Синтез новых гетероциклических производных (бензодиоксан-2-ил)метанола и их влияние на внутриглазное давление крыс

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Глаукома в настоящее время является одной из ведущих причин необратимой слепоты в мире. Количество больных глаукомой даже по самым оптимистичным прогнозам будет непрерывно расти [1]. И также четко прослеживается тенденция к увеличению числа инвалидов по зрению вследствие глаукомы [2]. Несмотря на определенные успехи в изучении патогенеза и разработке терапии заболевания, снижение ВГД является первоочередной задачей терапии глаукомы [3]. Ранняя и успешная гипотензивная терапия существенно снижает опасность перехода офтальмогипертензии в развитую стадию глаукомы. В терапии глаукомы используется широкий арсенал препаратов с различным механизмом действия, однако местные и системные побочные реакции на антиглаукомные препараты доставляют пациенту больше беспокойств, чем сами симптомы заболевания, поэтому поиск новых противоглаукомных веществ является значимым и актуальным. Известно, что аналоги мелатонина, его изостеры (индолы, оксиндолы, бензимидазолы, хиноксалины, хиназолины, пиразолы и т.д.) имеют сродство к мелатониновым рецепторам и являются перспективными для поиска среди них соединений, способных снижать ВГД.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Синтез новых соединений, изостеров мелатонина, и изучение их способности снижать внутриглазное давление.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Смесь исходного (бензодиоксан-2-ил)метанола (1), п-толуолсульфохлорида и пиридина при молярном соотношении 1,00 : 1,05 : 2,00 перемешивали в среде хлороформа при температуре 0-5 ^оС в течение 24 ч, реакционную массу последовательно промывали водой, 5%-й хлористоводородной кислотой, 2%-м раствором натрия карбоната, водой, упаривали в вакууме и получали п-толуолсульфонат (бензодиоксан-2-ил)метанола (2) с выходом, близким к количественному.

Смесь исходного (бензодиоксан-2-ил)метанола (1), бромуксусной кислоты и п-толуолсульфокислоты при молярном соотношении 1,00 : 1,10 : 0,05 кипятили в толуоле с азеотропной отгонкой воды в течение 4 ч, охлаждали, избыток бромуксусной кислоты отмывали 5%-м раствором натрия гидроксида, упаривали в вакууме, остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле и получали (бензодиоксан-2-ил)метиловый эфир бромуксусной кислоты (3) с выходом 92 %.

Соответствующее азотсодержащее соединение (Het-H), алкилирующий агент (2) или (3) и тонко измельченный безводный калия карбонат при молярном соотношении 1,00 : 1,10 : 3,00 перемешивали в безводном ДМФА в течение 48 ч при комнатной температуре, фильтровали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток промывали водой, высушивали в вакууме и кристаллизовали из подходящего растворителя. Целевые соединения (4) – (15) были получены с выходом 56–81 %, а соединения (16) – (22) с выходом 66–87 %.

Структура синтезированных соединений доказана методом ЯМР ¹Н- и ¹³С-спектроскопии, чистота и индивидуальность – хроматографическими методами.

Животные. Все процедуры с животными в исследовании проводились в соответствии с общепринятыми этическими нормами манипуляций с животными. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», а также отвечали директивам 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» IRB 00005839 IORG 0004900, OHRP, Свидетельство № 2021/056 от 15.06.2021. Все разделы этого исследования соответствуют Руководящим принципам ARRIVE по отчетности об исследованиях на животных [4]. Животные содержались в условиях вивария ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России при температуре 24 °С и относительной влажности 60 % при естественном световом цикле со свободным доступом к корму и воде.

Влияние соединений на внутриглазное давление у крыс. Изучение влияния соединений на уровень ВГД проводили на взрослых беспородных интактных крысах методом тонометрии с использованием прибора TonoVet (Финляндия) [5]. Исследование соединений производили по методике Marcus и соавт. [6], согласно которой в правый (тестируемый) глаз лабораторного животного закапывали одну каплю раствора исследуемого соединения, а в левый глаз растворитель – деионизированную воду. ВГД измеряли на обоих глазах. Левый глаз, в свою очередь, служил для оценки возможного системного воздействия исследуемых соединений.

Исследуемые производные (бензодиоксан-2-ил)метанола – в концентрации 0,4 % однократно в объеме 50 мкл. Измерение ВГД проводили в шести временных точках (0, 0,5, 1, 2, 3 ч), где 0 ч – исходное значение. Наличие ВГД-снижающей активности оценивали по максимальному уменьшению ВГД от исходных значений. В качестве препаратов сравнения использовали мелатонин (SigmaAldrich, США), применяемый в клинической практике с доказанным ВГД снижающим действием.

Цитотоксичность соединений. На подготовительном этапе выделяли нормальные фибробласты кожи крысы (RDF – rat dermal fibroblasts). Из кожного лоскута животного формировали эксплантаты, размером 2 × 2 мм, которые после трипсинизации и отделения верхних слоев эпидермиса помещались на чашку Петри для инициации миграции и роста клеток в полную ростовую среду DMEM (DMEM 90 % с содержанием глюкозы 4,5 г/л, эмбриональной бычьей сыворотки 10 %, с добавлением L-глутамина 0,002 М, пеницилина и стрептомицина 50000 ED, пирувата натрия 1 %, незаменимых аминокислот 1 %). Культивацию проводили в СО₂-инкубаторе при температуре 37 ̊С в атмосфере 5 % СО₂. После выхода фибробластов эксплантаты удалялись, пассирование проводилось 2 раза в неделю. Для промывания клеток использовали стандартный фосфатный буферный раствор (PBS), для снятия монослоя использовали раствор трипсина-ЭДТА 0,25 %.

Исследование проводили с применением МТТ-теста в модификации, описанной ранее [7]. Выделенные фибробласты кожи крысы (пассажи 3 и 4) использовали в качестве тест-системы. В лунки планшета с учетом краевого эффекта засеивали по 10 000 клеток, период адаптации клеток и инкубации веществ составлял 24 и 48 ч соответственно. Вещества изучали в широком диапазоне концентраций 3 до 300 мкмоль/л, в триплетах троекратно. О цитотоксическом действии судили по способности клеток к стандартной реакции конверсии МТТ-реагента в формазан, после его солюбилизации и оптической детекции при 555 нм (планшетный ридер CLARIOstar, BMG LABTECH, США).

Анализ и обработку полученных данных проводили с расчетом показателя процента выживаемости клеток относительно контроля в каждой изученной концентрации.

Статистическая обработка. Статистическую обработку проводили в Prism 8.0 (GraphPad Inc.) с расчетом среднего арифметического и стандартного отклонения. При сравнении групп использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. Величины полуэффективных концентраций определяли с помощью нелинейной 3-параметрической регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами был проведен виртуальный и экспериментальный скрининг соединений разнообразной структуры, обладающих аффинностью к рецепторам мелатонина. На основании проведенного прогноза и по сходству с выбранными соединениями был осуществлен синтез новых соединений – изостеров мелатонина, имеющих 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксиновый цикл, соединенный линкером различного химического строения и длины с азотсодержащим гетероциклическим ядром, с ожидаемой снижающей активностью ВГД (табл.). Синтез новых гетероциклических производных (бензодиоксан-2-ил)метанола представлен на рисунке.

Предложенные соединения отличаются фармакофорным сходством (коэффициент Танимото до 0,82) к соединениям, выбранным в результате прогноза

 

Рис. Синтез новых гетероциклических производных (бензодиоксан-2-ил)метанола

 

Химическое строение и фармакологические свойства новых гетероциклических производных (бензодиоксан-2-ил)метанола

 

 

 

 

Офтальмогипотензивную активность исследуемых соединений и препарата сравнения изучали методом тонометрии на белых беспородных интактных крысах. Животные были разделены на опытные группы, которым в правый (тестовый) глаз инстиллировали исследуемые соединения, и группу препаратов сравнения, которым в тестовый глаз инстиллировали мелатонин и тималол. Левый (контрольный, коллатеральный) глаз служил для оценки возможного резорбтивного действия исследуемых соединений.

