Method development and validation for determination of antihemolytic activity of eculizumab (Soliris)

Full Text

54УДК: 616.633.963.42-07-08АЗРАБОТКАВАЛИДАМЕТОДАИФИЧЕСКОЙАНТИГЕМОЛИТИЧЕСКОЙАКТИВНОСТИПРЕПАРАТА эКУЛИЗУМАБ (СОЛИРИСЕ.Ю. Прудникова, Г.Н. Порошин, Н.К. Кудина, И.В. Лягоскин, Е.В. Сазонова, А.Ю. Вишневский, С.Г. АббасоваМеждународный биотехнологический центр «Генериум»Адрес: МБЦ «Генериум», 601125, Россия, Владимирская область, п. Вольгинский 9[hta9bT vA[L5ATLhbChw59T9waLbATLhbAbTLI9ah[YTL/A/TL9/U[L (SE. Yu. Prudnikova, G.N. Poroshin, N.K. Kudina, I.V. Lyagoskin, E.V. Sazonova, A. Yu. Vishnevskiy, S.G. Abbasova601125, Russia, Vladimir region, Volginskiy  \n\n      \n ,    \f \t \f \t. ‚  \r  (Ž)  \t\f \n   \r  \r . ­ \n   \r ,  \n\n\n \n   Ž. ‚\f \f   \n\n\n     \n \f,    \t. \n \r  –          [1, 2].  : \n   ‚‚‚ «“ƒ «\t»   \f \f   \t\t.   :  \t\t,   \t , -\n  . \r\f:    Bioanalytical methods are applied at the development and test of drugs as well as at the step of pharmaceutic products issue. Drugs and excipients quality estimation is made by means of precise and reproducible methods. Accuracy and reproducibility of a method is established during validation which is obligatory for medicine registration. The principal task of method validation is experimental evidence of its suitability for the objectives to be achieved. Validation of bioanalytical methods is one of the elements of the whole medicine production validation [1, 2]. The aim of research: to validate a method for determination of speciˆc anti-hemolytic activity of eculizumab developed in LCC ”IBC Generium•. Materials and methods: eculizumab, antibody-sensitized chicken erythrocytes, complement-containing human serum. 55     \n —  \n \f \f  (103.0±1.4)%), \t\f (CV – 11.5%), \r – (CV – (4.9±0.9)%),  – (CV – (3.5±0.4)%)  \f (k-1.0275; – 0.9975).        (\t, ,    \t ) \n \t\n  \t \f.   \t     \n \n \f  –  \f   \t\t.  \n   \t  \t     \t\r \n\r. \f       \n \n \f  Ž€ €,   \t\r \r \t\f  \r  (Ž€)    \r  €5   .\b : \t\t, \n , \n, , , \f, , Введение. Эффективность и безопасность лекарственных средств (ЛС) гарантируется их соответствием национальным и международным стандартам качества. Соответствие качества ЛС регламентируемым требованиям устанавливается различными методами. Вывод о качестве ЛС в значительной степени зависит от качества самого метода, поэтому необходимо оценивать пригодность аналитических методов с помощью процедуры квалификации или полной валидации [1, 3].Главной задачей валидации любой методики является экспериментальное sults. We demonstrated the speciˆcity of the method and its correspondence to criteria of accuracy (103.0±1.4)%, robustness (CV – 11.5%), repeatability (CV – (4.9±0.9)%),reproducibility (CV – (3.5±0.4)%), and linearity (k -1.0275; R – 0.9975) during validation. The system validity (equipment, materials, analytical operations and analyzed samples) was conˆrmed for true results obtaining during validation. Results discussion.Experimental evidence of suitability of the method for eculizumab speciˆc activity assessment was obtained in course of validaThe simplicity of the method allows obtaining accurate results in other laboratories. The developed method can be used not only for speciˆc activity of Soliris determination but also for other pharmaceutical substances anddrugsbased on antibodies speciˆc to human complement C5.Keywords: eculizumab, anti-hemolytic activity, validation, speciˆcity, accuracy, linearity, precision, reproducibilityIntroduction. Ef�ciency and safety of drugs are guaranteed by their correspondence to national and international quality standards. Correspondence of drugs quality to the restricted requirements is established by different methods. The conclusion about medicine quality depends from the method quality at a signi�cant rate; therefore it is necessary to assess suitability of analytical methods using quali�cation procedure or The main task of method validation is experimental con�rmation of its appli56доказательство пригодности ее применения для достижения заявленной цели.Целью исследования была разработка и валидация метода оценки специфической активности ЛС экулизумаб (Солирис). Солирис применяется для лечения пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ). ПНГ – это очень редкое заболевание крови, обусловленное экспансией одного или нескольких клонов гемопоэтических стволовых кроветворных клеток с соматической мутацией PIG-A гена [4, 5]. В 58% случаев причиной смерти пациентов с ПНГ являются тромбозы, ская болезнь почек, геморрагические осложнения на фоне тромбоцитопении [5, 6].Солирис – гуманизированное моноклональное антитело против С5 компонента комплемента человека, его связывание с мишенью ингибирует расщепление компонента С5 на С5а и С5b и блокирует образование терминального комплекса комплемента С5b-9. Таким образом, экулизумаб восстанавливает регуляцию активности комплемента в крови и предотвращает внутрисосудистый гемолиз у больных ПНГ [4, 5, 7, 8, 9].Для оценки специфической активности ЛС Солирис был разработан метод с использованием сенсибилизированных антителами куриных эритроцитов (СЭ) и комплемент-содержащей сыворотки человека (ЧС). В результате проведенной валидации были получены экспериментальные данные, подтверждающие соответствие разработанной методики критериям приемлемости для количественных биоаналитических методов – специфичность, правильность, прецизионность, линейность и устойчивость и показана ее пригодность для оценки специфической активности разных серий препарата СоМатериалы и методы. Сенсибилизация куриных эритроцитов: гепаcation suitability to achieve a stated purThe aim of the study was to establish and validate the method of a speci�c activity of eculizumab (Soliris) assessment. Soliris is applied for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). PNH is rare blood disease conditioned by expansion of one or several clones of hematopoietic stem cells with somatic mutation of PIG-A gene [4, 5]. Thrombosis, chronic kidney disease, hemorrhagic complications against the thrombocytopenia are reasons of Soliris is a humanized monoclonal antibody against the complement C5, its binding with a target inhibits C5 component splitting into C5a and C5b and blocks the formation of complement C5b-9 terminal complex. Thus, eculizumab restores regulation of complement activity in blood and prevents intravascular hemolysis of PNH A method using antibody-sensitized chicken erythrocytes (SE) and complement-containing human serum (HS) was developed for Soliris speci�c activity evalExperimental data con�rming a of developed method with for quantitative bioanalytical methods such as speci�city, accuracy, precision, linearity, and robustness were received as validation result, and its convenience for speci�c activity determination of different Materials and methods. of chicken erythrocytes: heparinized blood was washed by phosphate buffered saline, and 10% suspension was prepared in veronal buffer saline (VBS) (Lonza, Cat no. BW12624E). Then, an equal volume of antibody solution diluted in the ratio 1:50 57ринизированную кровь отмывали фосфатно-солевым буферным раствором и готовили 10% суспензию эритроцитов в вероналовом буфере (ВБ) (Lonza, Cat. № BW12624E). После этого к эритроцитам добавляли равный объем раствора антител (разведенных в соотношении 1:50) (Rockland, Cat. № 203 – 4139) и инкубировали 1 час при 37С при периодическом помешивании. Затем суспензию дважды отмывали ВБ. СЭ хранили при С не более 2 недель.Методика оценки специфической активности препаратов: в лунки 96-луночного круглодонного планшета вносили по 50 мкл ЛС Солирис (серия Alexion Pharma International Sarl) в трипликатах в последовательных 2- и 3-кратных разведениях в ВБ от 2000, 1600 и 400 nM и по 50 мкл 5 или 10% нормальной комплемент-содержащей ЧС (Quidel Corporation, Lot# 016787) в ВБ. После 15-20 мин. инкубации вносили по 30 мкл 10% суспензии СЭ. Контроли: отрицательный – 100 мкл ВБ +30 мкл СЭ; положительный – 50 мкл ВБ + 50 мкл 5 – 10% нормальной ЧС + 30 мкл СЭ. После 40 мин. инкубации при 37эритроциты осаждали центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин) и переносили по 100 мкл супернатанта в плоскодонный планшет. Оптическую плотность (OD) измеряли на спектрофотометре (Tecan In�nite M200) при длине волны 415 нм. Процент гемолиза рассчитывали по формуле: (Rockland, Cat. No. 203 – 4139) was added to erythrocytes and incubated for 1 hour at С with periodic mixing. The suspension was washed by VBS twice. Erythrocytes suspension was kept at +4С no more than Method of a speci�c activity determiSoliris (series p0003703, Alexion Pharma International Sarl) was applied to 96-well round-bottomed plate (50 µl per well) in triplicates in serial 2- and 3-fold dilutions in VBS starting from 2000, 1600, and 400 nM. Then, 5% or 10% normal complement-containing human serum (Quidel Corporation, Lot# 016787) in VBS was added to each well (50 µl per well). After 15-20 minutes of incubation 10% erythrocytes suspension was added (30 µl per well). The negativecontrol was VBS (100 µl) with added 30 µl erythrocytes suspension. The positivecontrol was VBS (50 µl) with added 50 µl of 5 – 10% of normal human serum and 30 µl of erythrocytes susAfter 40 minutes incubation at 37С the erythrocytes were spinned down at 1500 rounds per minute during 5 min. Then, the supernatant from each well was transferred in new �at bottom plate (100 µl per well) for measuring of optical density (OD). OD was measured on spectrophotometer (Tecan In�nite M200) at wave length of 415 nm. The level of hemolysis was calculated with % гемолиза 100%*(OD отр. контрпол. контр. отр.контрData procession was done with Excel and GraphPad Prism 6.0 using 4 parametric logistic function “dose-response – inhibition” and “constrain – shared value” for values of upper and lower asymptotes and a Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Excel и GraphPad Prism 6.0 с использованием 4-х параметрической логистической функции дозозависимого ингибирования, и функции “constrain – shared value” для значений верхней и нижней асимптот 58и угла наклона сигмоидной кривой (hill slope). Определяли дозу полумаксимального ингибирования (IC) и коэффициент достоверности аппроксимации функРезультаты валидации. На первом этапе определяли оптимальный диапазон тестируемых концентраций ЛС Солирис и комплемент-содержащей ЧС.Показали, что оптимальная концентрация нормальной ЧС составляет 2.5%, а оптимальный диапазон концентраций – от 800 до 0.4 nM с двукратным шагом разведения (рис. 1 А).slope of sigmoid curve (hill slope). The half maximal inhibitory concentration (IC) and coef�cient of determination (R) were deValidation results. An optimal range of Soliris test concentrations and complement-containing human serum were deterIt was shown that optimal concentration of a normal human serum is 2.5%, and optimal concentration range is 800 – 0.4 nM Рисунок 1. A – Определение оптимального диапазона титрования препарата Солирис (серия p0003703). В – Комплемент-зависимый гемолиз СЭ в присутствии препаратов Солирис и Ксолар. Последовательные разведения препаратов от 800 nM с фактором разведения 2.59На втором этапе определяли специфичность, правильность, прецизионность, линейность и устойчивость (робастность) разработанного метода: Специфичность метода проверяли, используя в тесте Mab Xolair, не способное связывать С5-компонент комплемента человека. При добавлении ЛС Ксолар, в отличие от ЛС Солирис, ингибирования гемолиза не наблюдали даже при высоких концентрациях Ксолара (рис. 1 В). Для оценки правильности метода измеряли IC в образцах с симулированной активностью – 60.0%, A speci�city, accuracy, precision, linearity, and robustness of the developed method were de�ned on the second series of experSpeci�city. Speci�city of the method was veri�ed using another Mab Xolair that cannot bind human C5 complement. No hemolysis inhibition was detected even at high Xolair concentrations in contrast to Soliris, where signi�cant hemolysis level was detected at low eculizumab concentraAccuracy.Figure 1. A – Determination of Soliris optimal concentration range (series p0003703). Soliris and Xolair. Serial dilutions are from 800 nM with dilution factor of 2.6080.0%, 100.0%, 120.0% и 140.0%, в трех независимых опытах для каждого тестируемого диапазона (рис. 2 А). d activity (60.0%, 80.0%, 100.0%, 120.0%, and 140.0%) was measured for assessment Рисунок 2. Оценка правильности метода: А – определение специфической активности препарата в образцах с симулированной активностью – 60.0%, 80.0%, 100.0%, 120.0% и 140.0%. В – Определение антигемолитической активности препарата экулизумаб разных серий.61Правильность разработанного метода (accuracy) оценивали по формуле: Accuracy of developed method was calFigure 2. Evaluation of method accuracy: A – The determination of speci�c activity B – The determination of the anti-hemolytic activity of different eculizumab series.измер.62где Aизмер. (ТП) – измеренная относительная специфическая активность тестируемого препарата (ТП) относительно стандартного препарата (СП), выраженная в процентах. Полноту выявления активности в тестируемой пробе (Recovery) вычисляли по формуле: where A (TP) is measured relative speci�c activity of tested medicine (TP) to standard probe (SP) expressed in percent. Fullness of activity revelation in tested probe (Recovery) was calизмер. (ТП) / AR 100%*A (TP) / A где A – активность приготовленного образца [2].Критерий приемлемости для показателя R для тестируемых образцов, приготовленных независимо в 100%-ном диапазоне титрования – 85.0% – 115.0%, а для смещенных диапазонов титрования препарата – 80.0 – 120.0% от измеренной активности стандартного препарата [10].Все эксперименты по оценке правильности метода выполняли 2 исследователя независимо в разные экспериментальные дни. Показали, что среднее значение R у исследователя 1 составило 102.0%, а у исследователя 2 – 104.0%, среднее значение R для метода составило 103.0±1.4%, что соответствует критерию, данные представлены в таблице 1.Прецизионность метода оценивали по двум параметрам – сходимость и воспроизводимость. Сходимость определяли как CV (CV SD / mean *100%) значений IC, вычисленного из шести независимых модельных экспериментов, выполненных в течение одного дня одним исследователем. Воспроизводимость оценивали, как CV значений IC, вычисленного из трех независимых модельных экспериментов, выполненных в течение трех дней разными исследователями. CV должно быть ≤ 20.0% [10, 11]. CV сходимости метода у исследователя 1 составило 5.6%, а у исследователя 2 – 4.3%. Среднее значение CV сходимоwhere A is the activity of prepared Acceptance criteria R for test samples prepared independently in 100% range of titration is 85.0% to 115.0%, and it is 80.0 – 120.0% of the measured activity for stagAll assessment experiments of method accuracy were performed by two analysts independently in different experimental days. It was shown that the average value R was 102.0% for the 1 analyst, and it was 104.0% for the 2 analyst, whereas the average value R for the method amounted to 103.0±1.4% which corresponds to the critePrecision. Method precision was assessed with two parameters: the repeatability and the reproducibility. The repeatability was determined as CV (CV SD/mean*100%) of IC values calculated in six independent model experiments performed in one day by one analyst. The reproducibility was estimated as CV of IC values calculated in three independent model experiments which were performed in three days by different researches. CV must be less than or equal to 20.0% [10, 11].CV of method repeatability was 5.6% for the 1 analyst, and it was 4.3% for the 2analyst. The average value of repeatability 63сти – 4.9±0.9%. CV воспроизводимости у исследователя 1 – 3.7%, а у исследователя 2 – 3.2%. Среднее значение CV воспроизводимости составило 3.5±0.4%. Эти показатели соответствуют критериям приемлемости для биоаналитических методов (табл. 1).CV was 4.9±0.9%. CV of the reproducibility was 3.7% for the 1 analyst, and it was 3.2% for the 2 analyst. The average value of reproducibility CV was 3.5±0.4%. These indices correspond to suitability criteria for Таблица 1 – Экспериментальные и расчетные показатели валидации методаTable 1 – Experimental and calculated data of method validation Исследователь 1 / The 1День / DayТеоретическое (ожидаемое) значение активности,% / cy, (%)Измеренное значение активности,% potency,%Среднее значение активности,% sured potency,%Стандартное отклонение, SD явления,% / Recovery,%Коэффициент вариации, Исследователь 2 / The 2119.0119.0117.064 Линейность метода определяли из графика зависимости измеренной от ожидаемой величины активности препарата в смещенных диапазонах титрования (60.0%, 80.0%, 100.0%, 120.0%, 140.0%) с применением линейного тренда.В уравнении линейной зависимости y kx+/-b значение k должно быть равно 1.0+/-0.2, а R – не менее 0.9 [11]. Получены следующие показатели: значение 0.9974, уравнение кривой у 1.03х-0.8 (для исследователя 1), R 0.9976, уравнение кривой у 1.025х-1.7 (для исследователя 1). Средние показатели линейности метода R 0.9975, уравнение кривой Linearity. Method linearity was determined from a scatter plot of a measured and expected value of drug activity in staggered titration range (60.0%, 80.0%, 100.0%, K value should be equal to 1.0+/- 0.2 and should be at least 0.9 in linear dependence equation y kx+/-b [11]. The following coef�cients were obtained: R 0.9974, curve equation y 1.03x-0.8 (for the 1 analyst), 0.9976, curve equation y 1.025x-1.7 (for the 2 analyst). The average values of method linearity were R 0.9975, curve исунок 3. – Линейность разработанного метода определения специфической активности ЛС Солирис: А – график линейности значений, полученных исследователем 1; В – график линейности значений, полученных исследователем 2.65Устойчивость метода (Робастность). Устойчивость метода оценивали по вариабельности значений IC для одной серии препарата, по показателю CV, используя 3 серии сенсибилизированных эритроцитов, полученных в разные экспериментальные дни от разных животных. Для клеточных методов показатель CV не должен превышать 25.0% [12]. В экспериментах CV для разных партий эритроцитов составило не более 11.5% (рис. 4). Валидационные характеристики разработанного метода представлены в таблице 2.Robustness of the method. ness of the method was estimated according to variability of IC values for one drug series. CV index obtained using 3 series of the sensibilized erythrocytes in various experimental days from different animals. CV index should not exceed 25% for cell methods [12]. CV should not exceed 11.5% for different erythrocytes series (�gValidational characteristics of the develdetermination: A – the graph of linearity values obtained by the 166Рисунок 4 – Специфическая активность препарата Солирис, измеренная на разных сериях сенсибилизированных куриных эритроцитов, полученных в разные дни от разных животныхblood cells received in various experimental days from different animals67Таблица 2 – Обобщенные результаты валидации методаTable 2 – Generalized results of the method validationНаименование характеристики / CharacteristicsЗначения / ValuesСпецифичность / Speci�cityПравильность,% / Accuracy,%Робастность CV,% / Robustness CV,%11.5Прецизионность /PrecisionСходимость CV,% / Repeatability CV,%Воспроизводимость CV,% / Reproducibility CV,%Линейность / LinearityКоэффициент достоверности аппроксимацииУравнение кривой / Equation of the curveТаблица 3 – Значения специфической активности ЛС Солирис разных серийTable 3 – The Speci�c activity of different Soliris seriesСолирис /Солирис / Soliris Солирис / Soliris Солирис / Soliris p0003703Солирис / Soliris p0002701Солирис/ Soliris p0002802аключение. Результаты валидационных испытаний метода оценки специфической активности ЛС Солирис удовлетворяют критериям приемлемости для количественных биоаналитических методов по показателям: специфичность, линейность, правильность, прецизионность и устойчивость (робастность).The results of method validation of Soliris speci�c activity assessment comply with suitability criteria for quantitative bioanalytical methods for indices of speci�city, linearity, accuracy, precision, The developed method was applied for comparative assessment of three series of Soliris speci�c activity (p0003703, p0002801, p0002701). The speci�c drugs activity was calculated by use ofthe formula: A IС(ST) / IC(T)*100%. IС (ST) – of the drug series taken for a standard; (T) – ICof the analyzed drug series. Values of speci�c activity (A) of three series varied from 95.0 to 104.0% (�gure 2 B, Разработанный метод применяли для сравнительной оценки специфической активности трех серий препарата Солирис (p0003703, p0002801, p0002701). Специфическую активность препаратов вычисляли по формуле: A IС(ST) / IC(T)*100%, где IС (ST) – IC серии препарата, принятой за стандарт; IC (T) – IC серии анализируемого препарата. Значения специфической активности (А) для трех серий варьировали от 95.0 до 104.0% (рис. 2 B, табл. 3).68Подтверждена пригодность системы. Все оборудование, выполняемые аналитические операции и анализируемые образцы составляют единую целостную систему, позволяющую получить удовлетворительный результат при оценке специфической активности ЛП Солирис (экулизумаб) концентрат для приготовления раствора для инфузий 10.0 мг/мл. Разработанный метод может использоваться для контроля фармацевтической субстанции и/или ЛП на основе антител аффинных к С5 компонента комплемента человека, таких как ЛС Солирис.Библиографический списокГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств». Findlay J.W.A., Smith W.C., Lee J.W., Nordblom G.D., Das I., DeSilva B.S., Khan M.N., Bowsher R.R. Validation of immunoassays for bioanalysis: a pharmaceutical industry perspective. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Assay Validation Methods – De�nitions and Terms. Available from: http://www.fws.gov/aah/PDF/QI-Terms%20Hill A., Rother R. P., Arnold L., Kelly R., Cullen M.J., Richards S.J., Hillmen P. Eculizumab prevents intravascular hemolysis in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and unmasks low-level extravascular hemolysis occurring through C3 opsonization. Haematologica April. 2010, N. 95, рр. Johnson R., Hillmen P. Johnson, R. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: Nature’s gene therapy? J Clin Pathol. Parker C.1., Omine M., Richards S., Nishimura J., Bessler M., Ware R., Hillmen P., Luzzatto L., Young N., Kinoshita T., Rosse W., Socié G. The system suitability has been proven. All equipment, analytical operations and analyzed samples represent a uniform system which allows obtaining a satisfactory result in assessment of speci�c activity of Soliris (eculizumab) concentrate for preparation of The developed method can be used for the control of a substance and/or preparation on antibody basis speci�c to C5 human ReferencesGOST R 52249-2009. Good manufacturing practice for medicinal products Findlay J.W.A., Smith W.C., Lee J.W., Nordblom G.D., Das I., DeSilva B.S., Khan M.N., Bowsher R.R. Validation of immunoassays for bioanalysis: a pharmaceutical industry perspective. Journal of Pharmaceutical and Biomedical AnalAssay Validation Methods - De�nitions and Terms. Available from: http://www.fws.gov/aah/PDF/QI-Terms%20Hill A., Rother R. P., Arnold L., Kelly R., Cullen M.J., Richards S.J., Hillmen P. Eculizumab prevents intravascular hemolysis in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and unmasks low-level extravascular hemolysis occurring through C3 opsonization. Haematologica April. 2010, N. 95, Johnson R., Hillmen P. Johnson, R. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: Nature’s gene therapy? J Clin Pathol. Parker C.1., Omine M., Richards S., Nishimura J., Bessler M., Ware R., Hillmen P., Luzzatto L., Young N., Kinoshita T., Rosse W., Socié G. International 69International PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2005, N. 106 (12), рр. 3699-709. Hillmen P., Hall C., Marsh J., Elebute M., Bombara M.P., Petro B.E., Cullen M.J., Richards S.J., Rollins S.A., Mojcik C.F., Rother R.P. Effect of eculizumab on hemolysis and transfusion requirements in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria . N Engl J Med. 2004, Rother R.P., Rollins S.A., Mojcik C.F., Brodsky R.A., Bell L. Discovery and development of the complement inhibitor eculizumab for the treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria . Nat Biotech. 2007, N. 25 (11), рр. 1256–64.Scienti�c discussion. Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Guideline on bioanalytical method validation: http://www.ema.europa.Scientific_guideline/2011/08/A Step-by-Step Approach to Establishing a Method Validation Program: http://www.ivtnetwork.com/sites/default/files/A%20Step%20by%20Step%20Approach%20to%20Establishing%20a%20Method%20Validation%20Hohensteina A., Hebella M., Zikryb H. Development and validation of a novel cell-based assay for potencydetermination of human parathyroid hormone (PTH). Journal of Pharmaceutical and Biomedical PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood. 2005, N. 106 Hillmen P., Hall C., Marsh J., Elebute M., Bombara M.P., Petro B.E., Cullen M.J., Richards S.J., Rollins S.A., Mojcik C.F., Rother R.P. Effect of eculizumab on hemolysis and transfusion requirements in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria . N Engl J Med. Rother R.P., Rollins S.A., Mojcik C.F., Brodsky R.A., Bell L. Discovery and development of the complement inhibitor eculizumab for the treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria . Nat Biotech. 2007, N. 25 (11), рр. 1256–64.Scienti�c discussion. Available from: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_SciGuideline on bioanalytical method validation: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf.A Step-by-Step Approach to Establishing a Method Validation Program: http://www.ivtnetwork.com/sites/default/files/A%20Step%20by%20Step%20Approach%20to%20Establishing%20a%20Method%20Validation%20ProHohensteina A., Hebella M., Zikryb H. Development and validation of a novel cell-based assay for potencydetermination of human parathyroid hormone (PTH). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2014, N. 98, рр. 70Елена Юрьевна Прудникова – кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник лаборатории биологических методов МБЦ «Генериум». Область научных интересов: биотехнология, вирусология, разработка и валидация биологических методов анализа лекарственных средств, многоцветная проточная цитометрия. orcid.org/0000-0002-7983-Григорий Николаевич Порошин – научный сотрудник лаборатории биологических методов МБЦ «Генериум». Область научных интересов: биотехнология, иммунология, онкология, разработка и валидация биологических методов анализа лекарственных средств. E-mail: poroshin@ibcgenerium.ru.Наталья Константиновна Кудина – химик лаборатории биологических методов МБЦ «Генериум». Область научных интересов: биотехнология, микробиология, разработка и валидация биологических методов анализа лекарственных средств. E-mail: kudina@ibcgenerium.ru.Иван Владимировичкандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биологических методов МБЦ «Генериум». Область научных интересов: биотехнология, микробиология, разработка и валидация биологических методов анализа лекарственных средств. E-mail: lyagoskin@Елена ВикторовнаСазонова – кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории биологических методов МБЦ «Генериум». Область научных интересов: патофизиология, иммунология, онкология, многоцветная проточная цитометрия. E-mail: sazonova@Александр ЮрьевичВишневский – кандидат биологических наук, начальник отдела аналитических методов МБЦ Elena Yurievna Prudnikova – Ph.D. in Veterinary Science, Scientist, Laboratory of Biological Methods, IBC Generium. Research area: biotechnology, virology, development and validation of biological methods for medicine analysis, multicolor �ow cytometry. E-mail: prudnikova@Grigoriy Nikolaevich Poroshin – Scientist, Laboratory of Biological Methods, IBC Generium. Research area: biotechnology, immunology, oncology, development and validation of biological methods for medicine analysis. E-mail: poroshin@ibcgenerium.ru.Natalya Konstantinovna Kudina – Chemist, Laboratory of Biological Methods, IBC Generium. Research area: biotechnology, microbiology, development and validation of biological methods for medicine analysis. E-mail: kudina@van Vladimorovich Lyagoskin– Ph.D. in Biology, Scientist, Laboratory of Biological Methods, IBC Generium. Research area: biotechnology, microbiology, development and validation of biological methods for medicine analysis. E-mail: lyagoskin@Elena Viktorovna Sazonova – Ph.D. in Medicine, Scientist, Laboratory of Biological Methods, IBC Generium. Research area: pathophysiology, immunology, oncology, multicolor �ow cytometry. E-mail: Aleksandr Yuryevich VishnevskiyPh.D. in Biology, Head of Analytical Methods Department, IBC Generium. Research area: 71«Генериум». Область научных интересов: биотехнология, разработка лекарственных препаратов, масс-спектрометрия, хроматография, иммунохимия. Светлана Георгиевна Аббасова –доктор биологических наук, начальник лаборатории биологических методов МБЦ «Генериум». Область научных интересов: иммунология, онкология, биотехнология, разработка лекарственных препаПоступила в редакцию 12.09.2016Принята к печати 13.11.2016biotechnology, development of medicine, mass spectrometry, chromatography, immunochemistry. E-mail: vishnevskiy@Svetlana Georgievna Abbasova – D.Sc. in Biology, Head of Biological Methods Laboratory, IBC Generium. Research area: immunology, oncology, biotechnology, development of medicine. E-mail: Accepted for publication 13.11.2016

About the authors

E. Yu. Prudnikova

International Biotechnology Center «Generium»

Email: prudnikova@ibcgenerium.ru

G. N. Poroshin

International Biotechnology Center «Generium»

Email: poroshin@ibcgenerium.ru

N. K. Kudina

International Biotechnology Center «Generium»

Email: kudina@ibcgenerium.ru

I. V. Lyagoskin

International Biotechnology Center «Generium»

Email: lyagoskin@ibcgenerium.ru

E. V. Sazonova

International Biotechnology Center «Generium»

Email: sazonova@ibcgenerium.ru

A. Yu. Vishnevskiy

International Biotechnology Center «Generium»

Email: vishnevskiy@ibcgenerium.ru

S. G. Abbasova

International Biotechnology Center «Generium»

Email: abbasova@ibcgenerium.ru

References

Supplementary files