Influence of salinity on bioconcentration and genotoxicityof heavy metals for Asteria srubens L. sea stars

全文:

Введение Загрязнение тяжелыми металлами является одной из самых распространенных форм загрязнения морской среды [10]. Морская вода, обладая особыми физико-химическими свойствами, влияет на проявление токсических эффектов многих веществ, в том числе и тяжелых металлов. Множество факторов определяют биологическую активность содержащихся в морской воде веществ и условия существования морских организмов: соленость (S), рН, растворенный кислород, температура, содержание питательных веществ и твердых частиц [14]. При этом, рН и соленость являются основными переменными, которые определяют биодоступность и токсичность веществ, в том числе и тяжелых металлов, связанных с донными осадками и растворенными в морской воде. Изменения солености может влиять как на биологические эффекты токсикантов, так и на ответные реакции организмов [12]. Например, Сd становится более токсичным при снижении солености, в связи с переходом в форму свободных ионов [13]. Токсические эффекты Pb и Zn проявляются только при высоких концентрациях и меньше зависят от солености, так как присутствуют в воде в виде гидроксидов [16]. В природных условиях на организмы одновременно действуют несколько факторов, эффекты которых не являются простой суммой отдельных эффектов. Вместе с тем, химические вещества, входящие в состав смеси, при комбинированном воздействии, могут изменять свою биологическую активность и оказывать более выраженный токсический эффект [17]. Наибольший риск усиления токсического эффекта можно ожидать при комбинированном воздействии структурно-родственных химических соединений или веществ с близким механизмом действия. Поэтому в данной работе выбрана смесь наиболее значимых загрязнителей морской среды из числа тяжелых металлов. В ходе исследований изучена биоконцентрация (поступление веществ из воды) металлов и генотоксичность при действии смеси железа, свинца, меди и кадмия на представителей типа иглокожие (Echinodermata) морских звезд Asterias rubens Linnaeus, 1758. Использование иглокожих связано с их высокой экологической значимостью в морских экосистемах и эволюционной близостью к хордовым за счет единой эволюционной ветви вторичноротых животных [3]. Строение тела морских звезд обеспечивает ток воды, которая напрямую воздействует на клетки, находящиеся в целомической полости [18]. Цель данной работы - оценить влияние солености на генотоксичность и биодоступность смеси металлов (Zn2+, Fe3+, Cd2+, Cu2+) для морских звезд Asterias rubens. Задачами работы являются оценка уровней биоконцентрации металлов и образования микроядер в клетках целомической жидкости при нормальной для данного региона солености (25,7‰) и наиболее низкой (21‰), в эстуариях, где встречаются морские звезды. Микроядра (Мя) образуются из участков хромосом при нарушениях митоза при делении клеток [11]. Материалы и методы Неповрежденные пятилучевые морские звезды Asterias rubens диаметром 66 - 100 мм для проведения экспериментов собирали в районе Беломорской биологической станции имени Н.А. Перцова, Мурманская область, Россия (66.55359° N, 033.10403° E). В восемь десятилитровых аквариумов помещали по 5 экземпляров морских звезд, в одной половине аквариумов поддерживалась соленость 21‰ (низкая соленость), в другой - 25,7‰ (нормальная соленость), температура воды составляла 15 °С ± 3 °С, с естественным освещением и суточным циклом. В аквариумы была добавлена смесь металлов в концентрациях согласно таблице 1. Длительность эксперимента составила 10 дней, воду меняли на половину объема раз в три дня. Таблица 1 Концентрации тяжелых металлов добавленных в воду ИИТ Fe, мг/л Pb, мг/л Cu, мг/л Cd, мг/л 0 0 0 0 0 100 2.5 0.25 0.025 0.0125 400 10 1 0.1 0.05 800 20 2 0.2 0.1 Для характеристики смеси металлов рассчитывали интегральный индекс токсичности (ИИТ) по следующей формуле [9]: ИИТ=, где [Fe, Pb, Cu, Cd] - концентрации металлов, мг/л, добавляемых в воду в ходе эксперимента; в знаменателях - ПДК для рыбохозяйственных водоемов соответствующих металлов, согласно СанПиНу 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод». Целомическую жидкость из морских звезд отбирали трижды (3, 7, 10 сутки эксперимента) шприцом на 1 мл с 21 мм иглой. Средний объем извлекаемой жидкости составлял 0,6 мл. Для подготовки препаратов клеток целомической жидкости 200 µ жидкости распределяли на предметном стекле. Предметные стекла просушивали на воздухе и фиксировали в метаноле в течение 15 мин с последующим окрашиванием раствором Романовского-Гимзы в течение 20 мин. Избыток красителя удаляли путем промывки дважды в дистиллированной воде и далее сушили на воздухе. Препараты просматривали под микроскопом с увеличением 90x, подсчитывали 1000 целомоцитов, определяли число клеток, содержащих микроядра. Микроядра (Мя) отличали от клеточных включений и гранул красителя по следующим признакам: Мя обычно имеют одинаковую интенсивность окрашивания с макроядром, но могут быть более интенсивно окрашены; Мя не связаны и не пересекаются с макроядрами; Мя не могут перекрываться; Мя не обладают рефракцией в отличие от многих артефактов, например, частиц красителя [7]. На 10-е сутки эксперимента по пять морских звезд из каждого аквариума высушивали при температуре 40 °C, измельчали и перемешивали, без разделения на отдельные органы. Навески 0,25 г образца растворяли в 10 мл смеси концентрированной соляной и азотной кислот (в соотношении 3:1), далее добавляли 3 мл хлорной кислоты и 3 мл фтористоводородной кислоты. Далее пробы разлагали в микроволновой печи, после чего отстаивали в течение суток и фильтровали. Концентрации металлов в морских звездах были проанализированы методом атомно-абсорбционной спектрометрии на Agilent ICP-MS 7500. Отношения между биологическими характеристиками морских звезд и концентрациями металлов оценивали с помощью линейной регрессии и корреляционного анализа. Для установления влияния солености на биоконцентрацию металлов использовали ковариационный анализ (ANCOVA). Различия между долей микроядер в клетках контрольных и экспериментальных морских звезд оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни [8]. Значимые различия доли микроядер при действии различных концентраций металлов и уровней солености определяли с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа [15]. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 20 и KyPlot 2.0. Величиная уровня значимости была установлена Р <0,05. Результаты 1. Биоконцентрация тяжелых металлов в морских звездах. Результаты регрессионного и ковариационного анализа содержания металлов в теле морских звезд и разных концентраций металлов, добавленных в ходе эксперимента в воду аквариумов представлены в таблице 2. Таблица 2 Результаты регрессионного и ковариационного анализа содержания ТМ Тип анализа Соленость, ‰ Критерий Железо Медь Свинец Кадмий 25.7 21 25.7 21 25.7 21 25.7 21 Регрессионный анализ R2 0.38 0.743 0.893 0.1 0.3 0.76 0.94 0.873 F 1.291 2.471 16.3 0.23 0.85 0.64 31.3 13.7 P 0.39 0.275 0.05* 0.68 0.45 0.12 0.03* 0.06* B 1.98±1.79 -1.82± 1.16 103.7± 25.3 22.9± 47.8 5.90± 6.38 12.2± 4.8 20.13± 3.60 6.65±1.79 Ковариационный анализ Соленость 1.18 (Р=0.36) 0.12 (Р=0.75) 0.28 (Р=0.87) 0.06 (Р=0.83) Метал добавленный в воду в ходе эксперимента 0.59 (Р=0.66) 2.01 (Р=0.29) 0.26 (Р=0.22) 3.83 (Р=0.15) R2 - коэффициент детерминации; F - критерийФишера; P - уровень значимости; B - коэффициент наклона; * - статистически достоверная линейная зависимость. Концентрация железа не увеличивалась, при увеличении содержаний этого металла в морской воде, что подтверждается результатами регрессионного анализа. Однако наблюдались различия в концентрациях железа в морских звездах при разной солености, содержащихся в аквариумах без добавления металлов (контроль) и при добавлении железа 2,5 мг/л. Естественные содержания железа в морских звездах в районе сбора материала (166,1±57,8 мг/кг) значительно выше концентраций железа, добавленного в воду аквариумов ходе эксперимента. Для пониженной солености наблюдаются отрицательные значения наклона прямой, что может свидетельствовать о выводе железа из тела морских звезд при понижении солёности. Для остальных металлов отмечается увеличение их содержания в морских звездах при увеличении их концентрации в воде, что показывает положительные значения коэффициента наклона (В). При этом высокий уровень биоконцентрации можно отметить для Pb и Cu. Содержание Pb в морских звездах после эксперимента в три раза превышало концентрации, добавленные в морскую воду в ходе эксперимента, а для Cu в 15 - 20 раз. Содержание Cd в морских звездах дозозависимо увеличилось при увеличении его концентрации в морской воде, однако не превысило его концентрацию в воде. Для кадмия и меди при солености 25,7‰, наблюдается статистически достоверная линейная зависимость между содержаниями металлов в теле морских звезд и концентрациями металлов, добавленных в воду в ходе эксперимента. Значения коэффициента наклона прямой для всех металлов, кроме свинца, показывают различия в уравнениях линейной регрессии для низкой и нормальной солености. Ковариационный анализ не показывает статистически достоверного влияния солености на биоконцентрацию металлов, что говорит о более сложных механизмах биоконцентрации металлов и процессах регуляции их содержания в теле морских звезд. 2. Образование микроядер. Результаты оценки доли микроядер в клетках целомической жидкости морских звезд представлены на рисунке 1. Рисунок 1. Доля клеток с микроядрами среди эозинофильных гранулоцитов. По оси абсцисс - значения ИИТ для нормальной и низкой солености на 3-и, 7-е и 10-е сутки эксперимента При солености 25,7‰ на 3 и 7 сутки эксперимента наблюдается дозозависимое увеличение доли клеток с микроядрами, что вызвано токсическим действием металлов, R2= 0,98, P<0,05 и R2= 0,92, P<0,05. На 10 сутки различий между долями микроядер в клетках в контрольном и экспериментальных аквариумах не наблюдается. При солености 21‰ дозозависимого эффекта увеличения генотоксичности не наблюдается в течение всего эксперимента. На препаратах со значениями ИИТ 400 и 800 на 3-и и 7-е сутки эксперимента наблюдается бактериальное заражение грамм-положительными палочковидными бактериями, после 10-ти суток наблюдаются фагоцитированные синие гранулы внутри клеток при микроскопировании образцов (см. рисунок 2). Рисунок 2. Эозинофильные гранулоциты морских звезд, окраска по Романовскому-Гимзе: A - микроядра к клетках, B - бактерии в целомической жидкости; C - клетка с гранулами в цитоплазме (10μ) Ковариационный анализ не показывает статистически достоверного влияния солености на долю микроядер в клетках целомической жидкости, что, вероятно, связано с недостаточным количеством повторов и, как результат, низкой мощностью анализа. Обсуждение и заключение Морская звезда Asterias rubens - массовый и широко распространенный бореальный вид, обитающий в условиях различной солености и антропогенной нагрузки, который может служить биоиндикатором качества морской среды среди организмов подвижной эпифауны, которые обуславливают 50% продукции и играют ключевую роль в круговороте тяжелых металлов в этих биотопах [14]. Как показано в наших предварительных экспериментах, 100% гибель морских звезд на третьи сутки эксперимента наблюдалась при значении ИИТ равном 3200. Линейный характер корреляции между содержаниями Cd и Cu в морской воде и теле морских звезд Asterias rubens позволяют использовать их как индикаторы загрязнения этими металлами. Аналогичные результаты получены в работе [4] на морских звездах из загрязненных областей Норвегии, однако отмечается выход на плато при накоплении Cd и описаны механизмы выведения этого металла из тела морских звезд [13]. Концентрации железа, добавляемые в воду в ходе экспериментов, были значительно ниже его содержаний в теле морских звезд. Это связано с высокими его содержаниями в месте сбора материала из-за хозяйственной деятельности биостанции. Можно говорить о высоких коэффициентах аккумуляции железа из донных осадков. Значимых различий между уровнями аккумуляции металлов при различной солености не выявлено, однако уравнения регрессии отличаются, что говорит о более сложном механизме действия солености на процессы биоконцентрации. В работах с морскими звездами из естественных местообитаний показаны различия биоаккумуляции металлов при различной солёности, что связано с различиями в самих местообитаний и пищевым рационом, так как основным путём поступления металлов в организм иглокожих является пищевой [2, 4]. На клеточном уровне наблюдалась адаптация к воздействию тяжелых металлов, при этом низкая соленость увеличивала токсический эффект металлов. На десятые сутки эксперимента наблюдалась адаптация к воздействию тяжелых металлов. В работе [6] не выявлено влияние различной солености (22, 25 и 30‰) на образование микроядер, а токсические эффекты на уровне клеток целомической жидкости связаны с воздействием только металлов. В нашем эксперименте отмечается кратковременное увеличение токсичности металлов, выраженное в увеличении доли микроядер в эозинофильных гранулоцитах и бактериальном заражении, что связано с совместным действием тяжелых металлов и низкой солености. На 10 сутки эксперимента клеточный иммунный ответ в условиях низкой солености восстанавливается, в результате чего внутри клеток обнаруживаются фагоцитированные бактериальные гранулы, а отдельные бактерии уже не обнаруживаются, также уменьшается генотоксичность, что вероятнее всего связано с накоплением белков, способных связывать свободные ионы металлов [12]. При воздействии тяжелых металлов и резкого снижения солености наблюдаются прямые цитогенетические эффекты (образование микроядер и бактериальное заражение). Далее, при более длительной экспозиции, можно предположить адаптацию, направленную на умещение токсических эффектов металлов за счет клеточных протекторных механизмов, что проявляется в отсутствии различий исследуемых характеристик с контрольными на 10 сутки эксперимента. В целомоцитах обнаружены белки, способные связывать металлы в хелатные комплексы и, далее, эти клетки выводятся через пищеварительную систему и органы выделения, способствуя детоксикации металлов и являясь эффективным инструментом их выведения из органов морских звезд [1, 16]. Высокая экологическая пластичность морских звезд Asterias rubens, которая обеспечивает широкое распространение и устойчивость к антропогенному воздействию обуславливает возможность их использования в качестве модельных организмов на большой территории и в условиях высоких уровней нагрузки. Полученные в ходе работы результаты (показано отсутствие различий в уровнях биоконцентрации металлов при разных уровнях солености, характерных для местообитаний морских звезд в Белом море и кратковременное усиление токсических эффектов металлов при понижении солености) позволят достоверно сравнивать биологические характеристики морских звезд, обитающих при разных уровнях солености в ходе экодиагностических исследований.

作者简介

A. Poromov

Moscow State University of Mechanical Engineering (MAMI)

Email: aap1309@gmail.com
7 910 480-38-80

A. Peretykin

Lomonosov Moscow State University

Email: aap1309@gmail.com
7 910 480-38-80

A. Smurov

Lomonosov Moscow State University

Email: aap1309@gmail.com
Dr. Sc., Prof; 7 910 480-38-80

参考

补充文件