Ультраструктурный анализ митохондрий в клетках коры надпочечников крыс при действии электромагнитного излучения и питьевой минеральной воды

Полный текст

Введение

Митохондрии являются важной органеллой в изучении механизма действия лечебных физических факторов. По современным представлениям, кроме своей основной функции (выработка энергии), митохондрии участвуют в зависимости от типа клеток в различных структурно-метаболических реакциях, в частности, в процессах синтеза и секреции, продукции активных форм кислорода, регуляции апоптоза, клеточном гомеостазе [1–4]. Показано, что митохондрии вырабатывают различные специфические белки, которые способствуют как слиянию самих митохондрий (в частности, в условиях дефицита энергии и при развитии стресса), так и наоборот, стимулируют их деление [5–8]. Проводятся различные исследования по целевому воздействию на митохондрии при различной патологии и старении организма с применением митохондриально-направленных антиоксидантов [2, 9, 10]. Разработка такого лечебного подхода, где митохондрии становятся «терапевтической мишенью», продолжает активно развиваться в разных аспектах [2, 11]. В свете представленных данных перспективным является изучение митохондрий при действии лечебных физических факторов различной природы, в частности, низкоинтенсивного электромагнитного излучения (ЭМИ) сверхвысокой частоты (СВЧ) и питьевой сульфатной минеральной воды (МВ), обладающих антиоксидантным и мембраностабилизирующим эффектами, которые лежат в основе их лечебно-профилактического и реабилитационного действия. При этом были выявлены активация митохондриальных регенераторно-гиперпластических реакций, увеличение массы митохондрий и их энергообеспечение [12–14]. Дальнейшее изучение механизмов адаптации митохондрий целесообразно провести в клетках пучковой зоны надпочечников — адренокортикоцитах (АКЦ), что связано с определенной спецификой в их структуре и с их функцией. В основном это проявляется в более крупных размерах как самих клеток, так и их митохондрий, которые выполняют ключевую роль в синтезе глюкокортикоидных гормонов [1, 3, 4, 6].

Цель

Изучение характера и особенностей развития адаптационных ультраструктурных изменений митохондрий АКЦ пучковой эоны надпочечников крыс при действии ЭМИ СВЧ и питьевой сульфатной МВ.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на 23 нелинейных крысах-самцах массой 220–250 г, которые были получены из питомника «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства». Исследования осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (требования Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986)). Методом рандомизации животные были распределены на 5 групп. Животные 1-й опытной группы (n = 5) подвергались действию ЭМИ СВЧ; в контрольной группе (n = 5) вместо ЭМИ СВЧ животные получали ложные процедуры (аппарат не включали). Животные 2-й опытной группы (n = 5) получали питьевую сульфатную магниево-кальциево-натриевую МВ (концентрация сульфата — 1,93 г/л, минерализация — 3,05 г/л); в контрольной группе (n = 5) вместо сульфатной МВ животные получали водопроводную воду. Использовались также интактные животные (n = 3), которые никаким воздействиям не подвергались. Воздействие ЭМИ СВЧ (курс из 10 процедур) проводили на поясничную область (зона проекции надпочечников) с помощью аппарата «Акватон -2» (плотность потока мощности — 1 мкВт/см², частота — около 1000 МГц, время воздействия — 2 минуты). МВ и водопроводную воду вводили крысам внутрижелудочно через иглу с оливой на конце, 1 раз в день по 3 мл в течение 16 дней. Животных выводили из эксперимента путем дислокации шейного отдела позвоночника после окончания курса процедур. Для электронно-микроскопических исследований образцы коры надпочечников фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида, постфиксировали в 1 % растворе OsO₄. После обезвоживания образцы заключали в смесь эпона и аралдита. Исследования проводили на электронном микроскопе Libra 120 (Германия) с программой Carl Zeis Texnology System Division, которая включает математическую обработку внутриклеточных структур. Осуществляли морфометрический анализ митохондрий (число, средняя и суммарная площади). Количественную оценку полученных данных проводили с помощью методов вариационной статистики. Для оценки достоверности различий сравниваемых величин использовали t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

В проведенном исследовании различали две формы регенерации митохондрий АКЦ — органоидную (изменение количества митохондрий) и внутриорганоидную (изменение размеров митохондрий и числа внутримитохондриальных структур — крист). Установлено, что у животных контрольной группы к действию ЭМИ СВЧ количество митохондрий сохранялось, но при этом происходило снижение их средней площади (на 26,4 %, р < 0,01) и числа крист (на 23,1 %, р < 0,01) в связи с ослаблением процессов внутриорганоидной формы регенерации. Следствием этих изменений являлось уменьшение суммарной площади митохондрий. У животных контрольной группы к действию питьевой МВ, наоборот, отмечалось уменьшение количества самих митохондрий и увеличение их средней площади (на 23,9 %, р < 0,01), что было связано со снижением активности органоидной и усилением внутриорганоидной форм регенерации. Все эти изменения приводили к снижению суммарной (общей) площади митохондрий и к ослаблению в той или иной мере биоэнергетических ресурсов в АКЦ у животных обеих контрольных групп.

