Phytotoxicity assessment of copper and getting stress-resistant dicotyledonous

详细

The phytotoxicity of copper for whole plants and callus cultures of plurannual flax (LinumperenneL.) and Chrysanthemumcarinatum L. was estimated. Selective concentration of copper for these plants was determined. As well as the schemes of selection for resistance to copper regenerated plants were discribed.

全文:

Высокий уровень загрязненности почв тяжелыми металлами (ТМ) в мегаполисах негативно сказывается на городских растениях, в частности на травянистых, декоративных, красивоцветущих растениях, вызывает повреждение тканей, вытянутость клеток корней. При прямом попадании высоких концентраций данного металла на надземные органы растений, наблюдается скручивание и опадание листьев, молодые листья приобретают темно-зеленую окраску [1]. Наиболее восприимчивы к избытку меди молодые ткани и органы [2]. Повышенные концентрации меди в почве не только существенно снижают декоративные качества декоративных растений, но и могут приводить к гибели растений [3]. Среди способов решения данной проблемы – получение растений [4], устойчивых к солям меди, с помощью биотехнологических методов. Цель работы – оценка влияния меди в условиях in vivo и in vitro для льна многолетнего (Linum perenne L.) и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.) и получение растений, толерантных к повышенному содержанию меди в окружающей среде. Материалы и методы В работе использованы семена льна многолетнего (Linum perenne L.), сорт Синий Шелк и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.), сорт Эльдорадо. В качестве эксплантов использовали семена растений. Для получения устойчивых клонов каллусы культивировали на жидких питательных средах Мурасиге-Скуга (МС) и Гамборга (В5) [5-6], содержащих медь в различных концентрациях. В питательную среду вносили токсикант в концентрациях от 10 до 100 мг/л (в пересчете на чистый металл) и культивировали в течение 14 - 30 суток, в зависимости от вида растения. Оценку фитотоксичности меди in vivo проводили в нестерильных условиях, путем проращивания семян в растворах с медью на чашках Петри. Измеряли длину проростков, через 7 и 14 суток от начала опыта. Результаты и обсуждения Оценка фитотоксичности меди в условиях in vivo. Большинство декоративных травянистых растений не устойчивы к действию меди [4], как одному из самых токсичных ТМ. Была определена чувствительность к меди льна многолетнего и хризантемы килеватой. Для оценки фитотоксичности меди, семена растений проращивали в растворе с токсикантом в течение 14 суток, токсическое действие данного металла существенно проявлялось при прорастании семян и было заметно уже через 7 суток. Ингибирование роста растений наблюдалось при концентрации меди 20 мг/л (в пересчете на чистый металл), а при концентрация 50 мг/л прирост составлял менее 40% у хризантемы килеватой, при концентрации 100 мг/л меди у растений не образовывались корни (рисунок 1). Рисунок 1 – Влияние меди на рост побегов в водном растворе через 14 суток Данные растения продемонстрировали очень высокую чувствительность к меди, по сравнению с рядом ранее исследуемых травянистых растений (представителями семейств злаковые, крестоцветные, бобовые и др.), наибольшей чувствительностью обладал лен многолетний. Следовательно, данные красивоцветущие растения чувствительны к относительно низкому уровню загрязнения почв медью. Оценка фитотоксичности меди в условиях in vitro. Для проведения клеточной селекции нужно было определить чувствительность каллусных культур льна многолетнего сорт Синий Шелк и хризантемы килеватой сорт Эльдорадо к токсиканту и выбрать селективную концентрацию для получения устойчивых растений. Для оценки фитотоксичности меди в культуре клеток каллусы помещали на питательную среду с медью. Действие ионов меди было заметно через 14 суток, часть каллусов приобретало желтую или коричневую окраску. Ингибирующие действие меди проявилась для всех растений уже при концентрации 10 мг/л, а на среде с 40 мг/л значительная часть каллусов желтела и становилась менее плотной, в отличие от контроля. На высоких концентрациях меди (50 мг/л и 100 мг/л) каллус темнел через несколько дней и терял морфогенную активность, лишь у незначительной части каллуса наблюдался небольшой прирост биомассы (рисунок 2). Несмотря на большую чувствительность целых растений льна многолетнего (рисунок 1), культивируемые ткани льна были более устойчивы к меди, чем каллусы хризантемы килеватой. Например, при концентрации меди 30 мг/л процент выживших каллусов составлял 59,1%. Концентрация меди 100 мг/л была летальной для каллусов хризантемы килеватой. В следующем пассаже процент гибели каллусов резко возрастал у всех растений (рисунок 3). Рисунок 2 – Влияние меди на выживаемость каллусов (процент от контроля) Затем выжившие каллусы отбирали и вновь помещали на среду с медью. Таким образом, при концентрации 20 мг/л меди у хризантемы килеватой и у льна многолетнего, после культивирования в течение 2 пассажей, выживала и сохраняла регенерационную способность только небольшая часть каллусов. При концентрации меди 30 мг/л, процент выживших каллусов и регенерационная способность, после 2 пассажей, был незначительный, концентрация меди 50 мг/л была летальной для обоих растений (диаграмма 3). Таким образом, каллусные ткани льна многолетнего и хризантемы килеватой продемонстрировали очень высокую чувствительность к ионам меди, большую, чем у каллусов Arabidopsis thaliana и Agrostis stolonifera. Рисунок 3 – Влияние меди на выживаемость каллусов исследуемых растений, во 2-м пассаже (процент от контроля) В качестве селективной была выбрана концентрация меди 20 мг/л для льна многолетнего и хризантемы килеватой. Полученные данные позволили нам разработать схемы клеточной селекции для исследуемых растений. Получение клонов и растений, устойчивых к меди. Для отбора резистентных линий была использована прямая схема селекции. Схема клеточной селекции для льна многолетнего включает в себя получение эксплантов из семян на среде для каллусообразования В5 с 6 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивирование первичного каллуса на среде МС с 20 мг/л меди в течение 2 пассажей; затем, культивирование и регенерация каллусов на питательной среде В5 с 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК), в течение 3 пассажей, и укоренение на среде ½ МС с 0,1 мг/л НУК без токсиканта. Учитывая очень высокую токсичность меди для хризантемы килеватой, а также для сохранения регенерационной способности клеток, был выбран короткий период культивирования каллусов на питательной среде с токсикантом (3 пассажа по 14-18 суток). Схема селекции включала в себя получение эксплантов из семян на среде для каллусообразования МС с 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты; культивирование первичного каллуса на среде МС с 20 мг/л меди в течение 3 пассажей; и затем культивирование каллусов, в течение 4 пассажей, на средах для регенерации ½ МС с 0,5 мг/л БАП и укоренение ½ МС с 0,1 мг/л НУК без токсиканта. Использование прямой схемы клеточной селекции и добавление токсиканта в питательную среду только на этапе культивирования каллусов, позволило получит нам растения-регенеранты. Было получено 30 регенерантов льна, толерантных к меди, в условиях in vitro и 21 растение хризантемы килеватой. Таким образом, нами было показано, что исследуемые объекты очень чувствительны к меди как на уровне целых растений, так и в культуре клеток. Разработаны схемы клеточной селекции для получения декоративных двудольных растений, устойчивых к меди.