Protective antimicrobial coverings containing amber and propolis

全文:

Введение Огромное количество средств и способов предотвращения коррозии различных поверхностей свидетельствует о перманентной актуальности проблемы и отсутствии ее универсального решения. Например, в закрытых объемах с замкнутыми системами длительного жизнеобеспечения, совершенно непригодны средства защиты поверхностей, с включенными в их состав летучими растворителями, ароматическими веществами или синтетическими компонентами, представляющими опасность для человека. Известны препараты, претендующие на универсальность и безопасность [1], однако в ряде случаев более приемлемы композиции натуральных веществ в форме, позволяющей легко наносить безвредные защитные антикоррозионные покрытия. В качестве активных компонентов таких покрытий весьма перспективны природные смолоподобные вещества, в частности, янтарь и прополис. Материалы и методы Янтарь – ископаемая смола предка современной сосны, произраставшей на Земле около 50 миллионов лет назад. Смола отлично сохранилась не испытав за это время биотрасформации, так как непригодна в качестве источника углерода для питания бактерий [2]. Янтарь частично растворяется в спирте, эфире, скипидаре, горячих растительных маслах [3]. Плавится янтарь при температуре около 375°С. [4]. Для приготовления защитных покрытий использовали мелкую фракцию природного янтаря, измельченного на конической механической мельнице до размеров от 10 до 100 мкм, а также мелкодисперсный порошок янтаря с размерами частиц 1-10 мкм, полученный на мельнице – активаторе планетарного типа АГО-2С. Прополис – смолоподобное вещество и активно вырабатываемое и применяющееся пчелами в качестве антибактериального покрытия в ульях [5]. Обладает выраженными антисептическими свойствами, защищает от многих грибков, бактерий и вирусов. Разжижается при температуре, превышающей 65-70°С. Растворимость прополиса в воде незначительная и даже при нагревании в кипящей водяной бане не превышает 5%. Прополис растворяется в этиловом спирте, в петролейном эфире, в животных и растительных маслах и др. Бактерицидное действие прополиса распространяется практически на всех возбудителей болезней человека и животных и проявляется при довольно малых концентрациях [6]. Эти и некоторые другие смолоподобные вещества, обладающие антимикробной активностью [7, 8, 9], благодаря своим уникальным, полезным для человека и животных свойствам нашли применение в медицине, ветеринарии, косметологи [10, 11]. Льняное масло, использованное в качестве одного из возможных растворителей, относится к быстросохнущим маслам, легко полимеризуется в присутствии кислорода воздуха с образованием прочной прозрачной пленки. Льняное масло, разогретое до 140 ºС и выше, традиционно используется для размягчения янтаря и приготовления янтарного лака [12]. Ультразвуковое воздействие – с частотой 22 кГц и плотностью мощности 1 -10 Вт/см3 использовалось для ускорения процессов растворения и гомогенизации при изготовлении препаратов янтаря и прополиса [13]. В качестве источника ультразвука использовали ультразвуковой генератор УЗГ 13-0,1/22 с пьезокерамическим излучателем и акустическим концентратором. Янтарный лак. Для получения янтарного лака небольшие кусочки (3-5 мм) янтаря в течение 10 мин. размалывали, после чего до 40% измельченного до 1-10 мкм и отсеянного продукта растворяли в горячем (140 - 1500С) льняном масле, помешивая в течение часа, и дополнительно подвергали ультразвуковой обработке (5-10 мин) до полного растворения янтаря и гомогенизации раствора. Образовавшуюся коричневато-золотистую массу процеживали через металлическое сито с калиброванными отверстиями, размером ~ 6 мкм и разбавляли Уайт-спиритом (нефрас-С4-155/200) и/или скипидараром. Таблица 1 Составы янтарного лака Состав Компонент Композиции, в % 1 2 3 4* 5* Уайт-спирит 0 – 20 20-30 20-30 10 10 Янтарь измельченный 30 30 30 40 40 Скипидар 0 – 20 - - - - Льняное масло 50 - - 50 50 Олеиновая кислота - 40-50 - - - Олеиловый спирт - - 40-50 - - *Композиции 4 и 5 различаются последовательностью добавления компонентов. При изготовлении композиции 4, в заранее прокипяченное при Т=130-1500С льняное масло добавляли измельченный янтарь и растворяли при температуре Т=130-1500С в течение часа, затем охлаждали и добавляли Уайт-спирит, после чего подвергали ультразвуковой обработке. Для приготовления композиции 5, льняное масло и Уайт-спирит кипятили совместно при Т=130-1500С, постепенно добавляя измельченный янтарь небольшими порциями и помешивая полученную суспензию в течение часа, после чего подвергали ультразвуковой обработке, Таблица 2. Составы антимикробных карандашей Состав Компонент Композиции, в % 1 2 3 4 5 Воск 30 25 20 10 - Янтарь измельченный 30 - 30 30 30 Скипидар 40 - 10 30 - Льняное масло - 50 40 30 40 Прополис - 20 - - 30 Глицерин - 5 - - - Карандаши антимикробные. Для изготовления антимикробных карандашей использовали пчелиный воск (в качестве основы), прополис, измельченный янтарь (в качестве основного действующего ингредиента), а также пластифицирующие добавки для придания карандашам необходимых физических свойств (сопротивления нажиму, однородности, хорошей намазываемости, высвобождения активных веществ, оптимального контакта (мягкий мазок), оставляющего ровный, сплошной слой на поверхности). Микробиологический контроль Для оценки способности приготовленных композиций противодействовать росту и развитию микроорганизмов исследовали их влияние на Aspergillus niger, Penicillum funiculosum, Trichoderma viride, Fusarium culmorum, Candida albicans, Bacillus subtilis, Bacillus turingensis, культивируемые на стандартных средах: питательном агаре с мальц экстрактом (плотная среда), среде Эванса, среде Чапека. Для определения антимикробной активности исследуемых, содержащих янтарь образцов использовали два различных метода. Первый – диско-диффузионный метод (ДДМ), с высевом на чашки Петри, содержавшие питательную среду Эванса для культивирования микроорганизмов [14]. Бактерицидное действие определяли по величине зоны ингибирования роста газона на плотных средах вокруг дисков диаметром 10 мм и толщиной 5 мм, нарезанных из образцов карандашей. Для этого не позднее, чем через 15 мин. после заражения тем или другим штаммом микроорганизмов (Bacillus subtilis, Bacillus turingensis, Candida albicans), на поверхность питательной среды стерильным пинцетом помещали и слегка прижимали диски с таким расчетом, чтобы между поверхностью дисков и средой не оставалось пузырьков воздуха, а расстояние между дисками и также между ними и стенками чашки было не менее 15-20 мм. После этого чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 38°С в течение 48 - 120 ч. Влияние янтарного лака исследовали тем же способом, но вместо дисков использовали заготовки образцов в виде кусочков пропитанной лаком и высушенной в ламинарном шкафу в течение суток капроновой ткани, натянутой на миниатюрные пяльцы. Второй – по задержке роста при выращивании микроорганизмов на жидких питательных средах по изменению их оптической плотности. Посевы инкубировали в термостате при температуре 38°С. В среду добавляли глюкозу и разливали по 5 колбам объёмом 200 мл каждая. В первую колбу добавляли 2 грамма янтаря с частицами размером 3-5 мм, во вторую - 4 грамма янтаря с теми же размерами частиц, в третью и в четвёртую - высушенную ткань, пропитанную янтарным лаком. Культуру Bacillus subtilis, разводили в 10 мл глюкозы и добавляли в каждую из пяти колб. Колбы с образцами и контрольную колбу ставили на качалку (180 оборотов при t – 38°С) на сутки. Оптическую плотность суспензии измеряли на спектрофотометре DU 800 при λ=650 нм. Для сранения готовили стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащий примерно 1,5·108 КОЕ/мл. Для определения фунгицидной активности исследуемых, содержащих янтарь образцов использовали метод испытания защитных свойств янтарного лака по отношению к плесневым грибам (Aspergillus niger, Penicillum funiculosum, Trichoderma viride, Fusarium culmorum), который реализовали в соответствии с ГОСТ [15, 16]. Для этого контрольные образцы ткани, укрепленные в пяльцах, и образцы ткани, пропитанные янтарным лаком, помещали в эксикатор с небольшим количеством воды на дне для поддержания влажности. Над поверхностью воды на расстоянии 3-5 см на подставке устанавливали чашки Петри с культурами грибов, над которыми на расстоянии 7-10 см помещали исследуемые образцы. Закрытые эксикаторы выдерживали в течение 30, 45 или 60 суток при температуре 18-22 °С , после чего оценивали грибостойкость защитных покрытий по степени развития плесневых грибов на обработанных и необработанных поверхностях. Результаты и обсуждения Результаты испытаний защитных свойств янтарных лаков и карандашей показали их высокую активность и способность противодействовать росту и развитию различных бактериальных, дрожжеподобных культур и культур грибов (таблицы 3 и 4). Из представленных в таблицах 3 и 4 данных следует, что антимикробная активность пропитанных янтарным лаком тканей достаточно высока, по крайней мере, в отношение исследованных штаммов. Наибольшая активность янтаря проявляется в случае использования мелкодисперсной фракции в композициях 4 и 5, в состав которых, кроме янтаря, входит льняное масло с небольшим добавлением Уайт-спирита. Таблица 3. Сравнительная антимикробная активность лаковых композиций Состав* Культура 1 2 3 4 5 Контроль Антимикробная активность. (Зоны задержки роста бактериальных культур и дрожжеподобных грибов, мм) Candida albicans 2±0,5 2±0,5 1,5±0,5 2,5±0,5 2,5±0,5 0 Bacillus subtilis 3±0,5 3±0,5 3,5±0,5 4±0,5 4±0,5 0 Bacillus turengensis 3,5±0,5 2,5±0,5 4,5±0,5 4,5±0,5 4,5±0,5 0 Диаметр зон задержки роста, измеренный с точностью до 0,5 мм. Рост бактериальных культур оценивался диско-диффузионным методом (ДДМ), по зонам задержки роста культуры вокруг исследуемых дисков. *Составы соответствующих антимикробных композиций приведены в таблице 1. Таблица 4. Сравнительная фунгицидная активность лаковых композиций Состав* Культура 1 2 3 4 5 Контроль Фунгицидная активность, баллы Penicillum culmorum 2 0 0 0 0 5 Aspergillus niger 0 1 0 0 0 5 Trichoderma viride 0 0 0 0 0 4 Fusarium culmorum 0 0 2 0 0 5 * Составы соответствующих антимикробных композиций приведены в таблице 1. **Фунгицидную активность оценивали, определяя грибостойкость по степени развития плесневых грибов в соответствии с ГОСТ 9.049-91: 0 - материал не является питательной средой (нейтрален или фунгистатичен) 1, 2 – материал содержит питательные вещества, которые обеспечивают незначительное развитие грибов. 3, 4, 5 – материал содержит достаточное количество питательных веществ, благоприятствующих развитию грибов. а б Рисунок 1 – Диски карандашей с янтарем, засеянные культурой Bacillus subtilis, d=10 мм на разных средах: а- питательный агар, б- сусло-агар. После окончания инкубации на 7-ые сутки измеряли зоны задержки роста на чашках, при этом ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Как следует из представленных в таблицах 5 и 6 данных, наибольшая активность янтаря проявляется в случае использования его мелкодисперсной фракции при приготовлении карандаша (композиция 1) в состав которого, кроме янтаря, входят льняное масло, воск и скипидар, а также карандаша (композиция 5), в состав которого входит измельченный янтарь и льняное масло с добавлением прополиса. Таблица 5 Сравнительная антимикробная активность янтарных карандашей Состав* Культура 1 2 3 4 5 Кон-троль Антимикробная активность (Зоны задержки роста бактериальных культур и дрожжеподобных грибов, мм) Candida albicans** 6,5±0,5 8,5±0,5 6,5±0,5 7,5±0,5 6±0,5 1±0,5 Bacillus subtilis** 8,5±0,5 10,5±0,5 10,5±0,5 9,5±0,5 4±0,5 0 Bacillus turengensis** 5,5±0,5 9,5±0,5 9,5±0,5 6,5±0,5 4,5±0,5 1±0,5 Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 0,5 мм. Рост бактериальных культур оценивался диско-диффузионным методом (ДДМ), по зонам задержки роста культуры вокруг исследуемых дисков. *Составы соответствующих антимикробных композиций приведены в таблице 2. Таблица 6 Сравнительная фунгицидная активность янтарных карандашей Состав* Культура 1 2 3 4 5 Кон-троль Фунгицидная активность, баллы Penicillum culmorum 2 4 3 4 1 5 Aspergillus niger 2 5 4 4 3 4 Trichoderma viride 3 3 3 3 2 4 Fusarium culmorum 2 4 5 3 3 5 *Составы соответствующих антимикробных композиций приведены в таблице 2. **Фунгицидную активность оценивали, определяя грибостойкость по степени развития плесневых грибов в соответствии с ГОСТ 9.049-91: 0 - материал не является питательной средой (нейтрален или фунгистатичен) 1, 2 – материал содержит питательные вещества, которые обеспечивают незначительное развитие грибов. 3, 4, 5 – материал содержит достаточное количество питательных веществ, благоприятствующих развитию грибов. Таблица 7 Оценка антимикробной активности заготовок, пропитанных янтарным лаком, погруженных в жидкие питательные среды, по изменению их оптической плотности Исследуемые образцы D при λ=650 нм КОЕ/мл. Среда с культурой Bacillus subtilis 0,125 1,5·108 Среда с культурой Bacillus subtilis и с янтарем молотым с размером d=1-10 мкм 0,3 3,6·108 Среда с культурой Bacillus subtilis и с янтарем в кусочках, размером 3-5 мм и весом 2 г. 0,41 4,92·108 Среда с культурой Bacillus subtilis и с янтарем в кусочках, размером 3-5 мм и весом 4 г. 0,42 5,04·108 Среда с культурой Bacillus subtilis и с заготовкой, пропитанной янтарным лаком, c концентрацией янтаря 40% 0,71 8,52·108 Среда с культурой Bacillus subtilis и с заготовкой, пропитанной янтарным лаком, c концентрацией янтаря 20% 0,76 9,12·108 Для определения бактерицидного действия природной формы янтаря в кусочках с размерами 3-5мм и заготовок, пропитанных янтарным лаком, использовали культуру бактерий Bacillus subtilis в жидкой среде с оптической плотностью D = 0,6 при длине волны λ= 650 нм. Из таблицы 7 следует, что наименьшее обрастание обеспечивала введенная в среду природная форма янтаря в кусочках с размерами 3-5 мм. В остальных случаях наблюдался заметный рост культуры бактерий Bacillus subtilis. Возможно, этот эффект обусловлен отсутствием прямого контакта в жидкости между янтарем и клетками микроорганизмов, находящихся в среде, благоприятной для их роста, а янтарь не оказывают видимого влияния, так как практически в водной среде не растворяется (таблица 7). Для исследования защитных по отношению к грибам свойств использовали заготовки, пропитанные янтарным лаком по методике, описанной выше. Параллельно делали посев культур Aspergillus niger, Penicillum funiculosum, Trichoderma viride, Fusarium culmorum и помещали в эксикатор на месяц. Полученные данные по определению фунгицидной активности приведены в таблице 8. Таблица 8. Сравнительная фунгицидная активность янтарного лака, в баллах Состав* Культура 1 2 3 4 5 Контроль Aspergillus niger 0 0 0 0 5 Penicillum funiculosum 0 0 0 0 5 Trichoderma viride 0 0 0 0 0 4 Fusarium culmorum 0 0 0 0 0 5 *Составы соответствующих композиций приведены в таблице 1. Фунгицидную активность оценивали, определяя грибостойкость по степени развитии плесневых грибов в соответствии с ГОСТ 9.049-91: а в б Рисунок 2 – Проверка фунгицидной активности исследуемых заготовок, пропитанных янтарным лаком, в эксикаторе: а – чашка Петри, засеянная культурой на первом ярусе эксикатора, б- образцы ткани на пяльцах, пропитанные янтарным лаком, находящиеся на втором ярусе эксикатора, в – вид эксикатора сбоку Результаты исследований (рисунок 2) выявили способность янтаря предотвращать рост и распространение грибов Aspergillus niger, Penicillum funiculosum, Trichoderma viride, Fusarium culmorum. Проведенные данные свидетельствуют о том, что содержащие янтарь карандаши и лаки оказывают фунгицидное и бактериостатическое действие, различное по эффективности в зависимости от составов и концентрации ингредиентов в этих карандашах и лаках, и могут применяться для защиты поверхностей от бактериальных пленок и плесеней. Лак при высыхании образует эластичную плёнку, на которой микроорганизмы в дальнейшем не закрепляются. Карандаши позволяют равномерно покрывать поверхности защитным слоем, не выделяя при этом паров растворителей. Карандаши и лаки, содержащие янтарь и прополис оказывают заметный фунгицидный эффект в отношении грибов рода Aspergillus niger, Penicillum funiculosum, Trichoderma viride, Fusarium culmorum и ярко выраженный бактерицидный эффект отношению к Bacillus subtilis. Следует, однако, отметить, что янтарные композиции в ряде случаев ускоряют рост культуры Сandida albicans при концентрациях янтаря в них от 20 до 30%. Оптимальное сочетание компонентов, обеспечивающих выраженный антимикробный эффект лаковых форм (состав 4) обеспечивается за счет включения в их состав измельченного янтаря – 40%, льняного масла – 50% и Уайт – спирита – 10%. Оптимальный состав карандашей - измельченного янтаря – 30%, скипидара – 40%, воска – 30%, либо измельченного янтаря – 30%, прополиса – 40%, льняного масла – 30%. Ряд новых препаратов, отличающихся по форме и содержанию натуральных действующих веществ, создает необходимое разнообразие, обеспечивающее оптимальный выбор средств для решения конкретных задач по защите поверхностей от микрофлоры.

作者简介

V. Akopyan

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Dr. Sc.

M. Bambura

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Email: mariya-bambura@yandex.ru
Ph.D

V. Filatova

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

A. Afonin

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

参考

补充文件