Comparative analysis of biogenic amines in the brain of  Danio rerio  (Zebrafish) and in various structures of the rat brain

Elena S. Rudaskova; Рудаскова Елена Станиславовна; Bogdan V. Kozlovski; Козловский Богдан Вадимович; Olga Yu. Mukha; Муха Ольга Юрьевна; Lyudmila I. Lashhenova; Лащенова Людмила Ивановна; Tatiana P. Kokoreva; Кокорева Татьяна Павловна; Yulia K. Isaeva; Исаева Юлия Константиновна; Ilya D. Chirkasov; Чиркасов Илья Дмитриевич

doi:10.19163/1994-9480-2025-22-3-29-36

Сравнительный анализ содержания биогенных аминов в мозге Danio rerio (Zebrafish) и в различных структурах мозга крыс

Авторы: Рудаскова Е.С.¹, Козловский Б.В.¹, Муха О.Ю.¹, Лащенова Л.И.¹, Кокорева Т.П.¹, Исаева Ю.К.¹, Чиркасов И.Д.¹
Учреждения:
1. Волгоградский государственный медицинский университет
Выпуск: Том 22, № 3 (2025)
Страницы: 29-36
Раздел: Оригинальные исследования
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/692208
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2025-22-3-29-36
ID: 692208

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Определение биогенных аминов в биологических материалах животных необходимо при оценке эффектов и механизмов действия новых психотропных препаратов. Наиболее популярным методом для решения фармакодинамических задач является определение биогенных аминов и их метаболитов в различных структурах головного мозга белых беспородных крыс. В мозговых структурах Danio rerio (Zebrafish) биогенные амины и их метаболиты так же хорошо определяются, как и в различных структурах мозга крыс, поэтому данную модель можно использовать для проведения исследования различных поведенческих реакций, для моделирования стресса новизны и экспериментальной депрессии.

Ключевые слова

биогенные амины, Danio rerio (Zebrafish), модельный объект, метод количественного определения, фармакокинетика, высокоэффективная жидкостная хроматография

Полный текст

Моноаминергические системы мозга играют ключевую роль в регуляции широкого спектра физиологических и поведенческих функций [1, 2]. Нарушения передачи сигналов в рамках этих систем ассоциируются с различными неврологическими и психиатрическими расстройствами, включая депрессию, шизофрению и болезнь Паркинсона [3, 4, 5, 6]. Количественное определение моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга является ценным инструментом для понимания механизмов патологических состояний, разработки новых терапевтических стратегий, а также для оценки фармакологического действия психотропных препаратов.

Особый интерес представляет изучение региональных особенностей распределения биогенных аминов в отделах центральной нервной системы, таких как мозжечок, гиппокамп, медиальная префронтальная кора (мПФК), полосатое тело и другие подкорковые структуры. Эти области характеризуются специфическими паттернами моноаминергической иннервации и дифференциальной экспрессией транспортеров и рецепторов, что определяет их уникальную роль в регуляции когнитивных, эмоциональных и двигательных функций [7, 8]. Изменения содержания моноаминов в этих структурах могут отражать как физиологические адаптивные процессы, так и патологические состояния нервной системы.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектированием является высокоспецифичным методом анализа катехоламинов (норадреналин, дофамин), индоламинов (серотонин) и их основных метаболитов в биологических образцах [9]. Этот метод основан на способности моноаминов к флуоресценции после их химической дериватизации, что обеспечивает высокую селективность и чувствительность при анализе микрообъемов ткани мозга. Полученные данные открывают новые возможности для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе нервных дисфункций, и создают фундамент для дальнейших разработок в области диагностики и терапии.

В доклинических исследованиях лекарственных препаратов в последние годы достаточно широко применяется модельный объект Danio rerio (Zebrafish). Danio rerio (Zebrafish) – маленькая пресноводная тропическая рыбка, населяющая преимущественно реки и ручьи Пакистана, Индии, Бангладеша, Непала, Мьянмы и Бутана.

В настоящее время достоверно известно, что тропические рыбки Danio rerio (Zebrafish) имеют ряд преимуществ по сравнению с различными представителями данного класса и даже другими лабораторными животными, в частности грызунами. Это связано с морфологическими, физиологическими, биохимическими, генетическими и эмбриологическими особенностями тропических рыбок, а также экономическими выгодами и небольшими временными затратами на их разведение [4].

Главными достоинствами этой рыбки является наличие прозрачного эмбриона, который позволяет в полной мере наблюдать стадии эмбриогенеза, изучать тератогенное, канцерогенное и другие влияния различных химических и лекарственных веществ на Danio rerio. Помимо этого, Zebrafish обладает высокой плодовитостью и быстрым периодом созревания эмбрионов. Через 3 дня после оплодотворения у него начинает функционировать сердце, кровеносная и нервная системы. На четвертые сутки происходит формирование малька, способного к самостоятельному питанию и движению. Эта особенность позволяет ускорить процесс исследования и минимизировать затраты в виде средств и времени [1, 4].

Также стоит отметить, что на настоящее время проведено детальное изучение генома Danio rerio. Отмечается, что у Zebrafish имеется 70 % гомологии с геномом человека, что позволяет их использовать как прекрасную модель для генетических исследований [1].

Сходные биохимические процессы с млекопитающими вновь подтверждают целесообразность использования Danio rerio как модели доклинических исследований.

Большой интерес представляет использование Zebrafish в качестве опытной модели для постановки поведенческих реакций, стресса новизны и экспериментальной депрессии с последующим воздействием препаратов разных фармакологических групп [1, 2, 3].

В связи с этим можно считать, что использование модели Danio rerio в различных направлениях доклинических исследований – токсикологических, фармакологических, эмбриологических и др., достаточно перспективно и данная модель может использоваться в тестировании фармакологических препаратов прежде, чем они будут исследоваться на других моделях, в частности млекопитающих [1, 2, 4].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Сравнение базальных концентраций биогенных аминов в мозговых структурах крыс и Danio rerio (Zebrahish).

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводилось на 8 белых беспородных крысах-самцах (возраст 5–6 месяцев, масса тела 220–260 г) и 10 тропических рыбках Danio rerio (Zebrafish). Крысы выведены в условиях вивария Научного центра инновационных лекарственных средств ВолгГМУ. Животные содержались в стандартных условиях с 12-часовым световым режимом и свободным доступом к пище и воде. Рыбы Danio rerio были получены из коммерческого источника (ИП Парусов, Волгоград, Россия) и в течение 14 дней акклиматизировались в лаборатории. Тропические рыбки содержались в аквариуме объемом 25 л, режим свет/темнота – 12/12 ч, температура воды – 25–26 °С, кормление 2 раза в день хлопьевидным кормом Tetra Water Mix.

Все процедуры проводились в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза, и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом Волгоградского государственного медицинского университета (справка № 2024/221 от 03.04.2024).

Эвтаназию крыс проводили методом цервикальной дислокации, после чего извлекали мозг и помещали на охлажденную стеклянную пластину, расположенную на льду, для предотвращения постмортальных изменений. Для выделения мозжечка (1-я проба) мозг первоначально располагали дорсальной стороной вниз, поднимали продолговатый мозг и мост, удаляли белое вещество, после чего переворачивали мозг дорсальной стороной вверх. Мозжечок отделяли от нижнего двухолмия, удаляя оставшиеся части моста. Гиппокамп (2-я проба) выделяли, раздвигая полушария мозга, начиная с каудального края, чтобы обнажить мозолистое тело. Под ним идентифицировали гиппокамп как изогнутую серовато-прозрачную структуру медиальной части полушарий, которую аккуратно отделяли от прилегающей коры. Для выделения мПФК (3-я проба) сначала выполняли отсечение обонятельных луковиц. Затем из первого коронарного среза, выполненного на уровне переднего форцепса мозолистого тела, выделяли медиальную префронтальную кору, которая идентифицировалась как темная область между мозолистым телом и более светлыми участками окружающей коры. Ее извлекали в форме ромба, исключая материал переднего форцепса мозолистого тела. Полосатое тело (4-я проба) извлекали из следующих коронарных срезов.

На первом срезе вентральный полосатое тело определяли как темную структуру под мозолистым телом, окруженную более светлой корой и передним форцепсом мозолистого тела. На втором срезе различали как вентральное, так и дорсальное полосатое тело, которые имели темную окраску, выделяющуюся на фоне окружающих тканей. На третьем срезе дорсальное полосатое тело выделяли, ориентируясь на его границы с мозолистым телом, капсулой и перегородкой. Глубокие структуры мозга, включая таламус, гипоталамус и средний мозг, выделяли из центральных областей вентральной поверхности, ориентируясь на их расположение относительно стриатума и мозолистого тела (5-я проба).

Эвтаназию Danio rerio проводили путем погружения в ледяную воду (+1–2 °C) на 15–20 с [5]. Далее рыбку фиксировали на льду с помощью пинцета, маленькими ножницами производили отсечение головной части на уровне грудных плавников, затем извлекали череп. Головной мозг извлекали препаровальной иглой и пинцетом после надреза черепа с вентральной стороны.

Для анализа подготавливали 20%-е гомогенаты мозговых структур в растворе 0,1 Н HClO₄, используя гомогенизатор Silent Crusher (Германия). Определение концентрации биогенных аминов и их метаболитов осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографической системе с флуоресцентным детектором Shimadzu (Япония), настроенной на длину волны экстинкции 280 нм и длину волны эмиссии 320 нм. Анализ проводился с использованием колонки Supelcosil LC-18 (5 мкм; 100 мм × 4,6 мм). В качестве подвижной фазы применяли смесь, состоящую из 5%-го ацетонитрила для ВЭЖХ (УФ 210 нм) (Россия) и 95%-го буферного раствора, содержащего 50 мМ однозамещенного фосфата калия с рН 3,0. Для калибровки использовали стандарты норадреналина (Sigma, США), допамина (Sigma, США), серотонина (Sigma, США) и его метаболита – 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК, Sigma, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Валидация метода количественного определения проводилась путем построения калибровочных графиков уравнения прямой по трем дням исследования для каждого из водных растворов стандарта (рис. 1–4). Водные растворы стандартов объединялись в одну пробу с близкими концентрациями. Для каждой из концентраций анализировалось по 5 параллельных разведений.

Рис. 1. Зависимость площади пика от концентрации норадреналина

Рис. 2. Зависимость площади пика от концентрации серотонина

Рис. 3. Зависимость площади пика от концентрации ГИУ

Рис. 4. Зависимость площади пика от концентрации допамина

Коэффициент достоверности аппроксимации близок к единице. Колебания концентраций находились в допустимом пределе ошибки измерения (прецизионность составляет не более 15 %). Внутридневные и междневные колебания также не превышали допустимых значений (рис. 5).

Рис. 5. Хроматограммы водных растворов стандартов допамина, норадреналина, серотонина и ГИУ в концентрациях от 10 до 100 нг/мл (наложение хроматограмм)

Были получены хроматограммы биологического фона проб различных отделов мозга крыс (рис. 6–10) и мозговых структур Danio rerio (рис. 11), в которых определялись искомые моноамины.

Рис. 6. Хроматограмма биологического фона мозжечка крыс

Рис. 7. Хроматограмма биологического фона гиппокампа крыс

Рис. 8. Хроматограмма биологического фона префронтальной коры головного мозга крыс

Рис. 9. Хроматограмма биологического фона стриатума крыс

Рис. 10. Хроматограмма биологического фона таламуса крыс

Рис. 11. Хроматограмма биологического фона мозговых структур рыб Danio rerio (Zebrafish)

В силу того, что головной мозг рыб Danio rerio имеет слишком малый размер для получения пробы с адекватным объемом, все полученные мозговые структуры рыб были объединены в одну пробу. В результате была получена единая хроматограмма для головного мозга всех Danio rerio (рис. 11).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в фоновых пробах мозговых структур крыс пики искомых биогенных аминов определяются хорошо в диапазоне от 10 до 100 нг/мл. Следовательно, поведенческие модели, основанные на функционировании моноаминергической системы мозга, на данном виде лабораторных животных более чем оправданы. Но стоит отметить, что проведение поведенческих тестов на крысах является более трудоемким процессом по сравнению в таковыми для Danio rerio.

В свою очередь, несмотря на то, что пики биогенных аминов на хроматограмме головного мозга Danio rerio (Zebrafish) заметно ниже таковых в пробах структур мозга крыс, они в 3–5 раз превосходят по высоте колебания нулевой линии, что позволяет их идентифицировать. Учитывая относительную простоту организации тестов, данную модель можно использовать для проведения исследования различных поведенческих реакций, для моделирования стресса новизны и экспериментальной депрессии при проведении доклинических испытаний новых лекарственных средств.