PHARMACOLOGICAL ANALYSIS OF THE MECHANISMS OF ACTION OF A OUINOXALINE DERIVATIVE WITH ANXIOLYTIC PROPERTIES

全文:

В ранее проведенных исследованиях показан С2,С3-хиноксалина под шифром ЗДМ [1]. Для дальнейпротивотревожный потенциал новых производных шего изучения средства для терапии патологической тревожности необходимо уточнение возможных механизмов реализации эффекта наиболее активного соединения ЗДМ-81. С целью выполнения поставленной задачи был выбран перечень методик фармакологического анализа, определяющий влияние соединения на серотонин-, дофамин-, ГАМК- и адренергическую системы [2, 3, 4]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Исследовать взаимодействие производного хино-ксалина с анксиолитической активностью соединения 2-(2-{[3-(4-третбутилфенил)хиноксалин-2-ил]метил}-4,5-диметоксифенил)-Ы-метилэтан-1-амин гидрохлорид с основными лигандами нейромедиаторных систем in vivo методами фармакологического анализа. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на 30 белых беспородных крысах-самцах массой 200-220 г и 60 белых мышах-самцах массой 18-22 г, полученных из ФГУП ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская область, Россия. Животные были разделены на группы по 6 животных в каждой. Грызуны содержались в условиях вивария НЦИЛС ВолгГМУ с естественным световым режимом при относительной влажности воздуха 40-50 % и температуре 22-24 °С на стандартной полнорационной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92). Эксперименты одобрены локальным этическим комитетом ВолгГМУ, Волгоград, Россия, номер протокола: IRB 00005839 IORG 0004900 (OHRP). Производное С2,С3-хиноксалина под шифром ЗДМ-81 было синтезировано НИИ физической и органической химии ЮФУ г. Ростов-на-Дону совместно с лабораторией СевероКавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института1. Для первичной оценки взаимодействия соединения ЗДМ-81 с ГАМК-ергической системой в исследованиях на мышах использовался тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» с применением антагониста бензодиазепиновых рецепторов флумазенила (ACS, США, 1 мг/кг). В качестве препарата сравнения использован диазепам (1 мг/кг). Доза ЗДМ-81 была рассчитана эквимолярно диазепаму и составила 1,75 мг/кг. Животным контрольной группы вводили растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме: 0,1 мл на 10 г веса животного. Опытные группы получали: 1) диазепам (1 мг/кг); 2) диазепам (1 мг/кг) и флу-мазенил (1 мг/кг, за 30 минут до введения диазепама); 3) ЗДМ-81 (1,75 мг/кг); 4) ЗДМ-81 (1,75 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 минут до введения ЗДМ-81). Все вещества вводились мышам атравма-тичным зондом внутрижелудочно, тестовое наблюдение начиналось через 30 мин после их введения. Регистрировалось время (с) пребывания мышей в открытом рукаве установки [5]. Методика 5-гидрокситриптофанового гиперкинеза связана со способностью 5-гидрокситриптофана в дозе 200-300 мг/кг активировать 5-НТ2А серотони-новые рецепторы, что приводит к периодическим встряхиваниям головой у экспериментальных животных [6]. Эксперимент проводился на 12 белых мышах-самцах, разделенных случайным образом на две группы (контрольную и опытную, n = 6). В эксперименте использованы: 1) группа контроля (5-ГТФ, Sigma, США, 300 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ЗДМ-81, 17,5 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения 5-ГТФ). Число встряхиваний головой оценивалось каждые 10 минут в экспериментальных группах на протяжении 60 мин после введения 5-ГТФ [2]. Оценка результатов теста проводилась путем сравнения параметров опытной г ру ппы с контролем. Тест «Галоперидоловой каталепсии» основан на свойстве типичных нейролептиков (трифтазин, этаперазин, галоперидол) угнетать двигательную активность и ориентировочные рефлексы животных, а также вызывать каталепсию in vivo, что обусловлено блокированием 02-рецепторов [7]. Тестирование проводилось на 12 крысах-самцах (n = 6). Соединение ЗДМ-81 вводили внутрижелудочно в дозе 17,5 мг/кг, группа контроля получала дистиллированную воду. Через 60 мин производилась инъекция галоперидола внутрибрюшинно в дозе 3 мг/кг. Степень каталепсии оценивали по способности крысы сохранять заданную позу в течение 15 с через 15, 30, 45, 60 и 120 мин после введения галоперидола по балльной шкале [8]: 1 балл - передняя лапа крысы слегка отведена и помещается на подставку высотой 3 см; 2 балла - крыса стоит на задних лапах, одна передняя помещена на подставку высотой 10 см; 3 балла - крыса стоит на передних лапах, одна задняя лапа помещена на подставку высотой 10 см. О способности нового соединения блокировать дофаминергические рецепторы 2-го типа судили по изменению выраженности ката-лептогенной реакции в опытных группах по отношению к контролю [9]. Для выявления возможного фармакологического взаимодействия с пресинаптическими а,2-адренорецеп-торами изучалась способность соединений влиять на гипотермическое действие клофелина [7]. Исследование выполняли на 18 крысах-самцах (п = 6). Группа интактного контроля не получала соединений, группа негативного контроля получала клофелин внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг, опытная группа получала клофелин внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг, а также ЗДМ-81 в дозе 17,5 мг/кг. Ректальную температуру животных оценивали с применением электронного термометра OMRON (Япония) каждые 30 мин эксперимента в течение 2 часов. О влиянии соединений на а,2-адренорецепторы судили по изменению эффектов опытных групп относительно групп контроля. Статистическая обработка полученных данных проводилась с применением критерия Краскелла -Уоллиса с посттестом Данна для множественных непараметрических сравнений, а также теста Манна -Уитни для парных непараметрических сравнений, реализованных в ПО GraphPad Prism v. 7.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По результатам исследования взаимодействия соединения ЗДМ-81 с флумазенилом в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» показано, что время пребывания мышей в светлом рукаве ПКЛ в группе контроля составило (30,3 ± 5,01) с, в группе диазепама - (69,2 ± 7,20) с. Под действием флумазенила (1 мг/кг) эффекты диазепама были снижены до уровня контрольных значений - (25,8 ± 2,76) с. В группе экспериментального соединения ЗДМ-81 наблюдались аналогичные закономерности: под влиянием флумазенила среднее время пребывания животных на открытых пространствах составило (26,5 ± 3,42) с, в то время как исходное значение для экспериментального соединения находилось на уровне (89,2 ± 7,41) с. Для групп диазепама и субстанции ЗДМ-81 показана достоверность различий с группой кон -троля, в то время как под действием флумазенила эффекты вещества ЗДМ-81 и диазепама соответствовали уровню активности группы контроля. Полученные данные позволяют сделать вывод о некотором ГАМК-ергическом влиянии изучаемого экспериментального соединения ЗДМ-81 в сравнении с бензодиазепиновым анксиолитиком диазепамом в дозе 1 мг/кг (рис. 1). “Отличия статистически значимы по отношению к контролю (р < 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса с посттестом Данна), пунктиром отмечен уровень контрольных значений. Рис. 1. Влияние флумазенила (в дозе 1 мг/кг, внутрибрюшинное введение) на проявление анксиолитической активности диазепама (в дозе 1 мг/кг, внутрижелудочное введение) и соединения ЗДМ-81 (в дозе 17,5 мг/кг, внутрижелудочное введение) в установке «Приподнятый крестообразный лабиринт» (мыши, M ± SEM) Еще через 10 мин, на 40-й минуте эксперимента число встряхиваний головой составило (1,60 ± 0,33), а к 60-й минуте теста - (0,30 ± 0,21). Таким образом, 5-НТ2А-активирующее действие 5-ГТФ наблюдалось на наиболее высоком уровне до 20-й минуты теста, после чего уменьшалось в 1,5 раза на 30-й минуте и плавно В группе мышей, получавших 5-гидрокси-триптофан внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг, число встряхиваний головой составило в среднем (9,7 ± 1,08) на 10-й минуте наблюдения. Через 20 мин после введения 5-ГТФ показатель оставался на том же уровне -(9,20 ± 0,74), а к 30-й минуте снизился до (6,20 ± 1,35). убывало на протяжении оставшегося времени тестирования. Под действием соединения ЗДМ-81 показатель был на более высоком уровне, чем в исходной группе: на 10-й минуте теста число встряхиваний головой составило (13,70 ± 0,95), на 20-й - (13,70 ± 1,05), а на 30-й -(12,50 ± 2,21), что свидетельствует о потенцировании эффекта агониста серотониновых рецепторов 5-ГТФ под влиянием экспериментального соединения. К 40-й минуте тестирования показатель наблюдался на уровне (10,00 ± 0,57), что гораздо больше, чем в референсной группе 5-ГТФ - (1,60 ± 0,33). К концу наблюдения, на 60-й минуте, параметр составил (5,60 ± 0,88-0,66), что в сравнении с исходными значениями позволяет предположить пролонгирование присущих 5-ГТФ эффектов в условиях данного теста. По результатам проведенного исследования можно предположить потенцирование эффектов 5-ГТФ в дозе 300 мг/кг под действием соединения с анксиолитической активностью ЗДМ-81 на протяжении всего периода наблюдения (60 мин), а также пролонгирование действия 5-НТ2А-агониста 5-ГТФ на временном промежутке 40-60 мин наблюдения в тесте «5-гидрокситрипто-фановый гиперкинез». Сводные данные о проведенном эксперименте приведены на рис. 2. “Отличия статистически значимы по отношению к группе 5-ГТФ (р < 0,05, U-критерий Манна - Уитни), пунктиром помечен уровень контрольных значений. Рис. 2. Влияние соединения ЗДМ-81 (в дозе 17,5 мг/кг, внутрижелудочное введение) на выраженность гиперкинезии, вызванной 5-гидрокситриптофаном (5-ГТФ, в дозе 300 мг/кг, внутрибрюшинное введение; мыши, M ± SEM) Галоперидол является типичным антипсихотическим препаратом, механизм действия которого связан с блокированием Э2-дофаминергических рецепторов ЦНС. Под его влиянием выраженность стереотипии крыс через 15 мин после введения галоперидола в дозе 3 мг/кг соответствовала (2,60 ± 0,21) баллам, в то время как в группе крыс, которым вводили дополнительно субстанцию ЗДМ-81, показатель составил (2,30 ± 0,21) балла. Через 30 мин теста уровень эффекта галоперидола не изменился, а в группе соединения ЗДМ-81 стал равен (2,50 ± 0,22) баллам. Каталепсия под влиянием галоперидола стала выраженнее к 45-й минуте эксперимента - (2,80 ± 0,16) балла, в параллельной группе, получавшей экспериментальное соединение ЗДМ-81, в данной временной точке величина эффекта была равна (2,20 ± 0,30) балла. Через час тестирования в группе галоперидола был зарегистрирован максимальный балл по расчетной шкале - (3,00 ± 0,01) балл, в группе соединения ЗДМ-81 уровень каталепсии упал до (2,20 ± 0,30) баллов, что достоверно отличается от референсной группы. Через 2 ч после введения крысам соединений уровень эффекта галоперидола б ь I л вдвое выше, чем вещества под шифром ЗДМ-81: (2,60 ± 0,21) балла против (1,33 ± 0,33) в опыт -ной группе. По результатам проведенного тестирования было отмечено, что соединение ЗДМ-81 характеризуется антагонистическим взаимодействием с галоперидолом в дозе 3 мг/кг после 60 мин введения препаратов опытным крысам. Полученные данные могут свидетельствовать о некотором дофаминергическом действии изучаемой экспериментальной субстанции в тесте каталепсии, вызванной галоперидолом (рис. 3). “Отличия статистически значимы по отношению к группе галоперидола (р < 0,05, U-критерии Манна - Уитни). Рис. 3. Изменение каталептогенного эффекта галоперидола (в дозе 3 мг/кг, внутрибрюшинное введение) при введении соединения ЗДМ-81 (в дозе 17,5 мг/кг, внутрижелудочное введение, крысы, M ± SEM) Ректальная температура интактных мышей составила (37,30 ± 0,25) °С и оставалась примерно на том же уровне до конца эксперимента, составив (36,50 ± 0,24) С на 120-й минуте теста. В группе мышей, которым вводили клофелин в дозе 0,1 мг/кг, ректальная температура падала на 30-й минуте эксперимента до (35,60 ± 0,20) С и оставалась на том же уровне до 120-й минуты. Под действием изучаемого соединения в группе мышей, получавших соединение ЗДМ-81 и клофелин, величина ректальной температуры животных приблизительно соответствовала данным группы клофелина. Через 30 мин после введения животным соединения ЗДМ-81 совместно с клофелином уровень ректальной температуры составил (35,50 ± 0,44) °C, через час -(35,80 ± 0,47) °C, через 1,5 часа - (35,80 ± 0,36) °С и через 2 часа - (35,70 ± 0,16) °C. Начиная с 30-й минуты теста наблюдалось достоверное различие между группами клофелина и соединения ЗДМ-81 с контрольными значениями. Полученные дан -ные свидетельствуют об отсутствии значимого влияния экспериментального соединения на а.2-адренорецепторы в сравнении с клофелином в дозе 0,1 мг/кг (рис. 4). Сводные данные о проведенном исследовании приведены в таблице. “Отличия статистически значимы по отношению к группе интактного контроля (р < 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса с посттестом Данна). Рис. 4. Изменение гипотермического эффекта клофелина (в дозе 0,1 мг/кг, внутрибрюшинное введение) при введении соединения ЗДМ-81 (в дозе 17,5 мг/кг, внутрижелудочное введение, мыши, M ± SEM) Взаимодействие соединения ЗДМ-81 с различными агонистами и антагонистами медиаторных систем ЦНС in vivo Регистрируемый параметр Зарегистрированный эффект Адренергическая система Клофелиновая гипотермия отсутствие Дофаминергическая система Галоперидоловая каталепсия 1 Серотонинергическая система 5-гидрокситриптофановый гиперкинез т ГАМК-ергическая система Тест взаимодействия с флумазенилом 1 Примечание. Т - усиление эффекта; 1 - ослабление эффекта. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В тесте «5-гидрокситриптофановый гиперкинез» зарегистрировано потенцирование и пролонгирование эффектов 5-ГТФ, что позволяет предположить наличие 5-НТ2А-серотонинегического действия соединения ЗДМ-81. В тесте взаимодействия с антагонистом бензодиазепинового сайта ГАМК рецепторов флумазенилом показано блокирование указанным антагонистом эффекта экспериментальной субстанции ЗДМ-81, что может свидетельствовать о связи между реализацией эффекта соединения ЗДМ-81 и ГАМК-ергической системы. По результатам теста «Каталепсии, вызванной галоперидолом» можно предположить некоторое влияние изучаемой субстанции на Э2-дофаминергическую систему, что требует дальнейшего изучения и уточнения. В тесте клофелиновой гипотермии действие субстанции ЗДМ-81 может быть охарактеризовано как не связанная с влиянием на а,2-адренорецепторы и косвенные адреноблоки-рующие системы. По результатам проведенного исследования взаимодействия соединения ЗДМ-81 с основными агонистами и антагонистами различных нейромедиаторных систем in vivo было установлено, что для экспериментальной субстанции характерно влияние на серотонинергическую, ГАМК-ергическую и дофаминергическую системы.

作者简介

M. Skripka

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: rete.mirabile.renis@gmail.com
Assistant of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

D. Maltsev

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

Email: maltsevdmitriy@rambler.ru
Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

A. Spasov

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center; Scientific Center of Innovative Medicines

Email: aspasov@mail.ru
Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

M. Perfiliev

Volgograd State Medical University; Scientific Center of Innovative Medicines

Email: maxim.firu@yandex.com
Volgograd, Russia

参考

补充文件