Morphological assessment of adaptation of respiratory organs of the mice to the longterm radiation-chemical exposure in the recovery period

Full Text

Введение Члены экипажа космических кораблей при длительных полетах неизбежно подвергаются низким воздействиям радиационного фона, что может привести к патологии [1, 2, 3, 4, 5]. В последние годы принципиально изменились представления о реакциях организма на воздействие радиации в низких дозах. В отличие от радиации в больших дозах, которая вызывает существенные клинические нарушения и может привести к гибели организма, облучение низкой интенсивности не является летальным, но способно модифицировать клеточные и тканевые процессы, что приводит к изменению многих жизненно важных функций [3, 6]. При этом риск проявления отрицательных последствий длительного действия ионизирующего излучения низкой интенсивности в дозах, считавшихся безопасными, до сих пор обстоятельно не изучался. По существующим представлениям [7, 8] радиационно-индуцированные изменения в иммунокомпетентных клетках являются одной из причин нарушения иммунного надзора и развития отдаленных последствий облучения. В условиях влияния нескольких факторов (радиационных, химических) включаются резервные структурные механизмы, работающих по принципу адаптационных уровней [9, 10]. Повреждения наступают тогда, когда все механизмы защиты и адаптации задействованы, а резервы использованы. Известно, что дыхательные пути и легкие относятся к первичным защитным барьерам организма и являются одним из наиболее чувствительных и критических органов на ингаляционное действие химических веществ и внешнее у-облучение, обеспечивают инактивацию вредных веществ и детоксикацию организма. В результате комбинированных травм всего организма (ионизирующее излучение, химическое воздействие), приводящих к повреждению иммунной системы, вероятно, важную роль играет легочной иммунный ответ [2, 3, 4, 11]. В имеющихся немногочисленных экспериментальных исследованиях по моделированию изолированного и сочетанного воздействия радиационного и химического факторов космического полета [12, 13, 14] не проводились морфологические исследования структурных перестроек и адаптации трахеи, бронхов и легких при хроническом сочетанном радиационнохимическом воздействии в низких дозах. Предпринятые исследования на модели мышей в условиях космических летательных аппаратов представляются особенно важными для оценки адаптации и возможных последствий длительных космических полетов. Целью работы является исследование морфологических изменений органов дыхания у мышей в восстановительном периоде после хронического сочетанного радиационно-химического воздействия низкой интенсивности. Материал и методы Морфологические исследования органов дыхания в восстановительном периоде, длительностью 90 сут, были выполнены у 48 половозрелых мышей F1(CBA*C57BL6), массой 20-23 г Периоду восстановления предшествовали эксперименты, моделирующие комбинированное воздействие внешнего (10 кратного еженедельного, в утреннее время) фракционированного у-облучения (70 сут) в суммарной дозе 500 сГр и ингаляционное воздействие смеси химических веществ (70 сут). Облучение в суммарной эффективной дозе 500 сГр соответствует дозе для человека около 120 сГр, с учетом коэффициента экстраполяции радиочувствительности мышей 3. Доза согласуется с расчетным уровнем суммарных среднетканевых эквивалентных доз для космонавтов при осуществлении межпланетного полета на Марс. Эксперименты проводили на стендовых базах ГНЦ РФ МБП РАН с у-облучателем биологических объ- 62 Диссертационная орбита Вестник восстановительной медицины № 3^2016 ектов ГОБО-60 с источником излучения 137Cs. Химическое воздействие осуществляли на герметичном испытательном стенде (УМБИ-1), оснащенном автономными системами жизнеобеспечения и динамической системой поддержания заданных концентраций ацетона, аце-тальдегида и этанола (0,67-1,4; 0,86-1,75; 3,78-9,91 мг/ м3) соответственно на уровне ПДКпка (предельно допустимые концентрации для пилотируемых космических аппаратов). В восстановительном периоде эвтаназию животных экспериментальных и контрольных групп проводили одновременно методом декапитации. Морфологические исследования трахеи, бронхов, легких проводили на 27 и 90 сут восстановительного периода. Трахею, бронхи и легкие фиксировали в растворе «иммунофикс» (Bio-Optica), затем проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. Для изучения микротопографии, морфологических изменений эпителия, желез и лимфоидных образований, соединительной ткани в стенках трахеи, бронхов и в легких срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, трихромом по Массону. Морфометрическую оценку структурных компонентов трахеи, бронхов и легких проводили методом точечного счета [Автандилов Г.Г., 1990]. Полученные данные были обработаны с помощью Microsoft Excel 7 и Statistica 6.0 и проверены на нормальность распределения по критерию Колмогорова-Смирнова, после чего были применены методы параметрической (t-критерий Стьюдента) статистики. Результаты и обсуждение После прекращения хронического низкодозового радиационно-химического воздействия на 27 сут и 90 сут восстановительного периода по данным морфологического исследования органов дыхания животных эпителий слизистой оболочки трахеи и главных бронхов - кубический, базальная мембрана под эпителием была очагово-утолщенной (у мышей контрольных групп трахея и главные бронхи были выстланы многорядным призматическим эпителием с тонкой базальной мембраной). В собственной пластинке слизистой оболочки выявлялись небольшие очаги фиброза, рассеянные диффузно, а также в виде очаговых скоплений лимфоциты, макрофаги и плазмоциты (у мышей контрольных групп в соб ственной пластинке слизистой оболочки и в подслизистой основе выявлялась рыхлая волокнистая соединительная ткань с единичными диффузно-рассеянными лимфоцитами и макрофагами). Эпителий ацинусов желез, расположенных в собственной пластинке слизистой оболочки, был представлен преимущественно серозными клетками, в выводных протоках которых выявлялись эозинофильные массы слизи, единичные нейтрофилы. Вокруг желез определялись очаговые скопления лимфоцитов (у мышей контрольных групп железы трахеи и их ацинусы, единичные в препаратах, располагались между пластинами гиалинового хряща, выводные протоки слизистых желез были выстланы кубическим однорядным эпителием, вокруг них выявлялись скопления лимфоидных клеток). Морфометрически активация иммунной системы организма на 27 сут восстановительного периода проявлялась в виде статистически значимого увеличения объемной доли лимфоидной ткани в стенках трахеи и внеле-гочных отделов главных бронхов в 2,9 раз, по сравнению с контрольной группой животных, и в 2,8 раз - в легких. Развитие инфильтратов в органах дыхания сопровождалось достоверным увеличением объемной доли желез (в 4,8 раза), фиброзной ткани вокруг хрящей, сосудов и желез (в 1,5 раза), количества сосудов в стенках трахеи и бронхов (в 1,3 раза) на фоне уменьшения доли рыхлой волокнистой соединительной ткани, по сравнению с контрольной группой животных (табл. 1). К 90 сут восстановительного периода прогрессировали морфологические изменения в стенках трахеи и бронхов и характеризовались увеличением объемной доли фиброзной ткани (Р<0,001), желез (Р<0,001), сосудов, по сравнению с морфологической картиной, наблюдаемой на 27 сут восстановительного периода и группой контроля. Строма стенок трахеи и бронхов была представлена в большей степени фиброзной соединительной тканью (увеличение в 2,8 раза по сравнению с контрольной группой), на фоне более выраженного уменьшения рыхлой волокнистой соединительной ткани. Очаги фиброза выявлялись в межхрящевых промежутках, вокруг желез, их выводных протоков, вокруг сосудов. Количество желез по сравнению с контрольной группой статистически значимо увеличилось в 8,7 раза, объемная доля сосудов в 1,9 раз (табл. 1). Объемная доля лимфоидной ткани в стенках трахеи и внелегочных отде Таблица. Статистические показатели заболеваемости у взрослого, детского населения и подростков Российской Федерации, на 1000 соответствующего населения. Структурные компоненты, P/p Контр.группа Опытная группа, 27 сут Контр.группа Опытная группа Гр. 90 сут Трахея бронхи Эпителий 12,63±0,47 13,1±0,50 11,7±0,39 14,3±0,52** Рыхлая волокнистая соединительная ткань 10,25±0,49 8,5±0,39* 13,8±0,45 8,1±0,47** Хрящи 10,41±0,50 9,4±0,56 12,6±0,61 11,2±0,93 Сосуды 1,25±0,15 1,6±0,15 1,4±0,18 2,7±0,29** Железы 1,1±0,21 5,3±0,45** 1,0±0,14 8,7±0,29 Фиброзная соединительная ткань 7,71±0,54 11,8±0,49** 6,9±0,45 18,6±0,72** Иммунокомпетентные клетки 4,2±0,48 12,5±0,56** 2,5±0,18 15,8±2,07** Легкие Лимфоидные узелки в легких 5,0±0,42 14,4±0,75** 2,2±0,26 16,1±1,03** Примечание: ** - достоверность различий (р< 0,01), * - достоверность различий (р< 0,05). Диссертационная орбита 63 Вестник восстановительной медицины № 3^2016 лов главных бронхов увеличивалась в 6,3 раза (Р<0,001), по сравнению с контрольной группой животных, и в 1,3 раза, по сравнению с 27 сутками восстановления. При морфологическом исследовании легких у мышей контрольной группы респираторный отдел легких был равномерно воздушный, альвеолы были с тонкими межальвеолярными перегородками. Эпителий главных и долевых бронхов был однорядный кубический. В стенках бронхов 2-3 порядка деления и в респираторных бронхиолах выявлялись диффузно рассеянные лимфоидные элементы. Вокруг легочных вен определялись лимфоидные скопления из 1-5 рядов лимфоцитов. При морфометрии в легких экспериментальных животных на 27 сут восстановительного периода наблюдалось достоверное увеличение объемной доли лимфоидной ткани, по сравнению с контрольной группой животных, в 2,8 раза, а к 90 сут восстановительного периода - в 1,9 раза (Р<0,001), по сравнению с контрольной группой. Известно, что радиационные эффекты в организме обусловлены хроническим окислительным стрессом, увеличением производства активных форм кислорода, что приводит к перекисному окислению липидов, белков, а также к активации провоспалительных цитокинов, повреждению сосудов МЦР [14, 15]. Кроме того, клинические исследования действия малых доз излучения у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС позволяют предположить, что степень выраженности повреждения легких при облучении всего тела усугубляется системной травмой организма [14, 15]. Очевидно, эпителий трахеи, бронхов и легких, являясь первой мишенью для вдыхаемых веществ и радиации, после длительного хронического воздействия секретирует большое количество медиаторов, которые сигнализируют клетки иммунной системы и подлежащих тканей. Это вызывает миграцию имму-нокомпетентных клеток, экспрессирующих цитокины, хемокины, которые активируют фибробласты: макро-фаг-воспалительный протеин-1а, 1ß, фактор некроза опухоли-а, фибронектин, интерлейкин-1, трансформирующий фактор роста ß, увеличение уровня экспрессии гена хемокинов альвеолярных макрофагов, что приводит к развитию фиброза [11, 16, 17, 18]. Дизрегуляция баланса продукции хемокинов, цитоки-нов и факторов роста в облученной ткани может проявляться циклическими «волнами». Так называемый «вечный каскад» цитокинов был выдвинут в качестве гипотезы как решающий фактор в прогрессировании развития в ткани легких структурных изменений [19]. Колебания в экспрессии цитокинов, по-видимому, обусловлены перебоями во взаимодействии между воспалительными клетками (лимфоцитами, макрофагами, плазмоцитами), которые выработались в ответ на воздействие, и поврежденными клетками в микроокружении облучения, что приводит к компромиссу иммунного ответа [20, 21, 22]. Подобный механизм может объяснить развитие очагов фиброза и лимфоидных инфильтратов в стенках трахеи, бронхов и в легких в отдаленные сроки (90 сут) восстановительного периода после прекращения комбинированного радиационного и химического воздействия. Наши морфологические данные согласуются с результатами C. J. Johnston et al. [4] при исследовании поздних эффектов радиации в легких у мышей Cc57BL/6J после облучения в диапазоне 0,5-10 Гр на протяжении 6-18 мес. Авторы показали, что низкие дозы тотального облучения организма могут усиливать иммунный ответ за счет увеличения пролифе-ративного реактивного ответа Т-клеток (митогенной стимуляции), изменения высвобождения цитокинов, в частности, активация интерферона-гамма и выброс IL-2. Согласно L. Downing et al. [7] утолщение межаль-веолярных перегородок и развитие посттрадицион-ной пневмонии у мышей C57Bl/6 наблюдалось через 8 недель после воздействия радиации в дозе 2 Гр. Надо отметить, что все описанные в литературе низкодо-зовые воздействия радиации превышали нашу экспериментальную дозу 500 сГр, но даже и такая малая доза может приводить к существенным структурным перестройкам. Высокая экспрессия провоспалитель-ных цитокинов TNF-альфа, интерлейкина (IL) -1a/ß, интерферона наблюдалась в легких после воздействия радиации в дозе 1Гр у мышей C57BL/6J и C3H/ HeN [23]. При этом показано, что пусковым фактором, который оказывает фиброгенное действие при воздействии радиации, является трансформирующий фактор роста TGF-ß1, который высвобождают эпителиальные клетки в трахее, бронхах и в легких. «Ключевой» цитокин TGF-ß1 вызывает модуляцию легочных фибробластов в миофибробластов и способствует синтезу коллагена [18]. При низкодозовой радиации происходит повышенная экспрессия TGF-ß1, так как цитокин очень чувствителен к ионизирующему излучению [18, 23, 24]. По данным J. Tian et al. [5] увеличение отложения коллагена в легких облученных животных свидетельствует о повышенной активации коллаген-продуцирующих клеток и внеклеточного матрикса, что может инициировать экспрессия генов матриксных металлопротеиназ (таких, как ММР-14 и ММР-15). Образование лимфоидных инфильтратов, проли-феративные изменения альвеолярного эпителия и интерстициальный фиброз в легких (у мышей, крыс и хомяков) после хронического вдыхания аэрозольных частиц ультрадисперсного диоксида титана на уровне ПДК (0,5 мг/м2, 2,0 и 10 мг/м2 при воздействии по 6 ч в день, в течение 13 недель экспериментально подтверждено в работах E.J. Moyron-Quiroz et al. [25]. Признаки хронического воспалительного процесса со склерозированием стенок бронхов и последующим прогрессированием процесса при экспозиции до 90 дней описаны при ингаляционном воздействии диоксида азота (в эксперименте на 120 крысах-самцах) уже на 60 сутки воздействия [26]. Инфильтративная реакция в легких с развитием фиброзной соединительной ткани наблюдалась при воздействии аэрозолей текстильных красок на крыс (10 мг/кг массы тела) по 6 часов в день в течение 4 недель [11]. Увеличение количества желез слизистой оболочки трахеи и бронхов к 90 сут восстановительного периода после воздействия, очевидно, можно объяснить следствием раздражающего действия химической смеси на парасимпатическую систему бронхиального дерева [27]. Заключение Таким образом, длительное хроническое у-облучение в суммарной дозе 500 сГр и ингаляционное воздействие смеси химических веществ в низких концентрациях у животных вызывает структурную перестройку в стенках трахеи, бронхов и в легких, которая на фоне репа-ративных процессов характеризовалась активацией иммуногенеза, увеличением количества желез, разрастанием фиброзной соединительной ткани, и явля 64 Диссертационная орбита Вестник восстановительной медицины № 3^2016 ется результатом нарушения ремоделирования ткани легких и избыточной продукции коллагена. Активация иммунной системы к 90 сут восстановительного периода свидетельствует о развитии адаптации с напряжением компенсаторных резервов организма. Развитие соединительной ткани, которое наблюдалось в большей степени в респираторных отделах легких у животных, свидетельствует о повышенном риске неблагоприятных отдаленных последствий низкодозового хронического воздействия факторов космического полета.

About the authors

M. V Oganesyan

First Moscow State Medical Sechenov University

Email: Marine-Oganesyan@mail.ru
Department of Human Anatomy

References

Supplementary files