Применение лечебных физических факторов вызывало усиление развития в основном однонаправленных, но разных по интенсивности регенераторно-гиперпластических реакций в митохондриях. В наибольшей степени они проявлялись при действии ЭМИ СВЧ, особенно подвергались изменениям средняя площадь митохондрий (увеличение на 69,8 %, р < 0,01) и численность крист (увеличение на 68,6 %, р < 0,01) (рис. 1). Эти сдвиги представляли собой процессы гипертрофии митохондрий, развивавшиеся в сочетании с гиперплазией внутримитохондриальных структур — крист. В результате митохондрии становились более крупными и мощными энергетическими структурами. Однако при этом происходило, что важно отметить, снижение общего количества митохондрий (на 28,2 %, р < 0,01), которое повлияло и на их суммарную площадь: она возрастала по сравнению с контролем, но не достигала уровня интакта (рис 1). Такие изменения в соотношении исследуемых показателей митохондрий при действии ЭМИ СВЧ свидетельствовали о выраженном усилении внутриорганоидной формы регенерации и подавлении органоидной, что указывало на определенную напряженность в развитии этих адаптационных реакций.

 

Рис. 1. Ультраструктурная характеристика митохондрий адренокортикоцитов пучковой зоны коры надпочечников при действии электромагнитного излучения сверхвысокой частоты

Fig. 1. Ultrastructural characteristics of mitochondria of adrenocorticocytes of the fascicular zone of the adrenal cortex when exposed to ultrahigh frequency electromagnetic radiation

Примечание: Светлые столбики — контроль; темные — электромагнитное излучение сверхвысокой частоты; A — количество митохондрий; B — средняя площадь митохондрий; C — суммарная площадь митохондрий; D — количество крист. + — p <0,01 по сравнению с интактной группой, ^* — p < 0,01 по сравнению с контрольной группой.

Note: Light columns are control; dark columns are ultrahigh frequency electromagnetic radiation; A — the number of mitochondria; B — the average area of mitochondria; C — the total area of mitochondria; D — the number of crystals. + — p <0.01 compared to the intact group, ^* — p <0.01 compared to the control group.

 

При действии питьевой сульфатной МВ (рис. 2), в отличие от ЭМИ СВЧ, число митохондрий не снижалось, а наоборот, возрастало (на 13,6 %, р < 0,05) по сравнению с контролем, что указывало на активацию органоидной формы регенерации митохондрий, которая сочеталась с внутриорганоидной. При этом средняя площадь митохондрий практически не изменялась, однако численность крист, как весьма важный показатель внутриорганоидной регенерации, проявляла тенденцию к повышению (на 8,4 %). В этих условиях суммарная площадь митохондрий возрастала на 16,1 % (р < 0,05) по сравнению с контролем и в виде тенденции превышала уровень интакта. Следовательно, при применении питьевой сульфатной МВ характерным являлось достоверное увеличение числа митохондрий и суммарной их площади по сравнению с контролем, хотя биоэнергетический потенциал этих митохондрий (с учетом более низкой численности крист) был выражен слабее, чем при действии ЭМИ СВЧ.

 

Рис. 2. Ультраструктурная характеристика митохондрий адренокортикоцитов пучковой зоны коры надпочечников при действии сульфатной минеральной воды

Fig. 2. Ultrastructural characteristics of mitochondria of adrenocorticocytes of the fascicular zone of the adrenal cortex under the action of sulfate mineral water

Примечание: Светлые столбики — контроль; темные — сульфатная минеральная вода. A — количество митохондрий; B — средняя площадь митохондрий; C — суммарная площадь митохондрий; D — количество крист. + — p < 0,01 по сравнению с интактной группой, ^* — p < 0,05 по сравнению с контрольной группой.

Note: The light bars are control; the dark ones are sulfate mineral water. A — the number of mitochondria; B — the average area of mitochondria; C — the total area of mitochondria; D — the number of crystals. + — p < 0.01 compared to the intact group, ^* — p < 0.05 compared to the control group.

 

Таким образом, применение ЭМИ СВЧ и питьевой сульфатной МВ вызывало усиление адаптационных сдвигов в митохондриях АКЦ, основу которых составляли регенераторно-гиперпластические реакции, проявлявшиеся в двух формах регенерации — органоидной и внутриорганоидной (внутримитохондриальной). Оказалось, что исследуемые факторы по-разному стимулировали эти формы регенерации: ЭМИ СВЧ — только внутриорганоидную, питьевая сульфатная МВ — в большей мере органоидную, но в сочетании с внутриорганоидной. Основной причиной этих различий являлась разная интенсивность воздействия исследуемых факторов на организм.

При применении ЭМИ СВЧ на область надпочечников организм включал ту форму регенерации митохондрий АКЦ, которая была необходима для быстрого реагирования на действующий фактор в связи с выраженным усилением функциональной нагрузки и повышенным потреблением энергии в клетках зоны воздействия. И такой реакцией становилась внутриорганоидная регенерация, которая увеличивала число структур, производящих аденозинтрифосфат (АТФ), — крист. Однако в связи с тем, что потребность в энергии явно превышала возможность ее производства и не была удовлетворена, включался дополнительный механизм адаптации, связанный со слиянием митохондрий для повышения биоэнергетики [5, 6]. Тем самым организму пришлось в этих условиях «жертвовать» числом митохондрий в обмен на создание укрупненных в результате слияния и образования более мощных митохондрий, что в свою очередь вызывало снижение их суммарной площади (общей массы). При влиянии питьевой сульфатной МВ, когда отсутствовала необходимость в быстром реагировании на действие этого фактора, происходило относительно сбалансированное развитие обеих форм регенерации. В этих условиях митохондрии функционировали на более устойчивом физиологическом уровне, что было связано с достоверным увеличением их численности, суммарной площади и возросшим биоэнергетическим ресурсом.

Выявленные адаптационные перестройки являлись результатом антиоксидантного и мембраностабилизирующего действия ЭМИ СВЧ и МВ как непосредственно на мембранные структуры клеток и их митохондрии, так и на регуляторные системы организма с преимущественным развитием реакций неспецифического характера. В наибольшей степени эти реакции проявлялись при действии ЭМИ СВЧ (как оказалось, не в полной мере адекватным), при котором увеличивались количественные сдвиги, но терялись качественные (специфические) особенности в ответных реакциях организма, что привело к дисбалансу в развитии форм регенерации.

В условиях действия питьевой сульфатной МВ, напротив, были очевидны и качественные особенности в адаптационных перестройках митохондрий, обусловленные избирательным действием комплекса ионов, макро- и микроэлементов — природных регуляторов метаболических процессов. В этом плане больше известен механизм действия кальция, который способен вмешиваться в митохондриальный метаболизм, регулируя выработку АТФ, а также подвижность митохондрий для обеспечения местного энергоснабжения в клетке [15, 16].

Эти и другие специфические особенности в действии МВ способствовали более широкому развитию адаптационных реакций, которые, по своей совокупности, становились основой для сбалансированного (гармоничного) развития обеих форм регенерации митохондрий.

Заключение

Применение ЭМИ СВЧ и питьевой сульфатной МВ вызывало в митохондриях АКЦ пучковой зоны надпочечников разное по интенсивности усиление регенераторно-гиперпластических процессов и повышение их биоэнергетического потенциала. Для оптимизации адаптивных процессов при применении ЭМИ СВЧ, имея в виду в основном активацию обеих форм регенерации и повышение митохондриальных ресурсов, следует использовать более адекватные режимы воздействия этого фактора. Результаты исследования позволяют понять характерные особенности в механизмах действия ЭМИ СВЧ и питьевой сульфатной МВ на ультраструктуру митохондрий АКЦ, которые важно учитывать при разработке новых способов профилактики и реабилитации. Необходимо дальнейшее изучение адаптационных изменений митохондрий под влиянием лечебных физических факторов и развитие в целом митохондриального направления исследований в курортологии и физиотерапии (в рамках митохондриальной медицины [17]), что будет способствовать повышению эффективности проводимых лечебно-профилактических и реабилитационных мероприятий.

Дополнительная информация

Вклад авторов. Все авторы подтверждают свое авторство в соответствии с международными критериями ICMJE (все авторы внесли значительный вклад в концепцию, дизайн исследования и подготовку статьи, прочитали и одобрили окончательный вариант до публикации). Вклад распределен следующим образом: Королев Ю.Н. — научное обоснование, концепция и дизайн, написание текста, проверка и редактирование рукописи; Никулина Л.А. — проведение исследования, анализ данных, статистическая обработка данных; Михайлик Л.В. — проведение исследования, анализ данных, статистическая обработка данных.

Источники финансирования. Данное исследование не было поддержано никакими внешними источниками финансирования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическое утверждение. Исследования осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986).

Доступ к данным. Данные, подтверждающие выводы этого исследования, можно получить по обоснованному запросу у корреспондирующего автора.

Additional information

Author Contributions. All authors confirm their authorship according to the international ICMJE criteria (all authors contributed significantly to the conception, study design and preparation of the article, read and approved the final version before publication). Special contributions: Korolev Yu.N. — conceptualization, formal analysis, writing — original draft, writing — review & editing; Nikulina L.A. — investigation, formal analysis; Michailik L.V. — investigation, formal analysis.

Funding. This study was not supported by any external funding sources.

Disclosure. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Ethics Approval. The research was carried out in accordance with the requirements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986).

Data Access Statement. The data that support the findings of this study are available on reasonable request from the corresponding author.

Об авторах

Юрий Николаевич Королев

Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: korolev.yur@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5530-1538

доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела изучения механизмов действия физических факторов

Россия, Москва

Людмила Анатольевна Никулина

Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии Минздрава России

Email: korolev.yur@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2200-868X

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела изучения механизмов действия физических факторов

Россия, Москва

Любовь Васильевна Михайлик

Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии Минздрава России

Email: korolev.yur@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9717-4749

научный сотрудник отдела изучения механизмов действия физических факторов

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы