ANALYTICAL FEATURES OF SYNTHETIC MDMB(N)-073F CANNABIMIMETICS AND ITS MARKERS IN BIOLOGICAL MATERIAL

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Одним из важных аспектов судебной и токсикологической химии является изучение свойств токсикантов и процессов их метаболизма в организме человека, способов их выделения и идентификации. Это особенно актуально в отношении новых потенциально опасных психоактивных веществ, периодически появляющихся в незаконном обороте, в том числе синтетических каннабимиметиков. Разнообразие имеющейся в экспертных учреждениях приборной базы и отсутствие единых методических подходов к анализу синтетических каннабимиметиков в биологическом материале, отсутствие аналитических стандартов, вносят определенные трудности при интерпретации и сравнении результатов, полученных из разных источников. В лабораторной практике Российской Федерации широкодоступным и используемым методом анализа является газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ/МС), однако его применение сопряжено с необходимостью длительной и трудоемкой пробоподготовки для получения качественных проб образца. При исследовании мочи на наличие метаболитов каннабимиметиков в этом случае необходимы деконъюгация метаболитов, экстракция и дериватизация [1, 2]. Применение жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) является более предпочтительным, так как позволяет упростить процесс подготовки проб для выявления метаболитов синтетических каннабимиметиков за счет отказа от проведения деконъюгирования и дериватизации [3-5]. В данной работе приведены результаты изучения аналитических характеристик синтетического каннабимиметика группы индазолкарбоксамидов MDMB(N)-073F методами газовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ГХ-МС/МС) и жидкостной хроматографии с гибридной квадруполь-времяпролетной масс-спектрометрией высокого разрешения (ВЭЖХ-МСВР), а также характеристик главного метаболита MDMB(N)-073F, его глюкуронида и дериватов с использованием газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) в моче для целей экспертной практики, химико-токсикологического и судебно-химического анализа. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты растительного происхождения с нанесенными на них наркотическими средствами, изъятые в нелегальном обороте. Образцы мочи, поступившие на химико-токсикологическое и судебно-химическое исследование. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Обнаружение и идентификацию синтетического каннабимиметика в растительных объектах проводили методами газожидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией и высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным гибридным квадруполь - времяпролетным детектором высокого разрешения. Методы газожидкостной хроматографии с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором и высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометром были использованы для определения маркеров и метаболитов каннабимиметика в биологическом материале. Оборудование • газовый хроматограф Agilent 7890 (колонка капиллярная - DB-5MS, аналогичная (5% фенил)-метилполисилоксану), внутренний диаметр 0,25 мм, длина колонки 30 м, толщина пленки неподвижной фазы 0,25 мкм) с тандемным квадрупольным масс-спектрометром Agilent 7000 (Agilent, США); • газовый хроматограф Agilent 7820 (капиллярная колонка НР-5MS (5% фенил)-метилполисилоксан), внутренний диаметр 0,25 мм, длина 30 м, толщина пленки 0,25 мкм) с масс-селективным детектором Agilent 5975 (Agilent, США); • жидкостный хроматограф Agilent 1260 (хроматографическая колонка Zorbax Extend C-18 2,1*50мм, диаметр зерна сорбента 1,8 мкм) с тандемным гибридным квадруполь - времяпролетным детектором высокого разрешения Agilent 6540 (разрешение не менее 40000) (Agilent, США); • жидкостный хроматограф Agilent 1260 (хроматографическая колонка 3*150 мм с обращено-фазным сорбентом Poroshell 120 EC-C18, размер зерна 2,7 мкм) с тандемным масс-спектрометром Agilent 6460 (Agilent, США); • система с вакуумной камерой (12 позиций) (Supelco); • насос низкого вакуума KNF lab LABOPORT (Франция); • термоблок ПЭ-4030 (ОАО «Экрос», Россия); • одноканальный испаритель ПЭ-2300 (ОАО «Экрос», Россия); • микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия); • бытовая микроволновая печь Supra MWS1824SW (Россия); • патроны для ТФЭ SampliQ EVIDEX - 200 мг-3 мл (Agilent, США); • полуавтоматические пипетки-дозаторы (для отбора объемов жидкостей: 4-40, 40-200 мкл и 0,2-1, 1-5 мл). Материалы Бис-триметилсилил-трифторацетамид (BSTFA), содержащий 1% триметилхлорсилана; 2,2,3,3,3-пентафторпропанол, 2,2,3,3,3-пентафторпропионовый ангидрид, йодистый метил, β-глюкуронидаза, Type HP-2, From Helix Pomatia, 100000 ЕД/мл (Sigma-ALDRICH CHEMI, Германия). Используемые в исследовании реактивы и растворители марки «х.