Evaluating the effectiveness of cell selection in lawns growing in high copper content in the environment

Full Text

Травянистые растения играют важную роль в очистке воздуха мегаполисов, большое значение играют газоны. Создание газона в городских экосистемах определяется его назначением и условиями окружающей среды обитания. Однако создание газонов трудоемкий процесс, газонные травы очень чувствительны к неблагоприятным условиям окружающей среды, поэтому для городских условий особенно важно получение растений, способных расти в условиях высокого уровня загрязнения [1, 2] . Среди основных загрязнителей почвенного покрова городов - соли тяжелых металлов [1, 3 - 5] . Крайне высокое содержание солей тяжелых металлов фиксируется даже в почвах некоторых скверов и парков. Основные загрязнители почвенного покрова Москвы - среди тяжелых металлов соли цинка, свинца и меди, при этом медь обладает наибольшей фитотоксичностью. Один из способов решения этой проблемы является создание устойчивых к неблагоприятным экологическим факторам растений. К сожалению, традиционные подходы не всегда эффективны, поэтому необходимость использования в городском озеленении нетрадиционных технологий, которые позволили бы сохранить видовое разнообразие травянистого покрова городов и обеспечили нормальное существование растений в городской экосистеме, в условиях среднего уровня загрязнения, в последние годы ощущается все с большей остротой. Среди новых технологий большую перспективу имеют биотехнологии, которые используются в различных направлениях и для различный объектов, но они практически не нашли применение в городском озеленении. Современные биотехнологии позволяют ускорить процесс селекции. Клеточная селекция это экологически безопасная технология создания адаптивных форм растений, использующая природные резервы изменчивости растений. Технологии клеточной селекции хорошо зарекомендовали себя при получении растений, толерантных к различным экологическим стрессовым факторам, разработаны технологии для газонных трав [6 - 7]. Однако, работы по получению растений, устойчивых к тяжелым металлам единичны [7 - 9], отсутствуют работы по получению устойчивых к меди однодольных растений. Объекты и методы Объектом нашего исследования была газонная трава - полевица побегоносная (Agrostis stolonifera L.). Первичный каллус получали из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей 30 г/л сахарозы, 500 мг/л гидролизата казеина и 7 г/л агар-агара, концентрация 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) составляла 3 мг/л. Для образования первичного каллуса семена предварительно стерилизовали коммерческим отбеливателем «Белизна». Затем семена раскладывали в чашки Петри на поверхность агаризованной среды (по 30 семян для полевицы на чашку) и культивировали при температуре 26 °C и влажности 70% на свету интенсивностью 2000 лк при длине светового дня 16 час. Через 30 дней культивирования получали первичный каллус. Первичный каллус массой 15 - 20 мг высаживали на селективную среду МС содержащую СuSO4*5H2O. После культивирования в течение 1 месяца отбирали светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Культивирование отобранных каллусов во 2 пассаже проводили при тех же условиях, что и в первом пассаже. Затем проводили регенерацию растений и укоренение на среде МС с токсикантом. При добавлении меди в твердую питательную среду, среда не застывала, поэтому в чашки Петри помещалась фильтровальная бумага на вате, которая была смочена жидкой питательной средой. Стандартное отклонение рассчитывали с помощью программы Microsoft Office Excel 2003. Результаты и обсуждение Важнейшее условие для реализации клеточных технологий - введение в культуру клеток растений, для многих растений это чрезвычайно трудоемкий процесс [10]. В результате проведенной оптимизации условий культивирования тканей, была разработана эффективная система in vitro, характеризующаяся высокой частотой образования каллуса и регенерации растений полевицы побегоносной. На первом этапе работы была проведена оценка фитотоксичности меди для каллусных культур. Масса каллуса полевицы на питательной среде без токсиканта (контроль) увеличивалась за месяц в 5 раз. Медь продемонстрировала более высокую фитотоксичность по сравнению с цинком и свинцом в культуре клеток. Добавление соли меди в питательную среду ингибировало прирост массы каллуса полевицы, существенное ингибирующее воздействие наблюдалось при 150 мг/л (в пересчете на чистый металл), при концентрации 300 мг/л и выше каллус газонных трав приобретал голубую окраску, вероятно, вследствие интенсивного накопления меди в клетках жизнеспособность каллусных тканей была крайне низкой. Регенерационная способность каллусных тканей была низкой при культивировании на средах со 150 мг меди/л, у большого количества эксплантов наблюдалось потемнение ткани, однако часть каллусов сохраняла морфогенную способность. При концентрации 200 мг меди/л большая часть клеток теряла способность к морфогенезу и каллусные ткани практически не регенерировали. На основании исследования действия меди, концентрация 150 мг/л была выбрана в качестве селективной. Для получения растений, устойчивых к меди, была использована схема селекции, включающая в себя культивирование каллуса в течение 2 пассажей на модифицированной среде Мурасиге-Скуга с 150 мг/ л меди , регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с 150 мг/ л меди и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 150 мг меди/л (см. рисунок 1). Рисунок 1. Технология получения растений полевицы побегоносной, устойчивых к меди с помощью клеточной селекции Селективный фактор присутствовал в среде на всех этапах отбора, включая укоренение регенерантов, для того чтобы повысить вероятность получения устойчивых растений. Всего в селективных условиях было получено 180 регенерантов полевицы в условиях in vitro (табл.1). Таблица 1 Отбор толерантных к ионам меди растений полевицы побегоносной Общее число каллусов Число устойчивых клонов Число регенерантов in vitro Число регенерантов в почве 1726 565 180 78 Часть регенерантов не укоренялись в почве, вероятно, это было связано с относительно жесткими условиями культивирования - использовании меди на каждом этапе. Около 10% регенерантов в почве имели морфологические отличия от исходных растений - низкорослость, меньшая кустистость, более жесткие листья. Остальные регенеранты не отличались от исходных растений. Для оценки эффективности разработанной технологии необходимо было оценить толерантность к меди полученных регенерантов и их потомков. Для проверки устойчивости к высоким концентрациям меди, тридцать полученных после клеточной селекции регенерантов полевицы, а также исходные растения были высажены в почву содержащую 150 мг Cu /кг. Большинство исследуемых растений, полученных из устойчивых к меди клеток, росли лучше, чем исходные растения, при этом рост большинства растений не отличался от растений, растущих на почве без меди. Потомки четырех (№33, №56, № 58, № 26) из пяти исследуемых регенерантов полевицы продемонстрировали повышенную толерантность к меди. Потомки регенеранта № 26 продемонстрировали повышенную устойчивость к меди в двух поколениях (см. рисунок 2). Устойчивость в третьем поколении также сохранялась. Рисунок 2. Влияние меди (100 мг/л) на рост потомков регенерантов Исходя из полученных результатов можно считать успешным оригинальный подход примененный в данной работе, который заключался в использовании прямой схемы селекции, включающей в себя культивирование каллуса в течение 2 пассажей на модифицированной среде Мурасиге-Скуга с токсикантом, регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с токсикантом и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с токсикантом. В дальнейшем этот подход, был применен для получения растений устойчивых к свинцу. Таким образом, у растений полевицы показано наследование отселектированного признака в следующих поколениях. Учитывая сохранение признака устойчивости к меди у большинства регенерантов и в следующих поколениях, можно говорить об эффективности использования клеточной селекции для создания газонов, растущих при высокой концентрации данного токсиканта в окружающей среде.

About the authors

E. A. Gladkov

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI); Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Science; Bauman Moscow State Technical University

Ph.D

Yu. I. Dolgih

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI); Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Science

Dr. Sc. Prof

O. N. Gladkova

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Email: gladkovu@mail.ru

L. S. Glushetskaya

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

References

Supplementary files