Effect of cyclophosphamide on the balance of macroand micronutrients, and indicators of lipid peroxidation

Full Text

Введение Лекарственные препараты, используемые в клинике для терапии, например, онкозаболеваний (циклофосфамид, ЦФ) могут оказывать воздействие на системы и функции организма, в том числе, на баланс макрои микроэлементов и системы биоантиоксидантной защиты, регулирующие уровень свободных радикалов в организме [3, 5]. Канцеростатик ЦФ обладает широким спектром противоопухолевой активности и используется для химиотерапии при мелкоклеточном раке легкого, яичников, молочной железы, шейки и тела матки, мочевого пузыря, простаты и при нейробластомах [13]. ЦФ и его активные метаболиты проявляют мутагенные и цитотоксические эффекты в тканях организма [3, 13]. Мутагенные эффекты ЦФ широко известны и подтверждены наблюдением хромосомных аберраций, в частности, в клетках костного мозга или микроядер в эритроцитах периферической крови мышей [3]. Влияние ЦФ на уровень макрои микроэлементов в органах в комплексе с индикаторами перекисного окисления липидов (ПОЛ) еще недостаточно изучено. В последние годы активно исследуется роль баланса макрои микроэлементов в организме в поддержании здоровья и в патогенезе различных заболеваний [6, 912, 16-19]. Данные о содержании микроэлементов в органах под влиянием лекарственных средств могут дать информацию об активности ферментных систем антиоксидантной защиты, а уровень индикаторов ПОЛ об активности ПОЛ в биомембранах. ПОЛ принадлежит значительная роль в метаболизме, в поддержании постоянства внутренней среды организма и его адаптационных реакциях [14, 15, 20, 21]. В физиологических условиях свободнорадикальные процессы находятся под контролем ферментативных и неферментативных систем антиоксидантной защиты. При патогенезе или при действии ксенобиотиков, в частности, лекарственных средств, они могут выйти из под контроля систем антиоксидантной защиты. Это может привести к генерации активных форм кислорода, активации свободнорадикальных процессов, распаду метаболитов или гибели клетки [1, 14, 15, 21]. Активация свободнорадикальных реакций и ПОЛ рассматриваются как факторы индукции апоптоза, роста опухолей и многих других звеньев патогенеза заболеваний [4, 15, 21]. Методы определения индикаторов ПОЛ хорошо известны [1, 4]. В литературе, однако, имеется недостаточно сведений о влиянии канцеростатиков, в частности, ЦФ, на параметры ПОЛ и на баланс макрои микроэлементов в органах экспериментальных животных и человека [3, 4, 7]. Влияние ЦФ на уровень жизненно необходимых микроэлементов в комплексе с индикаторами ПОЛ в эксперименте было исследовано нами ранее [6]. Целью данной работы является комплексное изучение влияния циклофосфамида на баланс макроэлементов, условно жизненно необходимых и токсичных элементов, а также на уровень индикаторов ПОЛ через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения в широком интервале доз. Это исследование позволит получить информацию о том, насколько организм восстанавливается после приема этого канцеростатика. материал и методы исследования Эксперименты проведены на 48 белых беспородных лабораторных крысах обоих полов, в каждой группе по 8 крыс, по 4 самки и 4 самца, массой 230-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария и на стандартной диете. Первая группа интактные, вторая группа контрольная вводили внутрибрюшинно, однократно стерильную воду для инъекций. Животным 3-й 6-й групп в том же режиме вводили внутрибрюшинно, однократно циклофосфамид в дозах 20, 40, 60 и 80 мг/кг. Все реактивы и реагенты были марки ЧДА (чистые для анализа) или ХЧ (химически чистые). Для приготовления растворов циклофосфамида и для контрольного варианта использовали стерильную «воду для инъекций» (ОАО «Новосибхимфарм», г. Новосибирск) в ампулах. В работе исследовали влияние противоопухолевого лекарственного средства циклофосфамида (цФ, АО «Биохимик» г. саранск) [8]. для исключения влияния сезонных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были выполнены в зимний период. животных декапитировали через сутки под легким эфирным наркозом, быстро извлекали органы, которые замораживали с помощью жидкого азота. В изъятых органах определяли содержание макрои микроэлементов и индикаторы перекисного окисления липидов (ПОЛ) диеновые конъюгаты (ДК) и малоновый диальдегид (МДА) [1, 4]. Содержание макро и микроэлементов определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии на спектрометре Optima 2000 DV (PerkinElmer, США) в Центре биотической медицины, Москва, в головном мозге, почках и печени белых лабораторных крыс после внутрибрюшинного однократного введения ЦФ (40 мг/кг) и выражали в мкг/г [5, 10, 12]. Исследовали содержание пяти макроэлементов: кальций, фосфор, калий, натрий, магний; шести условно жизненно необходимых элементов: бор, кремний, никель, ванадий, мышьяк, литий и десяти токсичных элементов: олово, серебро, стронций, алюминий, свинец, кадмий, ртуть, бериллий, сурьма,лантан. Индикаторы ПОЛ. В изъятых органах головном мозге, сердце, печени, почках, надпочечниках, селезенке и тимусе крыс определяли уровень индикаторов ПОЛ ДК и МДА. Уровень ТБК-взаимодействующих продуктов (МДА) оценивали в органах в присутствии тиобарбитуровой кислоты [1, 4]. Статистический анализ. Оценку содержания макрои микроэлементов и индикаторов ПОЛ проводили с использованием медианы. Нижний и верхний пороговые уровни определяли как 2,5-й и 97,5-й персентили, соответственно [2]. В работе использовали уровень значимости p<0,05. Результаты и их обсуждение В наших экспериментах показано, что при сравнении содержания макрои микроэлементов и индикаторов ПОЛ ДК и МДА в органах крыс в интактной и контрольной группах достоверно не отличались. Поэтому в дальнейших экспериментах в качестве контроля мы использовали только одну контрольную группу животных, которым была введена стерильная вода для инъекций. На следующем этапе нами было исследовано содержание макро и микроэлементов и продуктов ПОЛ через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения ЦФ. Содержание макро и микроэлементов определяли при введении ЦФ в дозе 40 мг/кг (данные приведены только для кадмия, Рис. 1), а индикаторов ПОЛ в дозах 20, 40, 60 и 80 мг/кг (данные приведены только для дозы 60 мг/кг, Рис. 2 и 3). Микроэлементы и ЦФ. Любое отклонение в здоровье биологического организма сопровождается дисбаласном макрои микроэлементов [5, 9, 10]. Стабильность химического состава является одним из важнейших и обязательных условий нормального функционирования организма. Дефицит жизненно важных микроэлементов (селена, цинка, йода, марганца и др.) в организме или повышенная концентрация токсичных микроэлементов (ртути, свинца, мышьяка, сурьмы, кадмия и др.) в окружающей среде приводят к неблагоприятным последствиям для жизнедеятельности человека [10, 11, 19], в частности, к росту числа онкологических, аутоиммунных и дегенеративных заболеваний, заболеваний лимфатической системы, инфекционных патологий [5, 7, 17]. Главной функцией макроэлементов является построение тканей, поддержание постоянства осмотического давления, ионного и кислотно-основного состава [10, 11]. Для каждого элемента существует оптимальный диапазон концентраций для осуществления жизненно важных функций. При дефиците или избыточном накоплении элементов в организме могут происходить серьезные изменения, связанные с нарушением активности зависящих от них ферментов [5, 7, 10, 11, 16]. При срыве механизмов метаболической компенсации, то есть возникновении дизрегуляции, экзогенный дисэлементоз превращается в дизрегуляционный, А в Рисунок 1. Содержание кадмия (ордината, мкг/г) в головном мозге (А), печени (Б) и почках (В) крыс после внутрибрюшинного однократного введения циклофосфамида (40 мг/кг). Первый столбик: контроль интактные, второй столбик: контроль вода, третий столбик циклофосфамид. что приводит к переходу состояния предболезни в болезнь как стойкую, почти необратимую дизрегуляцию на системном уровне [5, 9, 11, 17]. Экзогенный дефицит до наступления этого периода проявляется только на молекулярном и клеточном уровне, а впоследствии на тканевом, органном и организменном уровнях [11]. Из наших результатов и данных, приведенных на рис. 1, следует, что после однократного введения ЦФ (40 мг/кг) в исследованных органах головном мозге, печени и почках содержание пяти макроэлементов: кальция, фосфора, калия, натрия и магния, шести условно жизненно необходимых элементов: бора, кремний, никель, ванадий, мышьяк, литий и девяти токсичных элементов: олово, серебро, стронций, алюминий, свинец, ртуть, бериллий, сурьма, лантан не изменяется по сравнению с контрольной группой крыс. Исключение составляют мышьяк (условно жизненно необходимый элемент) содержание которого достоверно уменьшается в почках и кадмий (токсичный микроэлемент) содержание которого достоверно уменьшается во всех исследованных органах (рис. 1). Циклофосфамид и ПОЛ. Развитие многих заболеваний рассматривается и с позиций мембранной патологии клетки [4, 14]. Одним из универсальных механизмов повреждения мембран является ПОЛ. В норме процесс свободнорадикального окисления удерживается на относительно низком стационарном уровне, благодаря присутствию в тканях биоантиоксидантов и нейрогуморальных регуляторных систем. Изменения их содержания и активности могут являться причинами усиления, либо ингибирования процессов ПОЛ [15, 20]. В связи с этим необходим надежный, легко воспроизводимый тест для определения продуктов ПОЛ. При перекисном окислении полиненасыщенных высших жирных кислот образуются молекулы с двумя сопряженными двойными связями (диеновые конъюгаты, ДК первичные продукты ПОЛ), что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения 233 нм; (молярный коэффициент экстинкции е = 2,2Ч0-5^М-исм-1) [1, 4]. Наиболее простым и адекватным способом оценки уровня ПОЛ является тест с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Известно, что ТБК может реагировать с липидами, аминокислотами, углеводами, однако основным продуктом, реагирующим с ТБК, является МДА вторичный продукт ПОЛ, образующийся при переокислении полиненасыщенных жирных кислот, имеющих 2-3 диеновые связи [1, 4]. Для получения представления об интенсивности свободнорадикальных реакций ПОЛ в органах животных мы определяли содержание ДК и уровень одного из наиболее важных конечных продуктов ПОЛ МДА в гомогенатах органов крыс. Активация ПОЛ, регистрируемая реакцией с тиобарбитуровой кислотой, как универсальный механизм повреждения, показана практически при всех патологических процессах в эксперименте и клинике [1, 4, 15, 21]. ПОЛ активируется при действии некоторых лекарственных средств, трансформирующихся в ходе реакций биотрансформации в свободные радикалы, что лежит в основе их токсического действия [3, 20]. В работе показано, что при введении ЦФ во всех исследованных дозах и во всех изученных органах крыс сердце, печени, почках, надпочечниках и селезенке уровень ДК и МДА достоверно не изменились (рис. 2). Исключение составляют тимус, в котором ЦФ достоверно увеличивает содержание ДК при концентрациях 60 и 80 мг/кг (Рис. 3) и головной мозг, в котором ЦФ в дозе 80 мг/кг достоверно увеличивает уровень МДА (данные не приведены). таким образом, в нашей работе показано, что циклофосфамид не изменяет содержание макроэлементов, условно жизненно необходимых и токсичных микроэлементов. Исключение составляют мышьяк и кадмий содержание которых уменьшается: As в почках и Cd во всех исследованных органах головном мозге, печени и почках. Циклофосфамид в исследованных дозах не оказывает влияние на интенсивность процессов перекисного окисления липидов в изученных органах крыс. мкмоль/кг 140.000 120.0 100,000 80,000 60,000 40.000 20.000 0,000 Н/п Печень Селезенка Почки Сердце Тимус Мозг рисунок 2. Содержание малонового диальдегида (ордината, мкмоль/кг) в органах крыс после внутрибрюшинного однократного введения циклофосфамида (60 мг/кг). Левый столбик: контроль вода, правый столбик: циклофосфамид. Н/п надпочечники. рисунок 3. Содержание диеновых конъюгатов (ордината, мкмоль/кг) в органах крыс после внутрибрюшинного однократного введения циклофосфамида (60 мг/кг). Левый столбик: контроль вода, правый столбик: циклофосфамид. выводы 1. Циклофосфамид в исследованных органах -головном мозге, печени и почках не изменяет содержание пяти макроэлементов: кальция, фосфора, калия, натрия и магния, шести условно жизненно необходимых элементов: бора, кремний, никель, ванадий, мышьяк, литий и девяти токсичных элементов: олово, серебро, стронций, алюминий, свинец, ртуть, бериллий, сурьма, лантан по сравнению с контрольной группой крыс. Исключение составляют мышьяк (условно жизненно необходимый элемент) содержание которого достоверно уменьшается в почках и кадмий (токсичный микроэлемент) содержание которого достоверно уменьшается во всех исследованных органах. 2. Циклофосфамид в исследованных дозах 20, 40, 60 и 80 мг/кг не влияет на перекисное окисление липидов в сердце, печени, почках, надпочечниках и селезенке крыс. Исключение составляют тимус, в котором циклофосфамид достоверно увеличил содержание диеновых конъюгатов при концентрациях 60 и 80 мг/кг и головной мозг, в котором циклофосфамид в дозе 80 мг/кг достоверно увеличил уровень малонового диальдегида. Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Казанского государственного медицинского университета (КГМУ) и Казанском (Приволжском) федеральном университете. Авторы благодарят профессора В.В. Семенова (КГМУ), сотрудников ЦНИЛ КГМУ, а также выпускников КГУК.У. Перес Бук, Р. Моралес, Г.А. Шайхуллиной и А.В. Гильман, за помощь в проведении экспериментов по определению индикаторов ПОЛ. Работа поддержана ЦНИЛ КГМУ, Центром биотической медицины, г. Москва и грантами КФУ 2011 г. Ф11-02 и КФУ/Минобрнауки РФ 2012-2014 г.г. № бюджет 12-26.

About the authors

M. Ja Ibragimova

A. V Skal’nyj

I. H Valeeva

M. G Skal’naja

L. Ja Sabirova

R. I Zhdanov

References

Supplementary files