Оценка фитотоксичности меди и получение стресс-устойчивых двудольных растений

Аннотация

Оценена фитотоксичность меди для целых растений и каллусных культур льна многолетнего (LinumperenneL.) и хризантемы килеватой (Chrysanthemumcarinatum L.). Определена селективная концентрация меди для этих растений, а также разработаны схемы селекции для получения устойчивых к меди растений-регенерантов.

Полный текст

Высокий уровень загрязненности почв тяжелыми металлами (ТМ) в мегаполисах негативно сказывается на городских растениях, в частности на травянистых, декоративных, красивоцветущих растениях, вызывает повреждение тканей, вытянутость клеток корней. При прямом попадании высоких концентраций данного металла на надземные органы растений, наблюдается скручивание и опадание листьев, молодые листья приобретают темно-зеленую окраску [1]. Наиболее восприимчивы к избытку меди молодые ткани и органы [2]. Повышенные концентрации меди в почве не только существенно снижают декоративные качества декоративных растений, но и могут приводить к гибели растений [3]. Среди способов решения данной проблемы – получение растений [4], устойчивых к солям меди, с помощью биотехнологических методов. Цель работы – оценка влияния меди в условиях in vivo и in vitro для льна многолетнего (Linum perenne L.) и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.) и получение растений, толерантных к повышенному содержанию меди в окружающей среде. Материалы и методы В работе использованы семена льна многолетнего (Linum perenne L.), сорт Синий Шелк и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.), сорт Эльдорадо. В качестве эксплантов использовали семена растений. Для получения устойчивых клонов каллусы культивировали на жидких питательных средах Мурасиге-Скуга (МС) и Гамборга (В5) [5-6], содержащих медь в различных концентрациях. В питательную среду вносили токсикант в концентрациях от 10 до 100 мг/л (в пересчете на чистый металл) и культивировали в течение 14 - 30 суток, в зависимости от вида растения. Оценку фитотоксичности меди in vivo проводили в нестерильных условиях, путем проращивания семян в растворах с медью на чашках Петри. Измеряли длину проростков, через 7 и 14 суток от начала опыта. Результаты и обсуждения Оценка фитотоксичности меди в условиях in vivo. Большинство декоративных травянистых растений не устойчивы к действию меди [4], как одному из самых токсичных ТМ. Была определена чувствительность к меди льна многолетнего и хризантемы килеватой. Для оценки фитотоксичности меди, семена растений проращивали в растворе с токсикантом в течение 14 суток, токсическое действие данного металла существенно проявлялось при прорастании семян и было заметно уже через 7 суток. Ингибирование роста растений наблюдалось при концентрации меди 20 мг/л (в пересчете на чистый металл), а при концентрация 50 мг/л прирост составлял менее 40% у хризантемы килеватой, при концентрации 100 мг/л меди у растений не образовывались корни (рисунок 1). Рисунок 1 – Влияние меди на рост побегов в водном растворе через 14 суток Данные растения продемонстрировали очень высокую чувствительность к меди, по сравнению с рядом ранее исследуемых травянистых растений (представителями семейств злаковые, крестоцветные, бобовые и др.), наибольшей чувствительностью обладал лен многолетний. Следовательно, данные красивоцветущие растения чувствительны к относительно низкому уровню загрязнения почв медью. Оценка фитотоксичности меди в условиях in vitro. Для проведения клеточной селекции нужно было определить чувствительность каллусных культур льна многолетнего сорт Синий Шелк и хризантемы килеватой сорт Эльдорадо к токсиканту и выбрать селективную концентрацию для получения устойчивых растений. Для оценки фитотоксичности меди в культуре клеток каллусы помещали на питательную среду с медью. Действие ионов меди было заметно через 14 суток, часть каллусов приобретало желтую или коричневую окраску. Ингибирующие действие меди проявилась для всех растений уже при концентрации 10 мг/л, а на среде с 40 мг/л значительная часть каллусов желтела и становилась менее плотной, в отличие от контроля. На высоких концентрациях меди (50 мг/л и 100 мг/л) каллус темнел через несколько дней и терял морфогенную активность, лишь у незначительной части каллуса наблюдался небольшой прирост биомассы (рисунок 2). Несмотря на большую чувствительность целых растений льна многолетнего (рисунок 1), культивируемые ткани льна были более устойчивы к меди, чем каллусы хризантемы килеватой. Например, при концентрации меди 30 мг/л процент выживших каллусов составлял 59,1%. Концентрация меди 100 мг/л была летальной для каллусов хризантемы килеватой. В следующем пассаже процент гибели каллусов резко возрастал у всех растений (рисунок 3). Рисунок 2 – Влияние меди на выживаемость каллусов (процент от контроля) Затем выжившие каллусы отбирали и вновь помещали на среду с медью. Таким образом, при концентрации 20 мг/л меди у хризантемы килеватой и у льна многолетнего, после культивирования в течение 2 пассажей, выживала и сохраняла регенерационную способность только небольшая часть каллусов. При концентрации меди 30 мг/л, процент выживших каллусов и регенерационная способность, после 2 пассажей, был незначительный, концентрация меди 50 мг/л была летальной для обоих растений (диаграмма 3). Таким образом, каллусные ткани льна многолетнего и хризантемы килеватой продемонстрировали очень высокую чувствительность к ионам меди, большую, чем у каллусов Arabidopsis thaliana и Agrostis stolonifera. Рисунок 3 – Влияние меди на выживаемость каллусов исследуемых растений, во 2-м пассаже (процент от контроля) В качестве селективной была выбрана концентрация меди 20 мг/л для льна многолетнего и хризантемы килеватой. Полученные данные позволили нам разработать схемы клеточной селекции для исследуемых растений. Получение клонов и растений, устойчивых к меди. Для отбора резистентных линий была использована прямая схема селекции. Схема клеточной селекции для льна многолетнего включает в себя получение эксплантов из семян на среде для каллусообразования В5 с 6 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивирование первичного каллуса на среде МС с 20 мг/л меди в течение 2 пассажей; затем, культивирование и регенерация каллусов на питательной среде В5 с 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК), в течение 3 пассажей, и укоренение на среде ½ МС с 0,1 мг/л НУК без токсиканта. Учитывая очень высокую токсичность меди для хризантемы килеватой, а также для сохранения регенерационной способности клеток, был выбран короткий период культивирования каллусов на питательной среде с токсикантом (3 пассажа по 14-18 суток). Схема селекции включала в себя получение эксплантов из семян на среде для каллусообразования МС с 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты; культивирование первичного каллуса на среде МС с 20 мг/л меди в течение 3 пассажей; и затем культивирование каллусов, в течение 4 пассажей, на средах для регенерации ½ МС с 0,5 мг/л БАП и укоренение ½ МС с 0,1 мг/л НУК без токсиканта. Использование прямой схемы клеточной селекции и добавление токсиканта в питательную среду только на этапе культивирования каллусов, позволило получит нам растения-регенеранты. Было получено 30 регенерантов льна, толерантных к меди, в условиях in vitro и 21 растение хризантемы килеватой. Таким образом, нами было показано, что исследуемые объекты очень чувствительны к меди как на уровне целых растений, так и в культуре клеток. Разработаны схемы клеточной селекции для получения декоративных двудольных растений, устойчивых к меди.