SINGLE-DOSE TOXICITY STUDY OF RU-185 (ENOXIFOL) IN RATS

全文:

В настоящее время поиск новых эффективных и безопасных лекарственных средств является актуальной задачей. В этом отношении обращают на себя внимание исследования, проведенные в Волгоградском государственном медицинском университете на ряде высокоактивных конденсированных производных бензимидазола [8], среди которых обнаружено новое вещество РУ-185 (эноксифол) с антиоксидантной активностью, не уступающей препарату мексидол [7], и сопутствующим широким спектром биологической активности [3, 4, 12]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ В данном исследовании сочли целесообразным определить у вещества РУ-185 (эноксифол) уровни токсичности и изучить влияние на функционально-поведенческий статус крыс при однократном интрагастраль-ном введении в дозах, убывающих от ЛД_0. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на 120 конвенциональных белых крысах обоего пола, 3,5-4-месячного возраста, массой 250-280 г, полученных из питомника ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора и прошедших 2- недельный карантин в виварии НИИ фармакологии ВолгГМУ. Содержание животных соответствовало принципам надлежащей лабораторной практики (ГОСТ Р-53434-2009), 2010. [9]. В дизайне исследований придерживались комплексного методического подхода, предусматривающего поэтапное изучение острой токсичности, влияния исследуемого вещества на функционально-поведенческий статус животных, расчета у него диапазонов безопасного и токсического уровней действий [2, 5, 10]. Изучение острой токсичности проводили с учетом методических рекомендаций по проведению доклинических исследований лекарственных средств методом 122 Выпуск 2 (58). 2016 Litchfield and Wilcoxon [6]. Субстанцию вещества РУ-185 растворяли на дистиллированной воде и вводили опытным группам крыс внутрижелудочно металлическим зондом однократно в токсических дозах: 1400,0; 1600,0; 1800,0; 2000,0; 2200,0; 2400,0 мг/кг Контрольной группе крыс вводили внутрижелудочно дистиллированную воду в объеме 5 мл/кг, что соответствует объему растворенной субстанции при введении опытным животным. Наблюдения за опытными и контрольными крысами вели в течение 2 недель. При этом в первые сутки наблюдения вели непрерывно в течение 8 час, а в последующие сутки - периодически утром и вечером. Отмечали клинику развития токсических эффектов и ее реабилитацию, подсчитывали количество погибших и выживших животных. По результатам гибели рассчитывали границы среднесмертельных доз (ЛД50) вещества. Влияние вещества РУ-185 на функционально-поведенческий статус животных проводили по методу S. Irwin, 1964 [11]. Результаты данных исследований, с использованием методического подхода Л.И. Бугаевой и соавт. [2], после математической обработки являлись основой для расчета широты терапевтического индекса (ШТИ) вещества и определения диапазонов безопасного (ДБА) и токсического (ДТА) действия в границах ШТИ. Влияние вещества РУ-185 на функционально-поведенческий статус крыс оценивали по спектру: поведенческих реакций (настороженность, пассивность, агрессия, беспокойство, груминг, спонтанная двигательная активность), нервно-мышечных (судороги, парезы, тремор, реакции на раздражители) и вегетотропных эффектов (размеры и реакции зрачка, птоз, уринации, дефекации, саливации, цвет кожи, частота дыхания, ректальная температура), с использованием 8-балльной шкалы Ирвина. Состояние животных в норме приравнивалась к 4 баллам, а изменение параметра в среднем на 25 % соответствовало изменению в 1 балл. Возрастание внешне наблюдаемых изменений по шкале от 4 до 8 баллов указывало на увеличение эффекта, а снижение - от 4 до 0 баллов. В данных исследованиях вещество РУ-185 начинали вводить крысам внутрижелудочно, в усредненных дозах, убывающих от ЛД_0 до минимальной дозы, проявляющей фармакологический эффект: 1900,0; 950,0; 475,0; 238,0; 119,0; 59,0; 30,0; 15,0; 3,8; 1,9 мг/кг. Контрольной группе животным вводили дистиллированную воду в объеме 5 мл/кг. Результаты данных исследований в последующем подвергали