ледяной бане для получения 10%-го гомогената. Гомогенат подвергали центрифугированию, производили забор супернатанта для дальнейшего анализа. Уровни малонового диальдегида (MDA) и супероксиддисмутазы (SOD) были анализированы в соответствии с требованиями набора ELISA kit (Lifespan Biosciences, USA).

Гистологическое исследование. Фрагменты печени фиксировали в растворе забуференного формалина, после проводки в автоматическом режиме заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы (толщиной 2 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические микропрепараты изучали под микроскопом Leica DM2000 с микрофотосъемкой. Использовали установленные гистологические критерии для оценки степени повреждения печени в баллах [8] (табл. 1).

Морфометрическое исследование. Морфометриче-ский анализ проводили в 10 случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении ×400 в 5 рандомных срезах с каждого образца с использованием анализатора изображений Leica Application Suite (LAS) Version 4.9.0 и компьютерной программы Image J. При этом рассчитывали следующие параметры: объемную плотность гепатоцитов, средний диаметр гепатоцита (в мкм), средний диаметр центральной вены (в мкм), количество клеток Купфера (в 1 см²).

Полученные в результате подсчета данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнения проводились с использованием дисперсионного анализа. Проведен анализ с использованием теста Крускал – Уоллиса и U-теста Манна – Уитни. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым.

 

Таблица 1

Индекс гистологической активности для оценки фрагментов печени (по Knodell с изм.)

I	Перипортальный ± мостовидный некроз	Балл	II	Дистрофия, атрофия, некроз гепатоцитов	Балл	III	Инфильтрация портальных трактов	Балл	IV	Фиброз	Балл
A	нет	0	A	нет	0	A	нет портального воспаления	0	A	нет	0
B	слабый некроз	1	B	слабая (ацидофильные тельца, баллонная дистрофия, фокальные некрозы гепатоцитов менее чем в 1/3 печеночных долек)	1	B	слабая (распределение воспалительных клеток менее чем в 1/3 портальных трактов)	1	B	перипортальный фиброз	1
C	умеренный некроз менее 50 % окружности портальных трактов	3	C	умеренная (затрагивает от 1/3 до 2/3 печеночных долек)	3	C	умеренная (увеличение количества воспалительных клеток в 1/3–2/3 доле портальных трактов)	3	C	мостовидный фиброз (портально-портальный или портально-центральный)	3
D	значительный некроз более чем 50 % окружности портальных трактов	4	D	выраженная (более 2/3 печеночных долек)	4	D	выраженная (плотная воспалительная инфильтрация более чем в 2/3 портальных трактов)	4	D	цирроз	4
E	умеренный некроз + мостовидный некроз	5
F	значительный некроз + мостовидный некроз	6
G	мультилобулярный некроз	10

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимический анализ крови. Через неделю после воздействия фракционного локального облучения электронами во II группе обнаружено увеличение показателей аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и общего билирубина по сравнению с контрольными значениями. В то же время наблюдали менее выраженное увеличение перечисленных показателей в группе, в которой вводили аскорбиновую кислоту (табл. 2).

 

Таблица 2

Показатели биохимического анализа крови контрольной и опытных групп

Группа	АлАТ, Ед./л	АсАТ, Ед./л	ЩФ, Ед./ л	Билирубин, мкмоль/л
Контроль	30,3 ± 0,9	148,2 ± 3,3	24,6 ± 0,5	6,9 ± 0,3
Облучение	73,4 ± 2,1a	179,3 ± 3,5a	68,3 ± 1,1a	11,1 ± 0,5а
Облучение + АК	44,6 ± 1,3b	167,6 ± 3,4b	42,1 ± 0,8b	8,6 ± 0,4 b
АК	29,4 ± 0,7	143,4 ± 3,3	26,7 ± 0,6	6,8 ± 0,3

 

Примечание: данные представлены в виде средних значений (диапазон), проведены тест Крускал – Уоллиса и U-тест Манн – Уитни. Статистическая достоверные различия по сравнению с контролем в группах Облучение (^а) и Облучение + АК (^b); р <0,05.

Оценка оксидантного статуса. В гомогенате тканей печени после фракционного облучения электронами в дозе 30 Гр обнаружили увеличение уровня малонового диальдегида (MDA) в 2,4 раза и снижение уровня супероксиддисмутазы (SOD) в 2,6 раза по сравнению с контролем. Менее выра- женные изменения MDA и SOD обнаружили в III груп- пе: увеличение MDA в 1,6 раза и уменьшение SOD в 1,4 раза по сравнению со значениями контрольной группы. В IV группе не наблюдали достоверного изменения уровней SOD и MDA по сравнению с контролем (рис. 1).

 

* Статистически достоверные различия по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Рис. 1. Показатели супероксиддисмутазы (SOD) и малонового диальдегида (MDA) в гомогенатах печени контрольной и опытных групп

 

Гистологическое исследование. В контрольной группе отмечали нормальную гистоархитектонику печеночной паренхимы: печеночные балки, радиально отходящие от центральной вены, с гепатоцитами полигональной формы и центрально расположенным крупным ядром. Между печеночными балками расположены единичные клетки Купфера, выстилающие синусоиды. Оценка по шкале HAI составила 0 баллов (рис. 2).

В группе фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр через неделю наблюдали мелкие кисты; баллонную дистрофию большинства гепатоцитов (вакуолизацию цитоплазмы и пикноз ядер), преимущественно в зоне III; фокальную атрофию ¹/₃–²/₃ части печеночных долек; умеренный частичный некроз (менее 50 % окружности большинства портальных трактов); клеточную воспалительную инфильтрацию ¹/₃–²/₃ части портальных трактов (в том числе мононуклеарными клетками); фиброз отсутствовал (по шкале HAI, в среднем, 9 баллов). Кроме того, обнаружили расширение и застой синусоидов, гиперплазия клеток Купфера, перисинусоидальные кровоизлияния, гиперплазию стенки желчных протоков (рис. 2).

 

Контроль	СОД 30 Гр	СОД ٣٠ Гр + АК

 

 

Рис. 2. Печень контрольной и опытных групп. Окрашивание гематоксилином и эозином, ув. × 400

 

Введение аскорбиновой кислоты в III группе привело к менее выраженному повреждению печени в соответствии с морфологическими критериями: фокальную атрофию и вакуолизацию цитоплазмы некоторых гепатоцитов (менее чем в ¹/₃ части печеночных долек), воспалительный инфильтрат занимал менее ¹/₃ части портальных трактов, фиброз отсутствовал (по шкале HAI, в среднем, 4 балла) (рис. 2).

Достоверных различий в морфологической картине IV группы по сравнению с контролем не выявили.

Морфометрическое исследование. При морфометрическом исследовании печени через неделю после фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр обнаружили резкое снижение объемной плотности (уменьшение количества гепатоцитов на единицу объема) и диаметра гепатоцитов, что сопровождалось расширением диаметра центральной вены (в 4,3 раз) и гиперплазией клеток Купфера по сравнению с контрольными значени-ями (табл. 3).

Предлучевое введение аскорбиновой кислоты через неделю после фракционного локального облучения электронами в СОД 30 Гр привело к менее выраженному снижению объемной плотности и диаметра гепатоцитов и незначительному увеличению диаметра центральной вены (в 2,3 раз) и количества клеток Купфера по сравнению с контрольными значениями. В IV группе не обнаружили достоверной разницы в исследуемых морфометрических параметрах по сравнению с контрольной группой (табл. 3).

 

Таблица 3

Морфометрические показатели печени контрольной и опытных групп

Группа	Объемная плотность гепатоцитов	Диаметр гепатоцита, мкм	Диаметр центральной вены, мкм	Количество клеток Купфера, в 1 см2
Контроль	0,794 ± 0,004	1,1 ± 0,04	5,6 ± 0,05	4825,3 ± 9,2
Облучение	0,539 ± 0,002a	2,9 ± 0,05a	24,3 ± 0,6a	7274,2 ± 37,8a
Облучение + АК	0,681 ± 0,003b	1,7 ± 0,04b	12,8 ± 0,3b	5961,9 ± 23,5b
АК	0,789 ± 0,004	1,1±0,03	5,7 ± 0,05	4812,7 ± 14,7

 

Примечание: данные представлены в виде средних значений (диапазон), проведены тест Крускал – Уоллиса и U-тест Манн – Уитни. Статистическая достоверные различия по сравнению с контролем в группах Облучение (^а) и Облучение + АК (^b); р < 0,05.

Настоящая работа посвящена структурно-функциональному исследованию протективного эффекта аскорбиновой кислоты на печень в модели лучевого гепатита, индуцированного фракционным облучением электронами в СОД 30 Гр.

В процессе развития постлучевых поражений выделяют две фазы: воспалительную (раннюю) и фибропластическую (позднюю) [9]. В настоящем исследовании уделено внимание воспалительной фазе, развивающейся после воздействия на печень локального облучения электронами в СОД 30 Гр – лучевому гепатиту. Радиационно-индуцированное повреждение печени было подтверждено в соответствии с общепринятыми гистологическими критериями [8].

Биохимический анализ крови после локального облучения электронами в СОД 30 Гр демонстрировал увеличение концентраций индикаторных (АлАТ, АсАТ) и экскреторных (ЩФ) ферментов печени, а также общего билирубина. Такие изменения свидетельствуют о функциональной несостоятельности печени, вероятно связанной с развитием патологических лабораторных синдромов цитолиза (АлАТ, АсАТ) и холестаза (ЩФ, билирубин) в результате радиационно-индуцированной гибели гепатоцитов. Помимо прямого воздействия электронов на ДНК гепатоцитов, существует косвенный механизм, который заключается в генерации высоких концентраций активных форм кислорода, реактивных форм азота, продуктов перекисного окисления липидов и других свободных радикалов [5]. Это приводит к развитию оксидативного стресса и истощению антиоксидантной системы. Лабораторно это подтверждено интенсификацией перекисного окисления липидов (уровень малонового диальдегида в гомогенате печени) и угнетением антиоксидантной защиты (снижение концентрации одного из наиболее важных ферментов – супероксиддисмутазы). Аналогичные, однако более выраженные, результаты были получены другими авторами при использовании γ-излучения [10]. Кроме того, не исключено влияние ионизирующего излучения на сосуды с развитием вторичного ишемического повреждения печени.

Так, принимая во внимание отсутствие эффективных методов защиты ДНК от прямого воздействия ионизирующего излучения, большинство исследований направлено на разработку методов профилактики и лечения косвенного радиационно-индуцированного повреждения органов. В этом контексте используются протекторные препараты, наиболее известными из которых являются антиоксиданты, например, аскорбиновая кислота.

Предлучевое введение аскорбиновой кислоты способствует снижению генерации токсичных свободных радикалов (относительно низкие уровни MDA) и предотвращает развитие оксидативного стресса, поддерживая состоятельность антиоксидантной системы (уровень SOD практически приближался к контрольным значениям). Это привело к уменьшению степени постлучевого повреждения печени и замедлению гибели гепатоцитов, что подтверждено результатами морфологического, морфометрического и биохимического исследований, позволяя говорить о возможном протективном действии аскорбиновой кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам морфофункционального исследования печени выявили, что локальное облучение электронами в СОД 30 Гр через неделю приводит к нарушению гистоархитектоники с развитием лучевого гепатита. Введение аскорбиновой кислоты снижает глубину и диапазон радиационно-индуцированного повреждения, усиливает эффективность антиоксидантной защиты.

Об авторах

Григорий Александрович Демяшкин

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); Национальный медицинский исследовательский центр радиологии

Email: dr.dga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8447-2600

доктор медицинских наук, заведующий лабораторией гистологии и иммуногистохимии; заведующий отделом патоморфологии

Россия, Москва; Обнинск

Владислав Андреевич Якименко

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: Yavladislav87@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2308-6313

врач анестезиолог-реаниматолог, аспирант 

Россия, Москва

Матвей Анатольевич Вадюхин

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: vma20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6235-1020

студент института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского 

Россия, Москва

Алина Алихановна Китиева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Email: kitievalina@gmail.com
ORCID iD: 0009-0008-7422-4855

студент института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского 

Россия, Москва

Наталья Васильевна Васильева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: Vaasilevaan@ya.ru
ORCID iD: 0009-0000-3536-1496

студент института клинической медицины им. Н.В. Склифосовского 

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы