UV SPECTROPHOTOMETRY APPLICATION FOR IDENTIFICATION OF CONDITIONS FOR METAPROTE EXTRACTION FROM WATER SOLUTIONS

Full Text

Первоначально метапрот как адаптоген использовался для целей военной медицины. Он выпускался как средство, способное усилить боеспособность воинов, повысить защитные свойства их организма, особенно в неблагоприятных климатических условиях (пустыни, высокогорье и др.). С 1990-х годов этот препарат стали выпускать для населения как средство, повышающее работоспособность, устойчивость организма к физической нагрузке, стрессу, гипоксии, гипертонии, а также для усиления действия депрессивных средств и др. [8, 10, 11]. Метапрот рекомендован к использованию при некоторых экстремальных воздействиях, в частности, при отравлении карбофосом, дихлорэтаном, этиленгликолем с целью восстановления физической работоспособности и нормализации биохимических показателей [2, 3, 4, 6]. Метапрот выпускается в капсулах по 50, 125 и 250 мг. Препарат медленно всасывается из желудочно-кишечного тракта. Он способен кумулироваться в организме, что при длительном или даже курсовом приеме приводит к появлению ряда нежелательных побочных эффектов. Среди них отмечены неприятные ощущения в животе, в области печени, головная боль, проявление аллергии в виде покраснения кожи лица, насморка [12]. Фармакокинетика препарата характеризуется интенсивным распределением его из крови в органы и ткани и способностью накапливаться в них [5, 9]. Это вызывает необходимость контроля метапрота в организме путем анализа биологических жидкостей (крови, мочи, слюны) в процессе приема препарата и в случае токсического действия. Для изолирования лекарственных веществ из жидких объектов чаще всего в анализе рекомендуется использовать метод жидкость-жидкостной экстракции [1]. Для его использования необходимо знать условия экстракции изучаемого препарата из водных растворов. Чтобы оценить основные факторы, влияющие на процесс изолирования метапрота, нами применен метод УФ спектрофотометрии. Вначале был изучен характер УФ спектра поглощения метапрота в различных растворителях с целью определения степени поглощения при разных значениях рН. Препарат растворяли в воде очищенной, спирте этиловом, 0,1 М растворе кислоты хлороводородной и 0,1 М растворе натрия гидроксида. Во всех растворах концентрация метапрота составляла 0,01 мг/мл. Затем снимали спектр поглощения каждого раствора, используя спектрофотометр СФ-56. Анализ проводили в трех повторностях. По средним значениям оптической плотности при каждой длине волны строили график зависимости величины оптической плотности от длины волны (рисунок 1). Рисунок 1 - Спектры поглощения растворов метапрота с концентрацией 0,01 мг/мл: 1 - в воде; 2 - в этиловом спирте; 3 - в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной; 4 - в 0,1 М растворе натрия гидроксида Как следует из полученных данных, наибольшую интенсивность метапрот обнаруживает в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной. Максимумы светопоглощения метапрота в воде, спирте и 0,1 М растворе кислоты хлороводородной находятся при длине волны 285 нм, в 0,1 М растворе натрия гидроксида - при 290 нм. В дальнейшем обнаружение и определение метапрота проводили в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной. Для изучения условий экстракции метапрота из водных растворов готовили буферные растворы с рН 1; 1,68; 3,56; 4,01; 6,86; 9,18 и 12,45. К 9 мл полученных растворов добавляли по 1 мг метапрота и экстрагировали в соотношении 1:1 однократно органическим растворителем (хлороформом) или смесью растворителей (хлороформ - ацетон 9:1). Для ряда препаратов рекомендуется использовать для экстракции смеси, а не отдельные растворители, что позволяет увеличить их переход в органическую фазу [7]. При каждом значении рН готовили по 6 опытов, содержащих метапрот и по 3 опыта, в которые препарат не добавляли. Полученные экстракты испаряли при комнатной температуре в темноте до сухих остатков, которые растворяли в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной и объем доводили до 100 мл. Количество экстрагированного метапрота (в %) рассчитывали по формуле, используя величину светопоглощения при длине волны 285 нм: Аисп. ∙ Сст ∙ 100 С% = ─────────── (1), Аст ∙ а где Аисп. - светопоглощение исследуемого раствора; Сст. - концентрация метапрота в стандартном растворе, равная 0,01 мг/мл; Аст. - светопоглощение стандартного раствора метапрота; а - количество метапрота, добавленное в буферную смесь, мг. Для определения правильности методики готовили 9 растворов стандартного образца метапрота на трех уровнях концентраций в трех повторностях. В каждом растворе определяли содержание метапрота с помощью УФ спектрофотометрии при длине волны 285 нм. Полученные данные приведены в таблице 1. Таблица 1 - Результаты, полученные при установлении правильности методики количественного определения метапрота с помощью УФ спектрофотометрии Уровень Взято метапрота, мкг/мл Найдено метапрота мкг/мл Найдено метапрота, % Метрологические характеристики 1 5 4,9511 99,02 = 99,78% SD = 0,52 RSD = 0,52% 1 5 4,9492 98,98 1 5 4,9805 99,61 2 10 9,9983 99,98 2 10 9,9919 99,92 2 10 9,9914 99,91 3 15 15,0114 100,08 3 15 15,0910 100,61 3 15 14,9921 99,95 Для определения воспроизводимости методики готовили растворы стандартного образца метапрота в шести повторностях и в каждом растворе определяли концентрацию препарата. Полученные данные приведены в таблице 2. Таблица 2 - Результаты, полученные при определении воспроизводимости методики количественного определения метапрота с помощью УФ спектрофотометрии № п/п Взято метапрота, мкг/мл Найдено метапрота, мкг/мл Найдено метапрота, % Метрологические характеристики 1 10 9,8590 98,59 = 99,83% SD = 0,88 RSD = 0,88% 2 10 9,9861 99,86 3 10 9,9901 99,90 4 10 10,1010 100,01 5 10 10,0490 100,49 6 10 9,9130 99,13 Рассчитанный коэффициент Стьюдента при Р = 95% не превышал табличного значения, следовательно, вклад систематической ошибки в результаты количественного определения незначителен. Полученные данные позволяют рекомендовать метод УФ спектрофотометрии для обнаружения и определения метапрота в растворах и в последующем в биологических жидкостях. Степень экстракции метапрота из водных растворов по описанной ранее методике и при использовании УФ спектрофотометрии представлена в таблице 3. Таблица 3 - Степень экстракции метапрота из водных растворов Экстрагент: хлороформ 1 2 3 рН % экстракции Метрологические характеристики 1 2,55; 2,61; 2,40; 2,52; 2,39; 2,54 = 2,50%; = 0,04; ∆ = 0,1; εотн .= ±3,68% 1,68 7,09; 6,89; 7,03; 6,58; 7,01; 8,53 = 6,86%; =0,1; ∆ = 0,25; εотн. = ±3,63% 3,56 64,55; 65,10; 63,99; 64,91; 63,89; 65,0 = 64,57%; = 0,22 ; ∆ ¯= 0,57; εотн. = ±0,88% 4,01 78,0; 77,1; 78,5; 77,68; 77,46; 78,30 = 77,84%; = 0,22; ∆ = 0,57; εотн. = ±0,73% 6,86 100,0; 96,6; 99,3; 98,91; 98,89;97,93 = 98,61%; = 0,49; ∆ = 1,25; εотн. = ±1,27% 9,18 100,0; 99,6; 99,34; 98,9; 98,99; 99,85 =99,44%; =0,17; ∆ = 0,43; εотн. = ±0,43 % 12,45 81,43; 81,12; 80,25; 78,99; 81,51; 80,36 = 80,78%; =0,27; ∆ = 0,69; εотн. = ±0,85 % Экстрагент: смесь хлороформ - ацетон 9:1 рН % экстракции Метрологические характеристики 1 2 3 1 12,55; 13,10; 12,09; 13,00; 12,63; 12,84 = 12,70%; = 0,15; ∆ = 0,38; εотн. = ±3,02% 1,68 27,27; 27,30; 26,99; 26,81; 26,79; 27,27 = 27,07%; = 0,10; ∆ = 0,25; εотн. = ±0,92% 3,56 82,0; 83,0; 80,96; 82,1; 81,99; 82,3 = 82,06%; = 0,27; ∆ = 0,69; εотн. = ±0,84% Продолжение таблицы 3 4,01 100,0; 99,8; 99,9; 99,86; 101,3; 100,96 = 100,3%; = 0,49; ∆ = 1,26 εотн. = ±1,26% 6,86 100,0; 99,74; 98,91; 99,1; 98,89; 99,85 = 99,42%; = 0,21; ∆ = 0,53 εотн.= ±0,53% 9,18 100,0; 99,63; 99,71; 99,86; 100,13; 98,99 = 99,72%; = 0,16; ∆ = 0,42 εотн. = ±0,42% 12,45 100,0; 99,99; 101,3; 98,76; 99,82; 98,86 =99,79%; = 0,34; ∆ = 0,87 εотн. = ±0,87% Как видно из полученных данных, максимальная экстракция метапрота хлороформом из водных растворов наблюдается при значениях рН 6,86 - 9,18; смесью хлороформ - ацетон (9:1) при рН 4,1 - 12,45. Диапазон рН максимальной экстракции метапрота смесью хлороформ - ацетон (9:1) шире по сравнению с экстракцией хлороформом. Замечено повышение процента экстракции метапрота смесью хлороформ - ацетон (9:1) при значениях рН 1 - 5,5. С целью проверки влияния электролитов на экстракцию были проведены повторные опыты при различных значениях рН с добавлением до насыщения в буферные смеси электролитов - натрия хлорида и аммония сульфата. Установлено, что присутствие электролитов практически не влияет на процент экстракции метапрота, что важно при последующем их использовании для очистки извлечений от эндогенных примесей при анализе биологических жидкостей. Выводы При разработке метода изолирования метапрота из биологических жидкостей рекомендуется использовать хлороформ или смесь хлороформа и ацетона в соотношении 9:1, однократную экстракцию при значениях рН 6,86 - 9,18 (при экстракции хлороформом) или рН 4,01 - 12,45 (при использовании смеси хлороформ - ацетон 9:1).

About the authors

T. H Vergeychik

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: toxic-pgfa@yandex.ru

V. A Linnikova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

G. B Guskova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

References

Supplementary files