STUDY OF TOXIC PROPERTIES OF MAGNESIUM L-ASPARTATE AND PYRIDOXINE FOLLOWING A SINGLE INTRAGASTRIC DOSE TO MICE AND RATS

全文:

Важнейшее физиологическое значение магния определяется его ролью в жизнедеятельности организма. Являясь одним из наиболее распространенных катионов внутри клетки, магний играет роль кофактора множества ферментов и участвует практически во всех видах обмена веществ (Seelig M. S., 1980 [20]; Gunther T., 1993 [15]; Altura B. M., 1994 [12]; Спасов А. А. с соавт, 2000 [8]; Maier J. A., 2004 [18]; Скальный А. В., 2004 [7]; Rayssiguier Y., 2005 [19]; Kimura M., 2007 [16]; Durlach J., 2007 [13]). Магний поступает в организм с водой и пищей, а также в составе фармакологических средств, что используется в основном для восполнения недостаточности этого элемента. В клинической практике применяется относительно небольшое число препаратов магния. В частности, отечественный препарат магния сульфат широко используется в акушерской и гинекологической практике, а также кардиологии, реаниматологии, гастроэнтерологии. Препарат применяется преимущественно в лекарственной форме для парентерального введения [1, 2, 11]. В высоких дозах под действием сульфата магния наблюдаются эффекты депривации ЦНС, гипохлоремический алкалоз [20]. Другой отечественный препарат-магния оксид - обладает низкой биодоступностью и используется перорально в качестве антацидного средства [14, 17]. Препараты органических солей магния: магния оротат, магния лактат, магния аспарагинат - также применяются перорально по различным показаниям (заболевания сердца, дислипидемии, судороги, депрессия), обладают умеренной биодоступностью, но при этом возможно их синергичное применение в сочетании с веществами, повышающими биодоступность магния, например, с пиридоксином (витамином В6). Комбинированная форма соли магния с пиридоксином зарубежного производства - препарат «МагнеВ6» - разрешена для применения в России. Вместе с тем высокая стоимость препарата ограничивает широкое его использование в клинической практике, что послужило предпосылкой к поиску отечественного аналога. В этом отношении представляют интерес совместные научные разработки химиков-синтетиков ЗАО «Биоамид» (г Саратов) и фармакологов ВолгГМУ. По результатам данных работ было выявлено высокоактивное вещество - магния L-аспарагинат в комбинации с пиридоксином, Выпуск 2 (54). 2015 105 ІШторСз [ЩсміПГКЩ обладающее хорошей биодоступностью [9, 10]. В настоящее время проводятся доклинические токсикологические исследования данного вещества, с целью оценки его безопасности и перспективности внедрения в клиническую практику. В этой связи в настоящей работе сочли целесообразным исследовать токсические свойства данной комбинации при однократном пероральном введении лабораторным животным. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение острой токсичности и определение ЛД_0 субстанции магния L-аспарагинат в комбинации с пири-доксином при однократном внутрижелудочном введении мышам и крысам. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на половозрелых лабораторных животных обоего пола: 120 белых мышах массой 18-22 г и 100 белых крысах массой 190-230 г, полученных из питомника государственного предприятия НИИ гигиены токсикологии и профпатологии МЗ РФ г Волгограда. Эксперименты проводились согласно методическим рекомендациям по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [3, 4]. При проведении экспериментов учитывались «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р-53434-2009) и правила, принятые Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). До начала эксперимента животные в течение двух недель находились на карантине, а в последующем распределялись по группам для проведения исследований. В каждую группу входило не менее 5 особей самок и самцов. Субстанцию магния L-аспарагината с пиридокси-ном растворяли в дистиллированной воде на магнитной мешалке с подогревом и вводили опытным группам животных атравматическим металлическим зондом в возрастающих дозах: мышам-5000; 7500; 10000; 12500 и 15000 мг/кг, крысам - 2000; 4000; 6000 и 8000 мг/кг. Были сформированы также контрольные группы самцов и самок мышей и крыс, которым интрагастрально вводили дистиллированную воду в объеме 20 мл/кг (эквивалентно объему, использованному для растворения вещества, вводимого опытным группам). После введения испытуемой субстанции мышей и крыс по одной особи помещали на 24 часа в изолированные плексигласовые домики для наблюдений /150 X 250 X 150 мм/. В первые восемь часов от момента введения субстанции наблюдения за животными вели непрерывно, в дальнейшем - периодически; при этом животные были лишены пищи и воды и изолированы от внешних раздражителей. В последующий 2-недельный период наблюдения за животными проводились 2 раза в день. На вторые сутки выживших животных объединяли по группам и разме щали в стандартные пластиковые клетки, предназначенные для мышей и крыс (самцов и самок раздельно), со свободным доступом к воде и пище. В период наблюдений отмечали наличие гибели животных в группах, а также оценивали общее состояние (шерстный покров, слизистые оболочки, масса тела), поведенческие и нервно-мышечные (судороги, тремор, подергивания, изменение положения тела и конечностей, рефлекторный ответ на звуковые, тактильные и болевые раздражители) и вегетативные реакции (зрачковый рефлекс, цвет кожи, наличие ури-наций, дефекаций, саливаций). Пищевая и питьевая активность оценивалась визуально. Массу тела у животных измеряли в 1 день эксперимента, на 7 и 14 дни. По количеству погибших и выживших особей были рассчитаны границы ЛД_0 исследуемой субстанции с применением метода Литчфилда и Уилкок-сона [3, 4]. Статистический анализ динамики массы тела у животных выполняли с использованием t-критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По результатам исследований на мышах были отмечены характерные признаки клиники отравления субстанцией магния L-аспарагината с пиридоксином и последующей реабилитации. У животных, получавших токсические дозы субстанции, наблюдалось угнетение подвижности, прогрессирующая седация, повышение частоты актов дефекации, снижение реакций на звуковые, тактильные и болевые раздражители, боковое положение. Продолжительность указанных эффектов и их выраженность зависела от дозы субстанции, введенной мышам. Так, после введения субстанции в дозах от 5000 до 7500 мг/кг признаки угнетения подвижности и развитие седации у мышей фиксировались в интервале от 5 до 10 мин после ин-трагастрального введения исследуемой субстанции и наблюдались в течение последующих 60-120 мин. Гибель части особей отмечалась в интервале 90-120 мин наблюдений (табл. 1). Признаки реабилитации у оставшихся в живых особей наблюдались еще в течение последующих двух часов. Наблюдения за выжившими животными в течение последующих двух недель не позволили зафиксировать значимых различий в состоянии животных в опытных и контрольных группах. Отдаленной гибели у этих животных не отмечалось. Общее состояние опытных животных, пищевая и питьевая активности визуально также не различались с данными показателями в контрольной группе. После введения мышам субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином в дозах 10000 мг/кг и выше развитие вышеуказанных симптомов наблюдалось в течение 5 мин. Продолжительность эффектов составляла 60-120 мин с момента введения. Отмечалось резкое снижение подвижности, седация, боковое положение, угнетение дыхания, болевой и 106 Выпуск 2 (54). 2015 тактильной чувствительности, бледность кожных покровов, редкие тонические судороги. Гибель мышей фиксировалась в течение первого часа наблюдений. У оставшихся в живых мышей восстановление подвижности, чувствительности, дыхания отмечалась в течение последующих 2-3 часов. По окончании первых суток наблюдения состояние этих животных практически соответствовало группе контрольных мышей. По результатам наблюдений за этими животными в последующие две недели не выявлено значимых различий с контролем по общему состоянию и приросту массы тела. По результатам гибели животных, представленным в табл. 1, выявлены несущественные гендерные различия в динамике гибели мышей, фиксируемые лишь при введении испытуемой субстанции в дозе 15000 мг/кг При этом 100 % гибель отмечалась у самок мышей, тогда как у самцов аналогичной группы количество погибших составило 80 %. Учитывая количество особей, погибших в первые сутки (в последующие сутки наблюдений летальных эффектов в группах не отмечено), был проведен расчет границ ЛД_0 [3, 4]. Результаты расчетов представлены в табл. 2, из которых следует, что границы ЛД_0 исследуемой субстанции при перораль-ном введении мышам составляют: 9773 мг/кг у самцов и 9541 мг/кг - у самок. Таблица 1 Г ибель мышей в экспериментах по изучению острой токсичности субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином Число погибших мышей/число в г руппе доза, мг/кг самцы доза, мг/кг самки 5000,0 0/5 5000,0 0/5 7500,0 1/5 7500,0 1/5 10000,0 3/5 10000,0 3/5 12500,0 4/5 12500,0 4/5 15000,0 4/5 15000,0 5/5 Примечание. Группы контрольных животных в таблицу не внесены. Ориентируясь на классификацию И. В. Саноц-кого [5, 6] и результаты гибели мышей заключили, что субстанция магния L-аспарагината в комбинации с пиридоксином при внутрижелудочном введении мышам может быть отнесена к классу малотоксичных ксенобиотиков. В исследованиях на крысах субстанцию магния L-аспарагината с пиридоксином вводили также внут-рижелудочно в токсических дозах от 6000 мг/кг до 8000 мг/кг. Введение субстанции в более высоких дозах не проводилось в связи с превышением максимально допустимого объема для внутрижелудочного введения животным, установленного действующими рекомендациями [3, 4]. По результатам экспериментов установлено отсутствие гибели животных при вве дении магния L-аспарагината с пиридоксином в указанных дозах. В связи с отсутствием гибели крыс границы токсичности исследуемой субстанции были рассчитаны по максимально введенной дозе, что также допускается действующими рекомендациями [3, 4]. При этом по результатам частичной выборочной эвтаназии животных, проведенной на вторые сутки эксперимента и обследования у них различных отделов желудочно-кишечного тракта (желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого и толстого кишечника) наличия остатков исследуемой субстанции не обнаружено, что свидетельствует о ее полной всасываемости из ЖКТ. Не обнаружено также в этих отделах и следов гиперемии, отека и повреждения слизистой. Клиника отравления испытуемой субстанцией соответствовала таковой, выявленной на мышах. При этом наиболее отчетливо симптомы отравления проявлялись у крыс при введении субстанции в максимальной дозе 8000 мг/кг. Характерным являлось: понижение двигательной активности, угнетение реакций на звуковые, тактильные и болевые раздражители, угнетение дыхания, слабый тремор конечностей. Бокового положения у крыс не зафиксировано, гибель особей отсутствовала. Указанные эффекты у животных отмечались через 10-15 мин и продолжались в первые 2-3 часа наблюдений. Период полной реабилитации и восстановления физической активности у крыс фиксировали в течение первых суток наблюдений. На вторые сутки состояние животных было удовлетворительным, слизистые - чистые, шерстный покров - гладкий, блестящий. Восстанавливались частота дыхания, подвижность и реакции на внешние раздражители. Пищевая и питьевая активности визуально не различались с контролем. На 7-е и 15-е дни эксперимента отмечалась положительная динамика прироста массы тела крыс, получавших субстанцию магния L-аспарагината с пиридоксином, не отличавшаяся от контрольной группы. Установлено, что ЛД50 субстанции магния L-аспа-рагината с пиридоксином при внутрижелудочном введении крысам составляет более 8000 мг/кг. ЗАКЛЮЧЕНИЕ По результатам проведенных исследований можно заключить, что субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином при введении внутрижелудочно мышам и крысам относится к малотоксичным соединениям. На основании представленных данных были рассчитаны различные границы летальности субстанции, введенной внутрижелудочно мышам-самкам и самцам. Установлено, что уровень ЛД_0 субстанции магния L-аспара-гината с пиридоксином составил для мышей-самцов 9 773 (7366,6 - 12965,5) мг/кг, для самок 9 541 (7691,8 -11835,5) мг/кг. Значение ЛД_0 магния L-аспарагината с пиридоксином при внутрижелудочном введении крысам в максимально растворимом объеме составило более 8000 мг/кг (табл. 2). Выпуск 2 (54). 2015 107 ІШторСз [ЩсміПГКЩ Таблица 2 Острая токсичность субстанции магния L-аспарагината с пиридоксином в экспериментах на мышах и крысах, мг/кг Исследуемая группа ЛД50 Опыты на мышах Самцы 9 773 (7366,6 Ч12965,5) Самки 9 541 (7691,8 Ч 11835,5) Опыты на крысах Самцы > 8000 Самки > 8000 В клинике отравления исследуемой субстанцией отмечены характерные симптомы острого отравления солями магния: элементы угнетающего влияния на ЦНС (седация, нарушение подвижности, угнетение рефлекторных ответов на внешние раздражители). Психоугнетающие эффекты у животных наблюдались через 10- 20 мин после введения субстанции, нивелирование данных проявлений прослеживалось в течение первых суток наблюдений. Состояние этих животных на вторые и последующие сутки двухнедельных наблюдений соответствовало таковому в контроле. При этом по окончании наблюдений различий у животных в группах контроль и опыт по параметрам общего состояния, пищевой активности, подвижности и приросту массы тела не обнаружено. Случаев отдаленной гибели у животных не отмечено. Следует отметить быстрое наступление и столь же быстрое прекращение вышеуказанных эффектов, позволяющее сделать предположение о быстром всасывании исследуемой субстанции из ЖКТ, что, в свою очередь, может быть объяснено ее возможной высокой биодоступностью.

作者简介

A. Spasov

Email: aspasov@mail.ru

L. Bugaeva

S. Lebedeva

A. Getmanenko

E. Kuzubova

M. Sinolitskiy

I. Iezhitsa

参考

补充文件