При изучении влияния синтезированных изостеров мелатонина на ВГД было выявлено, что все синтезированные производные (бензодиоксан-2-ил)метанола по снижающей активности ВГД уступают мелатонину. При этом в большей степени снижали уровень ВГД соединения, содержащие в своей структуре бензимидазольную и пуринергическую гетероциклическую системы. Наименьшую активность проявили соединения, имеющие в своей структуре хинозолиновую гетероциклическую систему. Из 19 соединений наиболее эффективно снижало ВГД, на 26,6 %, соединение VMA 22-37, превосходя по своей активности тимолол и практически не уступая мелатонину. Так, тимолол снижал ВГД уже через 30 мин после введения на 24,4 %, мелатонин при инстилляции снижал офтальмотонус на 33,3 %.

Влияние исследуемых соединений на ВГД коллатерального глаза исследовали с целью выявления системного действия при попадании в кровоток и в дальнейшем прогнозирования возможных побочных эффектов. Как видно из представленных данных, соединение VMA 22-37 не вызывает изменения ВГД коллатерального глаза, в отличие от препарата сравнения тимолола, а значит, возможно, не проявляет резорбтивный эффект.

С целью предварительной оценки токсикологических характеристик наиболее активного соединения были изучены его цитотоксические свойства в сравнении с тимололом и мелатонином. Было установлено, что для вещества VMA-22-37 не характерно наличие выраженного цитотоксического действия в изученном диапазоне концентраций 3–300 мкмоль/л. При этом величина условной гибели клеток в максимальной исследованной концентрации не превышала (35,2 ± 1,1) %, что не позволило рассчитать среднюю цитостатическую концентрацию. Аналогичные данные были получены и для препаратов сравнения тималола и мелатонина.

Полученные результаты могут предварительно свидетельствовать о потенциально низком токсическом действии соединения VMA-22-37 и позиционировать его как перспективное для дальнейших углубленных исследований .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, исследованные производные (бензодиоксан-2-ил)метанола, которые являются биоизостерами мелатонина, проявили себя как перспективный класс для поиска соединений, способных снижать ВГД. Соединение VMA 22-37 проявило высокую офтальмогипотензивную активность, превосходящую препарат сравнения тимолол, и не уступило мелатонину. Кроме того, было выявлено, что соединение VMA 22-37 обладает потенциально низкой токсичностью. Все это свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения его возможных антиглаукомных свойств, а также детализации механизма действия в отношении внутриглазного давления.

Финансирование. Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда и Администрации Волгоградской области, проект 22-15-20025.

Funding. The research was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation and the Administration of the Volgograd Region, project 22-15-20025.

 

Об авторах

Александр Александрович Озеров

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Автор, ответственный за переписку.
Email: Prof.ozerov@yahoo.com

заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Волгоград; Волгоград

Людмила Владимировна Науменко

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: milanaumenko@mail.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия, Волгоград

Алена Сергеевна Таран

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: taran-a.s@yandex.ru

доцент кафедры фармакологии и биоинформатики, младший научный сотрудник

Россия, Волгоград; Волгоград

Дмитрий Сергеевич Яковлев

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: dypharm@list.ru

профессор кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия, Волгоград; Волгоград

Алина Михайловна Чебанько

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: alina.chebanko@yandex.ru

аспирант кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия, Волгоград

Мария Сергеевна Пшеничникова

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: mariyaseryogina179802@mail.ru

старший лаборант кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия, Волгоград; Волгоград

Надежда Манджиевна Щербакова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: scherbakovanm@yandex.ru

доцент кафедры фармакологии и биоинформатики, кандидат медицинских наук

Россия, Волгоград

Галина Николаевна Солодунова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: gn_solodunova@mail.ru

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Волгоград

Дарья Владимировна Мережкина

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: merezhkinad@mail.ru

аспирант кафедры фармацевтической и токсикологической химии

Россия, Волгоград

Alexander Алексеевич Спасов

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: aspasov@mail.ru

заведующий кафедрой фармакологии и биоинформатики

Россия, Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы