The study evaluates the effectiveness of 3-arylidene-2-oxindole in reducing intraocular pressure in old animals

Alexander A. Spasov; Спасов Александр Александрович; Lyudmila V. Naumenko; Науменко Людмила Владимировна; Alyona S. Taran; Таран Алена Сергеевна; Alina M. Chebanko; Чебанько Алина Михайловна; Umida M. Ibragimova; Ибрагимова Умида Махсатовна; Dmitry S. Yakovlev; Яковлев Дмитрий Сергеевич; Maria S. Pshenichnikova; Пшеничникова Мария Сергеевна; Nadezhda M. Shcherbakova; Щербакова Надежда Манжиевна; Natalia A. Lozinskaya; Лозинская Наталья Александровна; Elena N. Bezsonova; Безсонова Елена Николаевна

doi:10.19163/1994-9480-2025-22-1-55-60

The study evaluates the effectiveness of 3-arylidene-2-oxindole in reducing intraocular pressure in old animals

作者: Spasov A.A.¹, Naumenko L.V.¹, Taran A.S.¹, Chebanko A.M.¹, Ibragimova U.M.¹, Yakovlev D.S.¹, Pshenichnikova M.S.¹, Shcherbakova N.M.¹, Lozinskaya N.A.², Bezsonova E.N.²
隶属关系:
1. Volgograd State Medical University
2. Lomonosov Moscow State University
期: 卷 22, 编号 1 (2025)
页面: 55-60
栏目: Original Researches
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/683088
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2025-22-1-55-60
ID: 683088

如何引用文章

全文:

详细
全文:
作者简介
参考
补充文件
统计

详细

Aim: To study the potential of the melatonin isostere, the compound K-165, to reduce intraocular pressure in old animals with elevated ophthalmotonus, and to evaluate its local irritant effect and cytotoxic properties. Materials and methods: The study was conducted in old rats over two years of age with intraocular pressure (IOP) above 16 mmHg. The level of ophthalmotonus was measured using a portable contact tonometer Tonovet ICare (Finland). The presence of IOP-lowering activity of the tested substance was assessed by the maximum reduction in ophthalmotonus compared to baseline pressure levels. The assessment of local irritant effects was conducted using a three-point scale after applying the substance to the eye tissues of the laboratory animal. Cytotoxicity was studied on HepG2 cell lines (human hepatocellular carcinoma) (CLS Cell Lines Service). Result: The compound K-165 reduces the level of intraocular pressure (IOP) in old animals, outperforming melatonin comparator. K-165 decreases ophthalmotonus by 21 % from baseline by the third hour and does not have a local irritating effect on the eye conjunctiva. It is shown that the mean cytotoxic concentration exceeds 100 μM for the compound K-165 (R² = 0.9), indicating low cytotoxicity. Conclusion: The compound K-165 significantly reduces IOP, does not have a local irritating effect, and is classified as a compound with low cytotoxicity.

关键词

glaucoma, elevated intraocular pressure, old animals, melatonin bioisosteres

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Глаукома – хронически прогрессирующая оптиконейропатия, являющаяся одной из ведущих причин полной утраты зрительной функции у людей по всему миру [1]. В настоящее время по всему миру насчитывается более 70 млн больных глаукомой, а по прогнозам к 2040 г. их количество достигнет 111,8 млн [2].

Глаукома имеет мультифакториальный характер и сводится к повреждению ганглиозных клеток сетчатки и нервных волокон зрительного тракта [1, 2]. Уровень офтальмотонуса – важная составляющая нормальной физиологии глаз, и при его изменении возникают те или иные патологические состояния. Чаще всего рост офтальмотонуса связывают с нарушением оттока водянистой влаги (ВВ) по патологически измененным трабекулярному и увеосклеральному пути. Возрастные сосудистые изменения, такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС), гипертоническая болезнь, метаболический синдром и атеросклероз могут привести к значительным изменениям трофики глазных структур, вплоть до ишемии, что запускает апоптоз ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) [1].

Против ГКС могут вырабатываться антитела и провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6, TNF-α), что лежит в основе нейровоспалительного процесса. В результате компрессии головки зрительного нерва наступает прогрессирующая потеря нервных волокон зрительного тракта, как следствие – ухудшение зрительной функции и слепота [1]. Риск прогрессирования потери полей зрения у пациентов снижается на 10–15 % при снижении ВГД всего на 1 мм рт. ст. [3].

Выделяют две большие группы препаратов, снижающих офтальмотонус. Первая группа включает препараты, улучшающие дренаж ВВ (аналоги простагландинов, например, латанопрост), которые способны понизить офтальмотонус на 30–35 % от исходного уровня за счет активации увеосклерального пути через простагландиновые рецепторы и расслабить гладкомышечные клетки трабекулярной сети [3]. Однако ряд пациентов ввиду своих генетических особенностей не восприимчивы к данному препарату [4].

Также отток ВВ можно стимулировать воздействием М-холиномиметиков на соответствующие рецепторы, например, пилокарпин способен снизить офтальмотонус на 20–25 % от исходных значений. Но данный препарат вызывает ряд системных (повышенная потливость, тошнота, одышка и др.) и местных (затуманивание зрения, ухудшение ночного зрения) побочных явлений.

Ко второй группе относятся препараты, угнетающие образование ВВ. Сюда относятся β-адреноблокаторы, например, тимолол, способный снижать уровень офтальмотонуса на 20–25 % от исходного уровня за счет блокады β1-, β2-адренорецепторы цилиарного тела [3, 5].

Данный препарат также всасывается в системный кровоток и влечет ряд нежелательных побочных реакций, таких как бронхоспазм и брадикардия, которые могут угрожать жизни пациента [6].

Таким образом, несмотря на большое количество противоглаукомных препаратов, остается актуальным поиск новых средств с выраженным офтальмогипотензивным эффектом и минимальными суточными колебаниями ВГД, хорошо переносимых и высоко безопасных. В ранее проведенных исследованиях [7] среди изостеров мелатонина было выявлено соединение К-165, обладающее офтальмогипотензивными свойствами.

Цель работы

Изучение возможности изостера мелатонина, соединения К-165, снижать внутриглазное давление у старых животных с повышенным офтальмотонусом, оценка его местнораздражающего действия и цитотоксических свойств.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Все манипуляции с лабораторными животными и условия их содержания проводились с соблюдением всех требований лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», [ГОСТ 33044-2014]. Все экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с требованиями действующего «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., 2012), со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2010, № 16, ст. 1815; № 31, ст. 4161) и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Межгосударственный стандарт [ГОСТ 33044-2014] и Приказ Минздрава России от 01.04.2016 N 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Все методические подходы использовались в соответствии с требованиями в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.)». Процедуры с участием лабораторных животных осуществлялись в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей». Экспериментальное исследование одобрено этическим комитетом (справка № 2022/043 от 02.12.2022 года).

Исследование было выполнено на 40 старых белых беспородных крысах обоих полов [масса 400–530 г, возраст (24 ± 1) мес.] и уровнем ВГД >16 мм рт. ст. и 15 нелинейных морских свинках (масса 220–300 г, возраст 5 мес.) В ходе работы изучен изостер мелатонина – соединение К-165, синтезированный на кафедре медицинской химии и тонкого органического синтеза МГУ имени М.В. Ломоносова. В качестве препарата сравнения исследовался мелатонин (НАО «Северная звезда», Россия.)

На первом этапе проводили измерение исходного значения офтальмотонуса при помощи тонометра (Tonovet ICare, Финляндия). В экспериментальные группы включали животных старше двух лет, уровень ВГД у которых свыше 16 мм рт. ст.

Все животные были разделены на следующие группы:

исследуемая группа 1 (контроль): интактные животные (n = 10);
исследуемая группа 2 (контроль): старые животные с повышенным ВГД (n = 10);
исследуемая группа 3 (опыт): старые животные с повышенным ВГД (n = 10);
исследуемая группа 4 (препарат сравнения) (n = 10).

В качестве растворителя соединения К-165 и мелатонина использовалась деионизированная вода. Соединение К-165 и мелатонин, после разведения в деионизированной воде, закапывали животным однократно в тестовый (правый) глаз по 50 мкл 0,4%-го раствора. Левый глаз каждого животного выступал в качестве контрольного, в него производилась инстилляция 30 мкл деонизированной воды. Далее осуществляли тонометрию через 60, 120 и 180 мин.

Полученные данные обрабатывали в программе MicrosoftExcel 2020 и GraphPadPrism 8.0.

Для исключения возможного негативного влияния на результаты исследования циркадных биоритмов все экспериментальные исследования проводились в одинаковые интервалы времени (с 9.00).

Оценка местнораздражающего действия К-165 осуществлялась на морских свинках [8]. Изучаемое соединение было использовано в дозах, эквивалентных поступающим в организм животного при ЭД50 или 10-кратной ЭД50 (соответственно, 0,2%-й и 2%-й суспензий), для проведения конъюнктивальной пробы.

Для этого глазной пипеткой в тестовый глаз производили инстилляцию 1 капли 0,2%-го и 2%-го водного раствора исследуемых веществ под верхнее веко животных. В контрольный глаз производили инстилляцию 1 капли дистиллированной воды.

Реакцию учитывали через 15 мин, 24 ч, оценивая в баллах по следующей шкале:

0 – полное отсутствие проявлений раздражающего действия;

1 – легкое покраснение слезного протока;

2 – покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;

3 – покраснение всей конъюнктивы и склеры, реакция сопровождается почесыванием, возможно развитие гнойного воспаления. [2].

Цитотоксичность изучалась на клетках линии HepG2 (гепатоцеллюлярной карциномы человека) (CLS CellLinesService).

Принимая во внимание величину концентрации изучаемых веществ 0,1–0,4 %, демонстрирующую основное фармакодинамическое действие, диапазон тестируемых концентраций при изучении цитотоксичности составлял 0,00130 ммоль/л, достигая рабочих концентраций. В случае образования пересыщенных концентраций исследовалась суспензия, содержащая эквивалентное количество вещества. Использовали методику МТТ-теста [9] в модификации [10].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения MARS Data Analysis Software, GraphPad Prism v.7.0 и Microsoft Office Excel 16 с расчетом показателя % выживаемости клеток в каждой изученной концентрации и концентрации, вызывающей цитостатический эффект на 50 % (СС50).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования было выявлено, что уровень ВГД в контрольной группе старых животных был выше, чем в группе интактных животных, на 50 % (табл. 1).

Таблица 1

Влияние соединения К-165 на уровень внутриглазного давления в разных группах животных (М ± σ)

Группы	ВГД, мм рт. ст., 180 мин
Группа 1 (интактные)	11,11 ± 0,44
Группа 2 (старые животные)	16,70 ± 0,21*
Группа 3 (К-165)	13,2 ± 0,6^#
Группа 4 (мелатонин)	15,00 ± 0,35

* Показатели статистически значимо отличаются от группы контроля (интактные) при р < 0,05; t-критерий Стьюдента;

^# показатели статистически значимо отличаются от контрольной группы старых животных при р < 0,05; t-критерий Стьюдента.

В опытной группе (К-165) уровень ВГД под действием исследуемого соединения снизился на 21 % по сравнению с контрольной группой старых животных. У животных, которым вводили мелатонин, наблюдалась тенденция снижения ВГД.

Установлено, что соединение К-165 максимально снижает уровень офтальмотонуса к 3-му часу исследования, не оказывая похожего эффекта в коллатеральном глазу, что свидетельствует об отсутствии резорбтивного эффекта.

Исследуемое соединений К-165 также было изучено на возможность оказывать местнораздражающее действие на конъюктиву глаз морских свинок. В результате было показано, что соединения К-165 в концентрациях 0,2 % и 2 % не имеет собственно раздражающего действия на конъюнктиву. После закапывания соединения К-165 в любой из исследуемых концентраций у лабораторных животных отсутствовала гиперемия конъюнктивы, слизистое отделяемое и рефлекторное почесывание глаз.

Таблица 2

Величина цитотоксической концентрации для каждого исследуемого вещества

Шифр	Величина СС50, ммоль/л	R²
K-165	0,114	0,9
Мелатонин	4,700	0,9

Оценка цитотоксических свойств проводилась с использованием методики МТТ-теста на линии клеток HepG2. В результате исследования были установлены величины цитотоксической концентрации, вызывающей снижение метаболической активности клеток на 50 % для каждого вещества. Результаты предоставлены в табл. 2, рис. Показано, что величина средней цитотоксической концентрации превышает величину 100 мкМ как для соединения К-165 (R²= 0,9), так и для мелатонина (R² = 0,9) после 48 часовой инкубации в МТТ-тесте, что соответствует веществам с низкой цитотоксичностью.

Рис. Влияние соединений K-165 в концентрациях 0,001–30 ммоль/л на метаболическую активность (жизнеспособность) клеток лини HepG2 при 48 часовой инкубации в МТТ-тесте

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Производное 3-арилиден-2-оксиндола соединение К-165 в концентрации 0,4 % выражено снижает уровень ВГД у старых животных при однократном введении к 3-му часу исследования, превосходя по активности мелатонин. Также данное соединение не оказывает похожего эффекта в коллатеральном глазу, что свидетельствует об отсутствии резорбтивного эффекта. Соединение К-165 не раздражает конъюнктиву глаза и имеет низкую цитотоксичность, что делает его перспективным для дальнейших исследований.

***

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Финансирование: исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда и администрации Волгоградской области, Проект 22-15-20025.

Funding: the research was supported by the Russian Science Foundation and the administration of the Volgograd region, Project 22-15-20025.