ч.». Хранение проб мочи до исследования осуществляли при + 4°С. Подготовка проб Подготовка растительных объектов (для ГХ-МС/МС и ВЭЖХ-МСВР исследования) Навеску растительного объекта массой 10 мг экстрагировали 10 мл этанола в течение 5 минут. Полученный экстракт отделяли центрифугированием от растительной матрицы, разбавляли в 10 раз этанолом и исследовали методами ГХ-МС/МС и ВЭЖХ-МСВР. Подготовка образцов мочи (с применением ферментативного гидролиза, для ГХ-МС исследования) К пробе мочи объемом 1 мл добавляли 50 мкл спиртового раствора внутреннего стандарта (гексенал 0,2 мг/мл), 250 мкл 1/15М фосфатного буфера pH 6 и 50 мкл β-глюкуронидазы. Флакон укупоривали и выдерживали при 45°С в течение 2 часов. После охлаждения добавляли 2 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8). Содержимое флаконов центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, центрифугат отделяли от осадка. Для экстракции использовали патроны для ТФЭ SampliQ EVIDEX (200 мг/3 мл) со смешанной фазой. Кондиционирование сорбента осуществляли путем последовательного пропускания через картридж 2 мл 95% этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8). Далее загружали образец со скоростью 1 мл/мин. Промывку проводили последовательно: 1 мл 1/15 М фосфатного буфера (рН 4.8) и 1 мл 10% этанола. Сушку патрона производили под вакуумом в течение 20 минут. Элюат получали двукратным пропусканием через патрон смеси н-гексан-этилацетат (2:1) по 2 мл. Элюат испаряли в токе азота при 45°С. Дериватизация Метилирование К сухому остатку элюата прибавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 20-25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывали и нагревали при 60°С в течение 60 минут в термоблоке. Флакон охлаждали, отбирали жидкую фракцию реакционной смеси, переносили в чистую виалу и испаряли в токе азота при 40°С. Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель газового хроматографа. Этерификация с 2,2,3,3,3-пентафторпропанолом К сухому остатку элюата прибавляли 20 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропанола и 60 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропионового ангидрида (замывая стенки виалы), виалу плотно укупоривали и обрабатывали микроволновым излучением в СВЧ-печи с мощностью 560 Вт в течение 5 минут. После охлаждения флакон вскрывали и выпаривали избыток реагентов в токе азота (не выше 40°С). Сухой остаток растворяли в 100 мкл безводного этилацетата и 1 мкл вводили в испаритель ХМС. Получение триметилсилиловых эфиров К сухому остатку элюата прибавляли 100 мкл BSTFA, содержащего 1% триметилхлорсилана, герметично закрывали, перемешивали на микровстряхивателе и нагревали при 80°С в течение 60 минут в термоблоке. Виалу охлаждали и 2 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра. Подготовка образцов мочи (без применения гидролиза, для ВЭЖХ исследования) К пробе мочи (0,05 мл) в пробирке Эппендорфа добавляли 0,45 мл смеси внутренних стандартов в ацетонитриле (с концентрацией по 0,03 мкг/мл этилморфина и циклизина). Пробирку центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин, надосадочный слой переносили в виалу для автосамплера, 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Условия проведения ГХ-МС/МС исследования (газовый хроматограф Agilent 7890 с тандемным квадрупольным масс-спектрометром Agilent 7000) • температура испарителя хроматографа - 280°C; • режим работы испарителя split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). • температура интерфейса детектора - 280°С; • начальная температура термостата колонки - 220°C; • конечная температура термостата колонки - 300°С; • температура колонки изменялась со скоростью 20 град/мин; • выдержка при конечной температуре 5 мин.; • газ-носитель - гелий, скорость потока через колонку 1 мл/мин.; • объем вводимой пробы - 1 мкл; • газ ячейки соударений - азот, 1,5 мл/мин.; • «охлаждающий» газ - гелий, расход 2,25 мл/мин.; • энергия соударений 10-20 эВ. Условия проведения ВЭЖХ-МСВР исследования жидкостный хроматограф Agilent 1260 с гибридным квадруполь - времяпролетным детектором высокого разрешения Agilent 6540) • градиентное элюирование с фазами А (0,1% раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде) и B (ацетонитрил) при увеличении содержания фазы B от 1% до 100% за 10 минут; • объем вводимой пробы 1 мкл; • скорость потока 0,3 мл/мин.; • температура колонки 45°С; • ионизация электрораспылением в режиме получения положительных ионов; • температура осушающего газа (азот) 350°С; • поток осушающего газа (азот) 8 л/мин.; • давление газа распылителя (азот) 20 psi; • напряжение капилляра 3500 В; • напряжение фрагментора 100 и 180 В; • режим работы масс-спектрометра: Auto MS/MS • калибровка прибора и коррекция точности измерения масс в ходе анализа осуществлялась с использованием стандартных калибровочных растворов, рекомендованных производителем оборудования. Для проведения исследования часть полученного ранее спиртового экстракта исследуемого вещества, разбавляли водой и исследовали в указанных выше условиях. Условия проведения ГХ-МС исследования (газовый хроматограф Agilent 7820 с масс-селективным детектором Agilent 5975) • скорость потока газа-носителя (гелий) через колонку 1,5 мл/мин.; • режим работы испарителя split/splitless (деление потока 15:1, с задержкой включения 1 мин. после ввода пробы); • температура испарителя хроматографа и интерфейса детектора задавалась 250 и 280°С; • температура колонки: начальная 70°С в течение 2 мин и прогрев до 280°С со скоростью программирования 20 град/мин., выдержка при конечной температуре 8 мин.; • температуры источника ионов и квадруполя устанавливали 230 и 150°С, соответственно; • напряжение на умножителе масс-селективного детектора устанавливали равной величине автоматической настройки детектора. Регистрация масс-спектров для метильных производных в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 42-450 а.е. Регистрация масс-спектров триметилсилильных производных и пентафторпропиловых эфиров в режиме полного сканирования ионов в интервале масс 43-650 а.е. Долю конъюгирования главного метаболита MDMB(N)-073F фазы I биотрансформации в моче определяли по отношению площади пиков метиловых эфиров для иона с величиной m/z: 219 и площади пика иона m/z 235 для N-метилгексенала (внутренний стандарт) в элюате мочи с ферментативным гидролизом и аналогичной методике без гидролиза. Условия проведения ВЭЖХ-МС/МС исследования (жидкостный хроматограф Agilent 1260 с тандемным масс-спектрометром Agilent 6460) • градиентное элюирование с фазами А (10 мМ раствор формиата аммония и 0,1% муравьиной кислоты в деионизированной воде) и B (0,01% муравьиной кислоты в метаноле); • скорость подачи элюента составляла 0,6 мл/мин.; • температура колонки 50°С; • градиентный режим: 0 - 1,0 мин. 95% фаза А, к 5 мин. доля фазы А составляла 50%, к 15 мин. - 2%, к 17 мин. - 2%, к 17,1 мин. - 95% и регенерация колонки в течение 3,0 мин. 95% фаза А; • объем вводимой пробы 2 мкл; • ионизация электрораспылением в режиме получения положительных ионов; • поток газа-осушителя (азот) в источник ионов 6 л/мин.; • давление газа-распылителя (азот) 40 psi; • температура осушающего газа 300°С; • напряжение на капилляре 3500 В; • напряжение на фрагменторе 125 В; • режимы работы масс-спектрометра: динамический MRM и Product Ion Scan (диапазон масс 100-550 Da). Обработку хроматограмм с целью идентификации компонентов проб проводили с использованием программ MSD ChemStation E.02.01.1177 (Agilent), MassHunter B.08.02 (Agilent) и AMDIS (The Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Как было показано ранее, из относительного содержания метаболитов в образцах мочи, основным направлением метаболизма каннабимиметика MDMB(N)-073F является гидролиз сложноэфирной связи MDMB(N)-073F с последующей конъюгацией образующегося продукта (рисунок 1). Данный метаболит фазы I биотрансформации имеет наибольшую интенсивность сигнала на хроматограммах потребителей MDMB(N)-073F и характерный массспектр, что позволяет использовать его в качестве маркера употребления этого каннабимиметика [6, 7]. При этом следует учитывать, что в моче данный метаболит фазы I биотрансформации в значительной степени находится в конъюгированном виде (таблица 1), поэтому в случае применения для исследования метода ГХ-МС требуется проведение гидролиза конъюгатов. Наиболее распространенными вариантами дериватизации в скрининге маркеров каннабимиметиков в биологическом материале с использованием газовой хроматографии с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором являются получение метиловых, триметилсилильных и 2,2,3,3,3-пентафторпропиловых эфиров. При метилировании происходит образование метилового эфира маркера MDMB(N)-073F соответствующего исходному соединению (рисунок 2), что упрощает идентификацию соединения. На рисунках 3 и 4 приведены масс-спектры, индексы удерживания и структуры триметилсилильного и 2,2,3,3,3-пентафторпропилового эфиров маркера MDMB(N)-073F, соответственно. С учётом идентичной структуры MDMB(N)-073F и метилового деривата его основного метаболита (рисунок 1) для изучения свойств был проведен анализ исходного каннабимиметика MDMB(N)-073F с использованием методов ГХ-МС/МС и ВЭЖХ-МСВР. При исследовании методом газовой хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором трехквадрупольного типа была проанализирована фрагментация основных ионов, образующихся при ионизации электронным ударом из MDMB(N)-073F (рисунки 5 - 10). Из представленных на рисунках 5 - 10 масс-спектрах индивидуальных ионов видно, что все эти ионы структурно связаны между собой. Так в состав иона с m/z 304 а.е.м. входят ионы 219 и 145, в состав иона 219 входит ион с m/z 145 а.е.м., а в состав иона с m/z 307 а.е.м. - ионы 232, 275 и 131. Полученные данные соответствуют приведенной ниже схеме фрагментации под действием электронного удара (рисунок 11). При ВЭЖХ-МСВР исследовании MDMB(N)-073F, содержащегося в растительном объекте, были проанализированы данные по фрагментации основных ионов при учете точных масс. Полученные при анализе растительного объекта хроматограмма и спектр MDMB(N)-073F приведены на рисунках 12 и 13, соответственно. В таблице 2 приведены теоретические и полученные экспериментальным путем точные массы протонированной молекулы и фрагментных ионов MDMB(N)-073F, а так же вычисленная ошибка. Как известно, в условиях ионизации положительным электрораспылением, в основном, образуются ионы, соответствующие протонированным молекулам исходного вещества. Для соединения со структурой MDMB(N)-073F, это должен быть ион с брутто-формулой C19H27FN3 O3 и точной массой 364,2031 Da. Измеренная в ходе эксперимента точная молекулярная масса иона отличается от рассчитанной на 0,27 ррм, что доказывает правильность предположенной брутто-формулы. Исследование мочи потребителя MDMB(N)-073F методом ВЭЖХ-МС/МС с использованием регистрации множественных реакций (MRM) показало, что помимо маркера, с мочой экскретируется его конъюгат с глюкуроновой кислотой. Хроматограммы приведены на рис. 14-17. Масс-спектр ионов-продуктов маркера MDMB(N)-073F с m/z 350 для протонированной молекулы подобен спектру неизмененного соединения (рис. 13), и в нем присутствуют ионы с m/z 219 и 145 (рис. 14, 15). Спектр ионов-продуктов глюкуронида маркера MDMB(N)-073F (m/z 526 для протонированной молекулы) также содержит эти ионы (рис. 16, 17), что позволяет использовать их при регистрации MRM переходов для обоих соединений. Глюкуронид маркера MDMB(N)-073F является сложным эфиром. Это обуславливает его частичную фрагментацию в ионном источнике жидкостных масс-спектрометров при положительной ионизации [3]. Фрагментация глюкуронида в источнике, в основном, заключается в элиминировании остатка глюкуроновой кислоты. Образующийся ион с m/z 350 соответствует протонированной молекуле самого маркера MDMB(N)-073F. Нестабильность глюкуронида маркера MDMB(N)-073F дает возможность использовать ион с m/z 350 в качестве прекурсора при обнаружении обоих соединений (рис. 14, 15). Представленные данные подтверждают, что значительная доля маркера MDMB(N)-073F находится в моче его потребителей в виде конъюгата с глюкуроновой кислотой. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате исследования, проведенного методами газовой хроматографии с тандемной масс-спектрометрией и жидкостной хроматографии с гибридной квадруполь-времяпролетной масс-спектрометрией высокого разрешения, подтверждена структура соединения MDMB(N)-073F. Приведены масс-спектральные характеристики MDMB(N)-073F. Установлено, что одним из направлений биотрансформации MDMB(N)-073F в организме человека является гидролиз сложноэфирной связи с последующей конъюгацией образующейся кислоты. Конъюгатом метаболита MDMB(N)-073F фазы I биотрансформации является продукт взаимодействия с глюкуроновой кислотой. Метаболит, образующийся в результате гидролиза сложноэфирной связи, и его конъюгат с глюкуроновой кислотой рекомендованы в качестве маркеров употребления синтетического каннабимиметика MDMB(N)-073F при анализе хроматографическими методами; они могут быть использованы в систематическом аналитическом скрининге биологических образцов.

About the authors

S. S. Kataev

Perm Regional Bureau of Forensic-Medical Expertise

Email: forenschemist@narod.ru

O. N. Dvorskaya

Perm State Pharmaceutical Academy

Email: dvoksnik@gmail.com

M. A. Gofenberg

Yekaterinburg State Publicly Funded Health Facility “Regional Clinical Psychiatric Hospital”; Ural State Medical University

Email: Hoffenberg@yandex.ru

A. V. Labutin

Tomsk Regional Drug Abuse Clinic

Email: lav877@rambler.ru

A. B. Melentyev

Chelyabinsk Regional Bureau of Forensic-Medical Expertise

Email: melentjev-a@yandex.ru

References