COMPARATIVE VALUATION OF HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY OF FLAVONOIDS IN COURSE ALCOHOLIZATION OF RATS

Full Text

Злоупотребление алкоголем представляет серьезную медицинскую и социальную проблему. Увеличение приема алкоголя наблюдается во всем мире, в том числе и в России. Алкоголь оказывает отрицательное действие на все органы, однако печень наиболее подвержена его влиянию, поскольку именно здесь происходит окисление этанола. Около 85% этанола окисляется алкогольдегидрогеназой (АДГ) желудка и печени до ацетальдегида. Систематическое употребление алкоголя снижает активность АДГ и повышает уровень его основного токсического метаболита. Этанол и ацетальдегид оказывают повреждающее действие на гепатоциты, вызывая разрушение мембран, некроз, увеличение синтеза триглицеридов и их отложение в гепатоцитах, ингибируют синтез альбумина, нарушают обезвреживающую функцию печени по отношению к экзогенным и эндогенным токсинам, стимулируют усиление перекисного окисления липидов, процессы фиброгенеза и канцерогенеза [7]. В настоящее время наиболее часто в качестве гепатопротекторов используют препараты растительного происхождения [2, 5]. Перспективными соединениями в качестве гепатопротекторов следует считать флавоноиды, обладающие низкой токсичностью и широким спектром фармакологической активности. В этом плане представляет интерес изучение растений рода Вика, относящихся к широко распространенным на Северном Кавказе кормовым растениям и характеризующихся высоким содержанием флавоноидов [3, 4]. Целью нашего исследования явилась сравнительная оценка гепатозащитной активности флавоноидов растений рода Вика при курсовой алкоголизации у крыс. Объектами исследования служили флавицин и диосмин, выделенные из растительного сырья на кафедре органической химии ПМФИ - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Э.Т. Оганесяна и кверцетин фирмы Merck, являющийся одновременно и веществом сравнения. Диосмин был выделен из надземной части вики изменчивой - Vicia tanuifolia (variabilis) Roth, собранной в период цветения, как описано в [1]. Для этого обезжиренное с помощью хлороформа воздушно-сухое сырье обрабатывали водным этанолом и далее диосмин из сырья извлекали диметилсульфоксидом (ДМСО). Идентификацию проводили с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), бумажной хроматографии (БХ), УФ- и ИК-спектроскопии: температура плавления (т. пл.) 290-293 °С (из смеси ДМСО-метанол); Rf 0,39; УФ-спектр, λmax, нм: (в С2Н5ОН) 345, 254; ИК-спектр, см-1 : 1605, 1510, 1450 (-С=С ароматического ядра), 2983 (-ОСН3), 3250 (-ОН), 1650 (С=О), что свидетельствует о принадлежности выделенного соединения к диосмину, который относится к флавонам и представляет собой 7-О-рамноглюкозид диосметина. Последний, в свою очередь, является 5,7,3¢-тригидрокси-4¢-метоксифлавоном. Сумма дигликозидов диосметина, обозначенная как флавицин, - смесь 7-О-ксилозил- и 7-О-арабинозилглюкозидов диосметина - была выделена из надземной части вики обрубленной Vicia truncatula, как описано в [8]. Воздушно-сухое сырье экстрагировали 30-50% этанолом, флавоноидные соединения выделяли с помощью колоночной хроматографии и идентифицировали ТСХ, БХ, УФ и ИК спектроскопией. 7-О-ксилозилглюкозид диосметина: т. пл. 243-245 °С (из водного этанола); Rf 0,48; УФ спектр, λmax , нм: (в С2Н5ОН): 253, 345; ИК-спектр, см-1 : 3600-3200 (-ОН), 2920 (-ОСН3), 1645 (С=О), 1600, 1495 (-С=С ароматического ядра), 1080, 950, 855, 780 (замещение в фенольном радикале). Исследования были проведены на белых беспородных крысах-самках массой 180-200 г. Животные получены из питомника ПМФИ - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, прошли двухнедельный карантин и содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении. Курсовую алкоголизацию проводили путем 2-кратной внутрибрюшинной инъекции 33% раствора этанола в сутки в дозе 0,75 мл/100 г массы тела животного в течение 7 дней [7]. Изучаемые флавоноиды в дозе 100 мг/кг животные получали за 5 дней до введения этанола, а затем совместно с ним. Контролем служили животные, которым вводили такой же объем растворителя. Эффективность гепатозащитного действия флавоноидов изучали по комплексу биохимических показателей: активности аланинаминотрансферазы (АлАт), щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ), фосфолипазы А2 (ФЛ-А2), общего билирубина (ОБ), глюкозы и триглицеридов (ТРГ) в сыворотке крови и содержанию гликогена, ТРГ, фосфолипидов (ФЛ), 5′-нуклеотидазы в гомогенате печени [6]. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с расчетом t-критерия Стьюдента. При 7-дневной алкоголизации у крыс наблюдалась резкая активация фосфолипаз, развитие повреждения и нарушение проницаемости клеточных и субклеточных мембран (развитие синдрома цитолиза), снижения содержания ФЛ в печени, развитие жирового перерождения, синдрома холестаза, нарушение желчесекреторной и гликогенсберегающей функций печени (табл. 1). Применение флавоноидов привело к эффективному торможению фосфолиполиза и цитолиза, а именно, к полной нормализации активностей АлАт и ФЛ-А2 в сыворотке крови, которые снижались по сравнению с нелечеными животными при введении диосмина - на 60% и 77%, флавицина - на 63% и 89% (что было даже достоверно ниже, чем у интактных животных на 57%), кверцетина - на 59% и 81% соответственно. Применение флавицина привело также к снижению активности ЩФ в сыворотке крови на 68% по сравнению с контролем, что также было достоверно ниже, чем у интактных крыс на 35%, но введение остальных флавоноидов не оказало влияния на активность данного фермента, которая осталась такой же повышенной, как и в контроле. Содержание же общего билирубина при введении всех исследуемых флавоноидов: диосмина, флавицина и кверцетина достоверно снижалось на 37%, 29% и 51% соответственно по отношению к контролю и под влиянием диосмина и кверцетина достигло нормальных значений. Под влиянием флавицина и кверцетина достоверно увеличилось по отношению к контролю содержание глюкозы в сыворотке крови (т.е. устранялась гипогликемия, вызванная введением этанола) на 88% и 60% соответственно и достигло уровня нормы, но применение диосмина не повлияло на этот показатель, который оставался сниженным, как и в контроле. Наблюдалась полная нормализация в сыворотке крови активности лизосомального фермента КФ под влиянием всех исследуемых флавоноидов, которая была повышена у животных при алкоголизации, а у крыс, которым вводили флавицин, она оказалась и достоверно ниже на 25%, чем у интактных животных. Таблица 1 - Влияние флавоноидов на биохимические показатели состояния печени у крыс при курсовой алкоголизации (n=6) Показатели Интактные Контроль (33% раствор спирта этилового) Диосмин, 100 мг/кг Флавицин, 100 мг/кг Кверцетин, 100 мг/кг 1 2 3 5 6 7 АлАт сыворотки крови, мккат/л 0,47 ±0,053 1,25 ±0,127 Ри<0,001 +166% 0,50 ±0,071 Рк<0,001 -60% Ри>0,1 0,46 ±0,047 Рк<0,001 -63% Ри>0,1 0,52 ±0,045 Рк<0,005 -59% Ри>0,1 ЩФ сыворотки крови, Ед/л 128 ±6,4 258 ±32,0 Ри<0,001 +101% 177 ±13,0 Рк>0,1 Ри<0,001 +38% 83 ±8,4 Рк<0,001 -68% Ри<0,001 -35% 226 ±14,5 Рк>0,1 Ри<0,001 +77% Продолжение таблицы 1 1 2 3 5 6 7 Общий билирубин сыворотки крови, мкмоль/л 6,4±0,68 13,4 ±1,22 Ри<0,001 +111% 8,4±0,98 Рк<0,05 -37% Ри>0,1 9,5±0,64 Рк<0,05 -29% Ри<0,05 +48% 6,6±0,66 Рк<0,01 -51% Ри>0,1 Триглицериды сыворотки крови, ммоль/л 0,6 ±0,07 1,4 ±0,07 Ри<0,001 +133% 0,7 ±0,07 Рк<0,001 -50% Ри>0,1 0,6 ±0,09 Рк<0,001 -57% Ри>0,1 0,7 ±0,02 Рк<0,001 -50% Ри>0,1 Глюкоза сыворотки крови, ммоль/л 10,7 ±1,62 4,8 ±0,83 Ри<0,05 -55% 6,5 ±0,06 Рк>0,05 +35% Ри<0,05 -39% 9,0 ±0,54 Рк<0,005 +88% Ри>0,1 7,7 ±0,50 Рк<0,05 +60% Ри>0,1 Кислая фосфатаза сыворотки крови, Е/л 44,8±1,99 79,09±5,44 Ри<0,01 +77% 47,1±3,91 Рк<0,01 -40% Ри>0,1 33,6±3,39 Рк<0,01 -57% Ри<0,05 -25% 44,8±3,43 Рк<0,001 -43% Ри>0,1 ФЛ А2 сыв. крови, Ед/л 353±46,4 1367±319 Ри<0,001 +288% 314±12,8 Рк<0,005 -77% Ри>0,1 153±18,0 Рк<0,005 -89% Ри<0,05 -57% 266±13,5 Рк<0,05 -81% Ри>0,1 5¢-нуклеотидаза печени, мкг Рн/мг белка 171,6±16,33 85,3±18,54 135,5±21,06 Рк>0,1 Ри<0,05 -21% 152,7±16,64 Рк<0,05 +79 % Ри>0,1 129,7±18,09 Рк>0,1 Ри<0,05 -24% Фосфолипиды печени, мг/г 28,4 ±2,06 16,2 ±3,19 Ри<0,05 -43% 20,7 ±1,34 Рк>0,1 Ри<0,01 -27% 30,1 ±2,40 Рк<0,01 +86% Ри>0,1 20,1 ±2,66 Рк>0,1 Ри<0,01 -29% Гликоген печени, г/кг 18,8±1,80 8,5±0,54 Ри<0,005 -55% 14,6±1,58 Рк<0,05 +71% Ри>0,1 16,6±1,00 Рк<0,001 +96% Ри>0,1 9,1±2,32 Рк>0,1 Ри<0,005 -52% ТРГ печени, мкмоль/г 24,2±3,80 88,9±4,50 Ри<0,001 +267% 17,6±2,41 Рк<0,001 -80% Ри>0,1 15,2±1,18 Рк<0,001 -83% Ри>0,05 15,7±1,12 Рк<0,001 -82% Ри>0,1 Примечание: Ри - уровень достоверной разницы по отношению к интактным значениям; Рк - уровень достоверной разницы по отношению к контрольным значениям; n - количество животных в группе В печени при применении всех флавоноидов полностью нормализовалось содержание ТРГ, т.е. они эффективно сдерживали развитие жировой дистрофии, снижая количество ТРГ примерно в равной степени (-80%, -83% и 82% по сравнению с контролем), содержание же гликогена полностью было восстановлено под влиянием применения диосмина (+71%) и флавицина (+96%), но у животных, получавших кверцетин, оно осталось пониженным и достоверно не отличалось от контрольных значений. Содержание же ФЛ, как и активность плазматической 5¢-нуклеотидазы в печени, увеличились только у животных, получавших флавицин (на 86% и 79% по сравнению с контролем) и достоверно не отличались от нормы, в то время как у животных, которым вводили диосмин и кверцетин, эти показатели остались такими же низкими, как и у контрольных животных (достоверные различия отсутствовали). Если эффективность гепатозащитного действия выразить в баллах, оценивая полную нормализацию 2 баллами, достоверное улучшение - 1 баллом и сохранение на уровне контроля - 0 баллов, то с учетом того комплекса биохимических показателей, который нами был использован для оценки степени нормализации состояния печени (11 показателей), в случае его полной нормализации сумма баллов должна составить 22. При применении диосмина, как и кверцетина, полностью нормализовались 7 показателей, и достоверно не изменились по отношению к контролю 4 показателя, т.е. сумма баллов для обоих составит 14 (64%). При применении флавицина нормализовались 9 показателей и 2 - достоверно улучшались, т.е. его эффективность составляет 20 баллов (91%). Таким образом, по эффективности гепатозащитного действия при курсовой алкоголизации по комплексу изученных биохимических показателей исследуемые флавоноиды можно расположить следующим образом: флавицин > диосмин = кверцетин (20 баллов - 14 баллов - 14 баллов; 91% - 64% - 64%), т.е. наиболее выраженными гепатопротекторными свойствами обладает флавицин. Поскольку флавицин отличается от самого диосмина лишь углеводным фрагментом, результаты наших исследований свидетельствуют о вкладе данного фрагмента в проявление гепатозащитной активности. Выводы Курсовая алкоголизация у крыс сопровождается поражением печени с развитием синдромов цитолиза, холестаза, жировой дистрофии, нарушением углеводного и липидного обменов. Флавицин обладает более выраженным гепатозащитным действием, чем диосмин и кверцетин при лечебно-профилактическом введении в дозе 100 мг/кг в условиях курсовой алкоголизации. Это может быть связано с большей биодоступностью, которую обеспечивает углеводный компонент, а также с наличием С2-С3 двойной связи в молекуле диосметина (агликона флавицина).

About the authors

E. O Sergeeva

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: maklea@yandex.ru

E. G Dorkina

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: elenadorkina@yandex.ru

L. A Sadzhaya

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: belochka794@rambler.ru

I. V Skulte

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: skultefarm@yandex.ru

O. M Sharenko

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: sharenko_oks@mail.ru

I. M Derevenets

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - a branch of Volgograd State Medical University

Email: derevenetsivan@yandex.ru

References

Supplementary files