Induction of carotenogenesis in the yeast of Phaffia rhodozyma strain Y2228 in formation of singlet oxygen in culture medium under the action of hydrogen peroxide

Abstract

The article describes a method for inducing carotenogenesis in the yeast of Phaffia rhodozyma strain Y2228 using hydrogen peroxide.

Full Text

Дрожжи Phaffia rhodozyma штамм Y2228 являются продуцентом астаксантина. Эти дрожжи способны утилизировать как шестиатомные, так и пятиатомные сахара. Астаксантин является высшим каротиноидом с самой высокой антиоксидантной активностью. В организмах высших животных астаксантин выполняет регуляторные функции, повышает иммунитет, повышает выживаемость особей в условиях стресса и вредных воздействий окружающей среды. Благодаря способности культуры утилизировать пяти- и шестиатомные сахара возможно получение кормового препарата, содержащего астаксантин из послеспиртовой барды. Послеспиртовая барда для культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma штамм Y2228 требует предварительной переработки, включающей разделение барды на фракции, слабокислый гидролиз биомассы спиртовых дрожжей и двухступенчатый гидролиз дробины (для получения пяти- и шестиатомных моносахаров). Однако в результате гидролиза цветность питательной среды не позволяет получить нужную концентрацию синглетного кислорода, образующегося при воздействии света, чтобы индуцировать каротиногенез у дрожжей. Получить синглетный кислород в культуральной жидкости возможно при внесении в культуральную жидкость органических или неорганических окислителей. При выборе окислителя следует учитывать его токсичность и токсичность продуктов разложения, так как токсины могут угнетать рост биомассы дрожжей, а содержание токсинов в кормовых продуктах недопустимо. В предварительных экспериментах из трех неорганических окислителей, показавших возможность их применения для получения такой концентрации синглетного кислорода, которая индуцирует образование астаксантина, по вышеназванным причинам выбран пероксид водорода [1]. Таблица 1 План многоуровневого эксперимента в абсолютных единицах № п/п Концентрация H2O2, ммоль/л Время внесения, час от начала культивирования Объем культуральной жидкости, мл Количество внесений, раз 1 8 0 10 1 2 8 6 15 2 3 8 12 20 3 4 8 18 25 4 5 10 0 25 4 6 10 6 20 3 7 10 12 15 2 8 10 18 10 1 9 12 0 15 2 10 12 6 20 4 11 12 12 25 1 12 12 18 10 2 13 14 0 20 3 14 14 6 15 1 15 14 12 25 4 16 14 18 10 3 Таблица №2 Результаты эксперимента № п/п Конечная концентрация астаксантина, мг/л (Y1) Концентрация биомассы, г (Y2) Концентрация АК, мг/г сухой биомассы (Y3) 1 29,74 28,6 1,04 2 40,3 24,4 1,66 3 26,47 22,0 1,21 4 14,42 20,6 0,7 5 10,31 22,4 0,46 6 30,84 22,4 1,38 7 39,97 23,6 1,7 8 17,72 24,0 0,74 9 35,74 22,6 1,59 10 23,26 19,2 1,22 11 9,05 22,6 0,4 12 26,71 18,0 1,49 13 20,0 21,0 0,96 14 33,86 19,6 1,73 15 12,41 9,4 1,32 16 25,43 24,0 1,06 Для определения оптимальных условий культивирования и максимального выхода астаксантина проведен эксперимент согласно многоуровневому плану латинских прямоугольников для 4 факторов на 4 уровнях. Основными варьируемыми параметрами выбраны: концентрация пероксида водорода, время внесения (через сколько часов после начала культивирования будет внесен пероксид водорода), количество внесений пероксида водорода и объем культуральной жидкости в колбе. Результаты эксперимента представлены в таблице №2. Таблица № 3 Итоги расчетов величины эффектов аддитивно-решетчатого описания для конечной концентрации астаксантина, мг/л(Y1) № п/п Наименование фактора Натуральные и кодированные значения уровней факторов 1 S1 Концентрация Н2О2 8 10 12 14 Эффект 2,96 -0,06 -1,08 -1,845 2 S2 Время внесения 0 6 12 18 Эффект -0,82 7,29 -2,79 -3,7 3 S3 Объем культуральной жидкости 10 15 20 25 Эффект 0,13 12,69 0,39 -13,22 4 S4 Количество внесений 1 2 3 4 Эффект -2,18 10,91 0,915 -9,67 Таблица № 4 Итоги расчетов величины эффектов аддитивно-решетчатого описания для концентрации биомассы, г (Y2) № п/п Наименование фактора Натуральные и кодированные значения уровней факторов 1 S1 Концентрация Н2О2 8 10 12 14 Эффект 2,37 1,57 -0,93 -3,03 2 S2 Время внесения 0 6 12 18 Эффект 2,12 -0,13 -2,13 0,12 3 S3 Объем культуральной жидкости 10 15 20 25 Эффект 2,12 1,02 0,37 -2,78 4 S4 Количество внесений 1 2 3 4 Эффект 2,17 0,62 0,82 -3,63 Таблица № 5 Итоги расчетов величины эффектов аддитивно-решетчатого описания для концентрации АК мг/г биомассы (Y3). № п/п Наименование фактора Натуральные и кодированные значения уровней факторов 1 S1 Концентрация Н2О2 8 10 12 14 Эффект -0,01 -0,1 0,01 0,1 2 S2 Время внесения 0 6 12 18 Эффект -0,15 0,33 -0,01 -0,17 3 S3 Объем культ. жидкости 10 15 20 25 Эффект -0,08 0,5 0,39 -0,45 4 S4 Количество внесений 1 2 3 4 Эффект -0,19 0,44 -0,01 -0,24 Анализ кривых эффектов факторов эксперимента показал, что для получения высокой конечной концентрации астаксантина (40,3 мкг/мл) концентрация пероксида водорода не должна превышать 10 млмоль/л, необходимо двукратное внесение этой концентрации пероксида водорода в течение стадии роста культуры с максимальной удельной скоростью роста. При такой концентрации пероксида водорода скорость синтеза астаксантина и его конечная концентрация соответствуют культивированию при постоянном освещении (максимальной полученной концентрации при оптимальной постоянной освещенности 200 лк - 38 мкг/л). Очевидно, что такая концентрация пероксида водорода частично ингибирует рост клеток дрожжей. Для того чтобы определить оптимальные параметры внесения пероксида водорода для получения максимального количества биомассы, следует определиться с тем, какой продукт наиболее выгоден для производства. Возможно получение препарата с высоким содержанием астаксантина (более 2 мг/г СБ), но в таком препарате внутриклеточное содержание сырого протеина будет менее 20%, а рынок сбыта - только производство красной рыбы. Возможно получение препарата, содержащего не менее 0,5 мг/г СБ астаксантина, но при этом содержание сырого протеина в клетках будет не менее 50%. Такой препарат можно использовать и при кормлении красной рыбы и при кормлении других сельскохозяйственных животных (особенно молодняка и элитных особей). Для того чтобы найти оптимальную концентрацию пероксида водорода, обеспечивающую содержание астаксантина не менее 0,5 мг/г СБ, необходимо повторить данный эксперимент с выбором другого диапазона значений концентрации пероксида водорода, используя концентрацию пероксида водорода менее 8%. а б в г Рисунок 1. Кривые эффектов факторов эксперимента Проведенные исследования показали, что для индукции синтеза астаксантина можно использовать не свет, а синглетный кислород, полученный в результате действия химического окислителя.