ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА КРЫС НА МОДЕЛИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА, ЛЕЧЕННОГО ИБУПРОФЕНОМ И ЕГО КОМБИНАЦИЕЙ С ВИНБОРОНОМ

Полный текст

В последнее время внимание исследователей все больше привлекает проблема поиска новых путей профилактики и лечения побочных эффектов нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Это обусловлено, прежде всего тем, что многогранность патогенеза гастропатии, индуцированной нестероидными антифлогистиками, обосновывает проведение комплексной фармакотерапии или применение препаратов с политропными фармакологическими свойствами [1, 2, 3, 4]. Среди побочных эффектов НПВП наибольшую долю составляет токсическое воздействие на пищеварительную систему. При этом внимание исследователей привлекает специфический синдром, ассоциированный с приёмом данной группы препаратов - НПВП-гастропатия, морфологическим субстратом которой может выступать некроз эпителиоцитов. Однако как показали исследования последних лет, некроз - не только не единственная, но даже и не главная причина гибели клеток. Чаще, чем некроз, наблюдается запрограммированная смерть клеток - апоптоз (Владимиров В. Ю., 2002). Одним из важнейших признаков апоптоза является активация сериновых протеиназ, называемых каспазами, которые запускают каскад биохимических реакций, заканчивающийся разрушением многих белков цитоплазмы и ядра, дефрагментацией ядерной ДНК и выдачей сигнала фагоцитам о том, что клетку пора ликвидировать [5, 6]. Кроме того проблема ульцерогенеза тесно связана со способностью эпителия слизистой оболочки желудка (СОЖ) к адекватной регенерации на фоне повышения агрессивности желудочного сока, вызванного приёмом НПВП [4]. К сожалению, известные на сегодня пути ослабления гастротоксичности НПВП, а именно применение ингибиторов протонной помпы, Н2-гистаминоблокаторов, синтетических аналогов ПГ Е1 не способны удовлетворить потребностиклиницистов в полной мере [1, 7]. Среди существующих НПВП нами было выбрано производное пропионовой кислоты - ибупрофен. На сегодняшний день его применяют у детей старше 6 мес. как безрецептурное средство и в возрасте с 3 мес. - по рекомендации врача, что говорит о наименьшей токсичности препарата и минимальном количестве побочных реакций [8]. Однако при длительном применении (более 7-14 дней) даже ибупрофен в низких дозах (800 мг/сутки) может вызвать поражение желудочно-кишечного тракта [9]. С целью профилактики развития ибупрофен-индуцированной гастропатии привлекает внимание новый украинский препарат винборон, который выгодно сочетает в себе широкий спектр фармакологических свойств: спазмолитическое, противовоспалительное, обезболивающее (местное и центральное), противоишемическое, антиоксидантное, антиагрегантное, иммуномодулирующее, противомикробное, токолитическое, кардиопротекторное, церебропротекторное, стимулирующее влияние на микроцир- куляцию [2, 10]. Приказом Министерства здравоохранения Украины от 1 сентября 2014 г. № 665 «О государственной регистрации (перерегистрации) лекарственных средств (медицинских иммунобиологических препаратов) и внесения изменений в регистрационные материалы» (Приложение 2) винборон разрешен к применению в клинике, как спазмолитик с местноанестезирующим эффектом при дисфункции желчного пузыря и сфинктера Одди (гипокинетический и гиперкинетический типы), холециститах, желчнокаменной болезни, синдроме раздраженного кишечника, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки с болями спастического характера, в составе комплексного лечения нарушений мозгового кровообращения, а также при хронической венечной недостаточности, протекающей с приступами стенокардии. Также препарат можно назначать больным с нарушением функционального состояния печени, поскольку ему присущи гепатопротекторные свойства [11]. В проведенных нами ранее исследованиях установлено, что у 42,8% животных с адъювантным артритом (АА), которые получали ибупрофен в дозе 218 мг/кг на 28 день эксперимента были выявлены эрозивно-язвенные поражения СОЖ. Кроме того язвенный индекс (ЯИ) группы монотерапии ибупрофеном (0,97) почти в 10 раз превышал ЯИ группы комбинированной фармакотерапии АА ибупрофеном и винбороном (0,10) [2]. Целью исследования являются пролиферативная активность (ядерная метка Кі-67) и процессы апоптоза (цитоплазматическая или перинуклеарная метка CPP32) эпителиоцитов СОЖ крыс с АА при монотерапии ибупрофеном и его комбинацией с винбороном по данным иммуногистохимических (ИГХ) исследований. Материалы и методы. Исследование проведено на 28 половозрелых крысах-самцах, разбитых на 4 группы: I - интактные крысы (n=7), II - крысы с смоделированным АА без лечения (контроль), III - крысы с АА (n=7), леченные ибупрофеном (218 мг/кг, внутрижелу- дочно), IV - крысы с АА (n=7), леченные ибупрофеном внутрижелудочно (218 мг/ кг) в комбинации с винбороном (11 мг/кг, внутрижелудочно). Все экспериментальные исследования над лабораторными животными проводили в соответствии с требования- ми надлежащей лабораторной практики (GLP) и с соблюдением основных положений Конвенции Совета Европы « Об охране позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях» от 18 марта 1986 г., Директивы Европейского парламента и Совета ЕС 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, используемых для научных целей»; приказ МЗ Украины от 14 декабря 2009 г. №944 «Об утверждении порядка проведения доклинического изучения лекарственных средств и экспертизы материалов доклинического изучения лекарственных средств» и Закона Украины от 21 февраля 2006 г. №3447-IV «О защите животных от жестокого обращения» [12]. АА моделировали путем субплантарного введения полного адъюванта Фрейнда (Sigma, США. Состав: 1 часть ланолина, 2 части вазелинового масла и убитая вакцина БЦЖ из расчета 5 мг/мл) в заднюю правую лапку из расчета 0,1 мл на крысу [12]. Лечение АА проводилось с 14 по 28 день, путем внутрижелудочного введения исследуемых препаратов. Начало введения лекарственных средств отвечало максимальной воспалительной реакции [3, 12]. Эвтаназию крыс и забор материала с дальнейшей его фиксацией в 10% растворе нейтрального формалина проводили на 28 день эксперимента путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Пересчет доз препаратов с дозы человека на крыс осуществляли с использованием коэффициента видовой чувствительности по Ю. Г. Рыболовлеву [7, 12]. Иммуногистохимические исследования выполняли на парафиновых срезах с использованием стрептавидин-биотинового метода («DAKO», Дания; LSAB2 Systems, HRP). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере с рН 6,0. В качестве первичных антител применяли мышиные и кроличьи моноклональные антитела. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера в течение 15-60 сек. [13, 14]. Пролиферативную активность клеток оценивали с помощью мышиных моноклональных антител к ядерному антигену Ki-67 («DAKO», клон MIB-1, Дания), как чувствительного маркера пролиферации методом T. Scholzen [15]. В препаратах при 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс пролиферации (ядерная метка Ki-67) и индекс апоптоза (перинуклеарная или цитоплазматическая метка CPP32 - caspase-3) в 5 случайно выбранных полях зрения (≥500 клеток), как долю в процентах положительно окрашенных ядер эпителиоцитов СОЖ в трех компартментах (І - поверхностный и ямочный эпителий; II - перешеечная зона, III - основа желез, средняя и нижняя треть желез в базальных отделах). Для оценки экспрессии CPP32 (caspase-3) в СОЖ в аналогичных участках использовалась полуколичественная шкала оценки ин- тенсивности окраски: 0 (отсутствует) - отсутствие положительной реакции в клетках, 1 (слабая) - до 30% клеток от- реагировали положительно, 2 (умерен- ная) - 31-60%, 3 (сильная) - 60% и более окрашенных клеток [16, 17, 18]. Иммуногистохимическое исследование проведено на базе Винницкого областного бюро патологической анатомии (г. Винница, Украина). Микроскопию и фотографирование гистологических препаратов проводили с помощью светового микроскопа OLIMPUS BX 41 при увеличениях в 40, 100, 200 и 400 раз. Полученные снимки обрабатывали, проводили морфометрию и статистическую обработку с помощью программы «Quick PHOTO MICRO 2.3». Содержание клеточных элементов определяли в расчете на единицу условной площади (1 мм2). При выполнении морфометрических исследований руководствовались основными принципами, изложенными в руководстве Г.Г. Автандилова (2002) [1]. Результаты и их обсуждение. Для оценки клеточного обновления СОЖ как маркер пролиферации нами был выбран ядерный антиген Ki-67, поскольку клеточного цикла (G1, S, G2 и М), но отсутствует в фазе покоя (G0) [5, 17]. Иммуногистохимический анализ экспрессии показал, что на 28 день эксперимента в интактной группе индекс пролиферации (ИП) был наивысшим, а экспрессия Ki-67 наблюдалась на уровне зоны типичного пролиферационного компартмента СОЖ и преобладала именно в герминативной зоне и местами распространялась на ямочный эпителий (рис. 1). В контрольной группе ИП был снижен на 5% относительно интактных животных, что указывало на системные изменения в организме крыс при АА. Монотерапия ибупрофеном характеризовалась слабой экспрессией Кі-67 (рис. 2), что отвечало статистически достоверному снижению ИП на 36% относительно аналогичного показателя животных контрольной группы. Выявленную нами экспрессию Кі-67 в глубине ямок СОЖ можно расценивать, как иммуногистохимический признак формирования НПВП-гастропатии, что согласуется с данными литературы (Lauwers Выше указанные изменения свидетельствуют о том, что повреждения СОЖ, возникающие при применении ибупрофена, приводят к изменению жизненного цикла эпителиоцитов и задержке их дифференциации, а следовательно к нарушению клеточного обновления СОЖ и ее структурной дезорганизации. В группе комбинированного применения ибупрофена и винборона положительная маркировка Ki-67 обнаружена как в зоне перешейков, так и в базальных отделах желез желудка (рис. 3). ИП группы комбинированной фармакотерапии (0,081±0,004) превышал значения группы монотерапии ибупрофеном на 62%, что практически сопоставлялось с показателями интактных животных (0,082±0,004). Это указывало на способность винборона нивелировать антипролиферативные свойства ибупрофена, что в свою очередь, приводило к восстановлению регенеративных свойств эпителия СОЖ. Данные изменения пролиферативной активности при комбинированном применении ибупрофена и винборона согласуются с установленным в предыдущих исследованиях снижением язвенного индекса относительно группы монотерапии ибупрофеном [2]. Важная роль в поддержании тканевого гомеостаза отводится сохранению баланса между процессами пролиферации и апоптоза. Для изучения апоптоза эпителиоцитов СОЖ в качестве маркера была выбрана каспаза-3 (CPP32, Novocastra), как эффекторная в каскаде каспаз, задействованных в апоптозе. Ее активация означает необратимое следование клетки путем программируемой гибели. Нами было установлено, что в группе монотерапии ибупрофеном экспрессия каспазы-3 отмечалась преимущественно в покровно-ямочном эпителии, прилегающем к острым эрозиям и язвам. Количество положительно окрашенных клеток составляло более 60% (рис. 4) и было достоверно выше в сравнении с группой комбинированной фармакотерапии (p<0,05). В группе комбинированного применения ибупрофена и винборона, как и в группе интактных животных, экспрессия каспазы-3 колебалась от 10 до 30% (рис. 5). Уменьшение экспрессии каспазы-3 при комбинированном применении вышеуказанных препаратов обращает внимание на способность винборона ослаблять ибупрофен-индуцированный апоптоз эпителиоцитов СОЖ. Следует отметить, что снижение уровня апоптозных клеток не несет в себе угрозы канцерогенеза. Так, согласно данных литературы (Ивашкин В.Т. и др., 2002), снижение уровня апоптоза при поражениях СОЖ является показателем эффективности лечения. Причиной уменьшения количества апоптозных клеток при комбинированной терапии ибупрофеном с винбороном, вероятно, является совокупность нескольких взаимодополняющих факторов, одним из которых является наличие у винборона противовоспалительных и иммуномодулирующих свойств, поскольку воспаление расценивается как дополнительный путь активации апоптоза, помимо воздействий, напрямую стимулирующих запрограммированную клеточную гибель (Кононов А.В. и др., 2005). Другой возможной причиной уменьшения уровня апоптозных клеток при коррекции гастротоксичности ибупрофена винбороном могут быть антиоксидантные свойства последнего, поскольку согласно общепринятым представлениям проапоптотический эффект НПВП может реализоваться через активацию свободно радикального окисления (Fukumoto K. et al., 2011; Tamaki K. et al., 2011), а антиоксиданты, обладающие гастропротективным действием, снижают уровень апоптоза (Dursun H. et al., 2009; Suleyman H. et al., 2009). Выводы. Анализ результатов иммуногистохимического исследования свидетельствует о свойстве ибупрофена подавлять пролиферативную активность желудочных эпителиоцитов и индуцировать апоптоз, на что указывает активация каспазы-3. Высшеуказанные изменения приводят к нарушению способности СОЖ к адекватной регенерации. Гастропротекторный эффект винборона в условиях применения ибупрофена обусловлен повышением пролиферативного потенциала с восстановлением регенеративных свойств желудочного эпителия. Кроме того винборон способен подавлять индуцированный монотерапией ибупрофеном апоптоз эпителиоцитов желудка, что способствует поддержанию клеточного гомеостаза СОЖ.

Об авторах

Ф. В Гладких

Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: fedir.hladkykh@gmail.com
г. Винница, Украина

Н. Г Степанюк

Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

г. Винница, Украина

С. В Вернигородский

Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

г. Винница, Украина

Список литературы

Дополнительные файлы