математической обработке (с использованием пакета программ Excel и Statistica 6.0). После математической обработки результаты тестирования в интегральном виде отражались на круговой диаграмме в форме «дозовой траектории». По «дозовой траектории» у препарата определяли диапазоны безопасной и токсической активностей. Широту терапевтического индекса рассчитывали по отношению дозы ЛД_0 к минимальной дозе, вызывающей фармакологический эффект, диапазон безопасного действия (ДБА) рассчитывали по соотношению максимальной эффективной безопасной дозы к минимальной дозе, вызывающей фармакологический эффект, диапазон токсического действия (ДТА) - от минимальной токсической дозы до дозы ЛД_0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По результатам изучения острой токсичности выявлено, что гибель животных после введения субстанции вещества РУ-185 (эноксифол) в токсических дозах наблюдалась в течение первых 2 часов. Для клиники отравления веществом было характерно угнетение подвижности, прогрессирующая седация и адинамия с изоляцией в углу камеры и принятия сидячего положения с симптомом «поникшей головы», бледность кожных покровов, снижение реакций на болевые и тактильные раздражители. При нарастании токсических эффектов, предшествующих гибели животных, прослеживалось угнетение дыхания, акроцианоз, боковое положение, тонические судороги, переходящие в клонико-тоничес-кие. Животные, оставшиеся в живых, пребывали в боковом положении еще на протяжении 40-60 мин. Впоследствии у них отмечалась характерная для первых суток реабилитационная динамика-активизировалось дыхание, снижалась интенсивность акроцианоза, из бокового положения животные переходили в положение лежа на животе. На вторые сутки наблюдений подвижность животных была снижена, реакции на внешние и болевые раздражители также были угнетены. При этом отмечалась неопрятность и тусклость шерстного покрова. Указанная динамика с постепенным восстановлением до контрольного состояния наблюдалась у этих животных в течение 8-9 суток эксперимента. Отдаленной гибели у животных не наблюдалось. Проведенные расчеты границы среднесмертельной дозы позволили обнаружить, что уровень ЛД_0 вещества РУ-185 оказался равным: 1921,0 (1858,5И985,6) мг/кг для крыс-самцов и 2260,3 (2294,7^2226,4) мг/кг для крыс-самок. Учитывая полученные результаты и ориентируясь на классификацию токсичности ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 17.4.1.02-83 [1] вещество РУ-185 можно отнести к классу умереннотоксичных. Для последующей оценки широты фармакотоксикологических свойств вещества РУ-185 и определения диапазонов доз безопасного и токсического действий сочли целесообразным изучить его влияние на функционально-поведенческий статус животных. Для этой цели вещество РУ-185 вводили в дробно-убывающей дозе от ЛД_0 до дозы, проявляющей минимальный фармакологический эффект. Результаты исследований отражены в табл. Из представленных данных видно, что в спектре поведенческих реакций у крыс под действием эноксифола практически не зависимо от его дозы отчетливо снижалась в среднем на 2-3 балла спонтанная двигательная активность. Другие поведенческие реакции изменялись менее существенно. Прослеживались некоторые Выпуск 2 (58). 2016 123 ІШторСз Влияние вещества эноксифол (peros) на функционально-поведенческий статус крыс Тестируемые Дозы, мг/кг параметры, баллы 1,9 3,8 15 30 59 119 238 475 950 1900 Поведенческие реакции Вокализация 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Настороженность 4 4 4 4 4 4 4 4 3 2 1 Активность 4 3,5 3,5 3,5 4 4 4 4 3 3 1 Стереотипия 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Беспокойство 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Агрессия 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Г руминг 4 4 4 5 5 5 4,5 4 4 3 1 Спонтанная двигательная активность 4 1 1 1 2 2 3 3 2 1 1 Нервно-мышечная возбудимость Реакция на прикосн. 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 2 Реакция на боль 4 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 Реакция на стук 4 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 Тремор 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Подергивание 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Судороги 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Расстройство походки 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 Тонус конечностей 4 4 4 4 3 3 2 2 2 2 2 Вегетативные эффекты Положение мигательной перепонки 4 4 4 3,5 3,5 3 3 3 3 2 2 Размер зрачка 4 5 4 4 3 3 3 3 2 2 2 Саливация 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Уринация 4 7 7 7 7 7 7 7 6 5 5 Дефекация 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 Температура (per rectum) 4 4 3 3 3 2 2,5 4,2 4,5 4 3,5 Цвет кожи 4 4 4 3 3 3 4 4 5 3,5 2,5 Частота дыхания 4 6 6 5 3,5 3 3 3,5 3 3 2,5 Примечание. Спектр внешне наблюдаемых изменений, вызываемый веществами, выражен количественно по восьмибалльной шкале: возрастание по шкале от 4 до 8 баллов указывает на увеличение эффекта, а снижение - от 4 до 0 - на угнетение (где 4 балла - оценка параметра в норме, а изменение в 1 балл соответствует изменению параметра в среднем на 25 %). В шкале оценок токсического профиля препарата, для признаков в норме отсутствующих или в незначительной степени имеющих место, активность выражается в значениях шкалы от 0 до 8 баллов (где 0 баллов - отсутствие признаков интоксикации). вариации изменений груминга, который повышался в среднем на 1 балл у крыс в диапазоне доз от 15 мг/кг до 119 мг/кг, но затем снижался в среднем на 2-3 балла при введении вещества в диапазоне доз от 950 до 1900 мг/кг Также в диапазоне доз от 475 мг/кг до 1900 мг/кг снижались настороженность и активность от 1 до 3 баллов. Стереотипии и агрессии у данных животных не прослеживалось. В спектре нервно-мышечной возбудимости у животных фиксировалось дозозависимое снижение реакции на болевые и слуховые раздражители на 1-2 балла. При этом тремора конечностей, подергиваний и наличия судорог в исследуемых дозах у крыс не наблюдалось. Наряду с этим в диапазоне доз от 59 мг/кг до 1900 мг/кг у крыс прослеживалось постепенное снижение тонуса конечностей в среднем на 1-2 балла и изменения в координации передвижений. Со стороны вегетотроп-ных эффектов у животных отмечалось дозозависимое снижение реакции зрачка, наличие птоза и повышение уринаций на 2-3 балла. Одновременно, у опытных крыс прослеживалось нарушение частоты дыхания, которое повышалось при введении вещества в диапазоне доз от 1,9 мг/кг до 15 мг/кг на 1-2 балла, но при увеличении вводимых доз, наоборот, постепенно дозозависимо угнеталось на 1-2,5 балла. При этом ректальная температура у крыс под действием вещества в диапазоне доз от 3,8 мг/кг до 119 мг/кг также несколько снижалась. В последующем, полученные данные подвергались математической обработке, по результатам которой была получена круговая диаграмма (рис.) функционально-поведенческого статуса животных, а эффекты вещества на этой диаграмме были отражены в форме интегральной «дозовой траектории». При этом в зависимости от дозы «дозовая траектория» проходила по секторам спектра поведенческих и вегетативных реакций, практически не задев сектор нервно-мышечных реакций. Анализируя данную траекторию эффектов, у вещества РУ-185 отметили несколько уровней активности. На первом уровне активности у эноксифола, ограниченном на графике точками I-III (соответствует дозовому диапазону от 1,9 мг/кг до 15,0 мг/кг), вероятно, превалируют вегетотропные эффекты, в которых ведущим звеном являются изменения температуры 124 Выпуск 2 (58). 2016 и дыхания. По мере увеличения дозы вещества данные эффекты нивелируются за счет нарастания поведенческих реакций. Другие эффекты вещества в указанных дозах являлись сопутствующим и на втором уровне активности эффекты, отраженные на интегральной «дозо-вой траектории», ограничены точками от IV до VII, что соответствует дозам от 30,0 мг/кг до 238,0 мг/кг, превалирует поведенческий спектр, в котором ведущим звеном являются спонтанная двигательная активность и груминг. При этом указанная активность у вещества в дозах от 30,0 мг/кг до 119,0 мг/кг приблизительно одинакова и максимальна; на третьем уровне эффекты вещества формируются на «дозовой траектории» в диапазоне точек VIII до IX (дозы вещества от 475 мг/кг до 1900 мг/кг), где постепенно начинали нарастать вновь вегетотропные эффекты, что на фоне угнетения поведенческих реакций, вероятно, может свидетельствовать 0 развитии под действием эноксифола токсикотропной динамики, в последующем приводящей к летальным исходам. Дозы препарата (мг/кг): 1 - 1,9 II - 3,8-7,6 III - 15,0, IV - 30,0 V - 59,0 13 VI - 119,0 14 VII - 238,0 VIII - 475,0 IX-950,0 X-1900,0 Рис. Интегральная оценка профиля функциональноповеденческой токсичности препарата эноксифол: вокализациии - 1, настороженность - 2, активность/ пассивность - 3, стереотипия - 4, беспокойство - 5, агрессия - 6, груминг - 7, спонтанная двигательная активность - 8, реакция на прикосновение - 9, реакция на боль - 10, реакция на стук - 11, тремор - 12, подергивание - 13, судороги - 14, расстройство передвижений - 15, тонус конечностей - 16, птоз - 17, размеры зрачка - 18, саливации - 19, уринации - 20, дефекации - 21, температура тела - 22, цвет кожных покровов - 23, частота дыхания - 24 Из представленных результатов интегральной оценки действия эноксифола на функционально-поведенческий статус крыс следует, что фармакологическая и токсикологическая активности эноксифола, в зависимости от используемых доз, неоднородны: в диапазонах доз от 1,9 мг/кг до 15,0 мг/кг и от 475,0 мг/кг до 1900,0 мг/кг в действии вещества, в основном, превалируют вегетотропные эффекты. Однако уровень качества их проявлений в данных диапазонах различен: на первом уровне - это безопасное действие вещества РУ-185, проявляющее фармакологический эффект; на втором-токсикотропное воздействие вещества, приводящее к гибели животных. В диапазонах доз от 30,0 мг/кг до 238,0 мг/кг фармакологическое воздействие вещества РУ-185, вероятно, максимально и безопасно, где превалируют поведенческие реакции. Учитывая представленные результаты у исследуемой субстанции вещества РУ-185 рассчитали широту терапевтического индекса (ШТИ), в пределах которого определили диапазоны безопасной фармакологической активности (ДБА) и диапазоны токсичной активностей (ДТА) вещества. Установлено, что ШТИ вещества РУ-185 оказался равным 1000 у. е.; ДБА = 240 у. е.; соответственно ДТА = от 475 у. е до 1000 у. е. В переходе на испытуемые эффективные и безопасные дозы можно заключить, что безопасное фармакологическое действие эноксифола проявляется в диапазоне доз от 1,9 мг/кг до 238 мг/кг с максимально выраженной активностью в дозах от 4-8 мг/кг и 59-119 мг/кг. Токсическое действие эноксифола начинает проявляться в дозах от 475 мг/кг и выше. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, с учетом дозозависимой неоднородности фармакологической и токсикологической активности эноксифола полагаем, что сведения о выявленных уровнях токсичности вещества РУ-185 (энок-сифол) и диапазонах его фармакологической и токсической активностей целесообразно использовать для выбора доз в последующих доклинических токсикологических исследованиях.

作者简介

L. Bugaeva

Volgograd State Medical University; Institute of Pharmacology of VolgSMU

Department of Pharmacology, Biology Department, Department of Fundamental Medicine and Biology

E. Kuzubova

Volgograd State Medical University; Institute of Pharmacology of VolgSMU

Department of Pharmacology, Biology Department, Department of Fundamental Medicine and Biology

D. Rebrova

Volgograd State Medical University; Institute of Pharmacology of VolgSMU

Department of Pharmacology, Biology Department, Department of Fundamental Medicine and Biology

M. Bukatin

Volgograd State Medical University; Institute of Pharmacology of VolgSMU

Email: buspak76@mail.ru
Department of Pharmacology, Biology Department, Department of Fundamental Medicine and Biology

A. Spasov

Volgograd State Medical University; Institute of Pharmacology of VolgSMU

Department of Pharmacology, Biology Department, Department of Fundamental Medicine and Biology

参考

补充文件