Morphological, technological and biopharmaceutical studies of alginate-chitosan microcapsules with vinpocetine

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В последние годы во всём мире всё большее значение придаётся использованию комплексов с хитином и хитозаном. Проводятся исследования их количественного и качественного анализа, а также получения этих полимеров, физико-химических свойств и возможности расширения применения хитина и хитозана в медицине [1]. Одним из наиболее перспективных и активно развивающихся направлений в фармации и фармакологии является разработка систем контролируемой доставки лекарственных средств [2, 3]. Также проводятся исследования по формированию плёночного покрытия на основе хитозана с включением антибиотиков [4]. Помимо исследований комплексов лекарственных веществ с хитозаном, научный интерес представляет использование хитозана в качестве лекарственного средства. В ходе изучения действия хитозана на модели контактного аллергического дерматита установлено, что хитозан способен снижать концентрацию металла в коже экспериментальных животных, при применении фотофореза. Эти результаты свидетельствуют об эффективности применения хитозана при лечении кожных заболеваний [5-8]. Хитозан - естественный поликатионник, линейный полисахарид, производный хитина. Является универсальным биоматериалом из-за отсутствия токсичности и хорошей биоразлагаемости и биосовместимости. Смеси моно-, поли- и олигомеров хитозана высокой чистоты действуют как регенерирующие, ранозаживляющие и противоопухолевые препараты. Хитозан проявляет большой спектр положительных свойств, что даёт возможность использовать его в различных областях биомедицинской науки [9-13]. Использование хитозана в качестве наноносителя лекарственных средств является перспективным направлением науки, так как комплексы хитозан-лекарство обладают большей устойчивостью к разрушению под действием внутренней среды организма, а также повышают доставку лекарственного средства к мишени в неизменном виде. В качестве оболочки часто используется водорастворимый и биодеградируемый полимер - альгинат натрия [14]. Альгинат натрия в качестве полимера для микрокапсул имеет широкое применение. В одном из исследований использовался альгинат натрия в виде 2% раствора для получения микрокапсул с бактериофагом. Получена инновационная кишечнорастворимая лекарственная форма, которая может применяться в качестве антибактериального препарата [15-17]. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является одним из самых современных методов исследования свойств поверхности. Традиционно этот метод применяется для определения поверхностной морфологии различных объектов с высоким пространственным разрешением. Изучение шероховатости микрокапсул проводится с той целью, что истинная площадь поверхности чаще всего больше геометрической, так как структура микрорельефа влияют на неё. Обработка данных о рельефе поверхности дает возможность глубокого анализа различных ее характеристик [18-20]. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Проведение морфологических, технологических и биофармацевтических исследований альгинат-хитозановых микрокапсул с винпоцетином. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследования выбраны альгинат-хитозановые микрокапсулы с различной концентрацией натрия альгината (0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% и 3%) и раствором хитозана средней вязкости (0,25-0,5%), а также микрокапсулы, не обработанные раствором хитозана. Получение образцов микрокапсул осуществлялось методом экструзии. Исследования морфологии поверхности проводились методом АСМ с помощью сканирующего зондового микроскопа корпорации NT-MDT модели Solver P47 Pro (Россия, г. Зеленоград). Сканирование осуществляли кантилеверами типа HA_NC (для микрокапсул без хитозана с концентрацией натрия альгината 0,5% и 1%), HA_FM (для микрокапсул без хитозана с концентрацией натрия альгината 2% и 3%) и NSG03 (для микрокапсул без хитозана с концентрацией натрия альгината 1,5% и 2,5% и для микрокапсул с хитозаном со всеми используемыми концентрациями натрия альгината). Длиной 90 ± 5 мкм, резонансной частотой (260 ÷ 630) кГц и радиусом кривизны острия зонда 10 нм. Эксперименты проводили на воздухе при температуре 25 ± 1°С. Поля сканирования достигали (5×5) мкм2 при перепаде высот рельефа не более 2,5 мкм. С помощью зонда и сканера атомно-силового микроскопа удалось получить изображения поверхности с латеральным разрешением до 10 нм и вертикальным до 1 нм. Визуализация результатов измерений состояла в представлении рельефа в виде трехмерных изображений. Обработка полученных АСМ-изображений осуществлялась с помощью ПО ACM Solver P47 Pro Nova RC1 и заключалась в анализе амплитудных среднестатистических параметров шероховатости поверхности в соответствии с международными стандартами: Rа - средняя арифметическая шероховатость; Rq - средняя квадратичная шероховатость; Rz - максимальная высота профиля; Rsk - асимметрия; Rku - эксцесс. Обработку полученных АСМ-изображений для определения истинной и геометрической площадей поверхности микрокапсул проводили с помощью ПО Gwyddion 2.11. Эффективность микрокапсулирования определяли «прямым» методом. Для прямого определения рассчитывалось фактическое содержание винпоцетина в микрокапсулах после микрокапсулирования. Для этого навеску микрокапсул растворяли в 0,0 1М HCl, нагревали в течение 20 минут, затем охлаждали и доводили объём той же кислотой до метки. Методом спектрофотометрии определяли оптическую плотность полученного раствора в максимуме поглощения 312 нм. После определения количества выделившегося при растворении винпоцетина, зная его исходную концентрацию, рассчитывали эффективность микрокапсулирования с учетом количества включенного в микрокапсулы вещества mкапс, исходным количеством вещества, которое подвергалось растворению mисх согласно формуле: Э = mкапс/mисх * 100% (1) Изучение биофармацевтических свойств проводилось в соответствии с ОФС 1.4.2.0014.15. Методом спектрофотометрии определялась оптическая плотность полученных растворов на каждом этапе отбора проб при максимуме поглощения 314 ± 2 нм. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Микрокапсулы представляют собой непрозрачные, желтовато-белые или жёлтые среднетяжёлые крупные изодиаметрические (равноосные) кристаллы, обладающие хорошей сыпучестью, что является основанием для использования их при изготовлении капсул. Сравнение поверхности микрокапсул и их микропрофили с различной концентрацией натрия альгината, обработанных раствором хитозана и без обработки, представлено на рис. 1-6. На рис. 1а поверхность имеет характерную продольную исчерченность, выступы и впадины различной высоты и глубины, соответственно. Структура гомогенная, видимых включений нет, наружная поверхность гладкая. На рис. 1б поверхность ячеистая, морщинистая, шероховатая. Имеются небольшие выступы. На микропрофиле с хитозаном (рис. 1в) виден выраженный рельеф поверхности с волнообразной поверхностью, пики сглажены. Микропрофиль без хитозана отсутствует, так как поверхность не имеет каких-либо характерных особенностей рельефа. На рис. 2а поверхность слегка шероховатая, имеет редкую продольную исчерченность, глубокие впадины и пологие морщинистые высоты. На рис. 2б микрокапсулы имеют поперечно морщинистую структуру. Поверхность гладкая, присутствуют глубокие впадины, углубления и объёмные заострённые выступы. Микропрофили поверхности схожи. Оба имеют резкие разбросы в максимумах и минимумах высот. Пики слегка пильчатые. Видимые отличия в структуре рельефа практически отсутствуют. На рис. 3а поверхность сильно шероховатая, с выступами различной высоты и ширины. Углубления и впадины небольшие. На верхушках высот имеются редкие мелкие шаровидные включения. На подъёмах и спусках поверхность продольно морщинистая. На рис. 3б поверхность гладкая, местами имеет продольную исчерченность. Встречаются одиночные каменистые и шарообразные включения разных размеров, а также группы таких включений. Углубления практически отсутствуют, но имеются небольшие выступы и подъёмы. Микропрофиль поверхности с хитозаном (рис. 3в) имеет менее сглаженную поверхность, но меньшие перепады высот, а также пильчатые верхушки пиков, чем микропрофиль без хитозана (рис. 3г). На рис. 4а поверхность слегка шероховатая, имеются характерные, встречающиеся группами, высокие пики с широким основанием и заострённой верхушкой. Впадины неглубокие, но протяжённые. На рис. 4б поверхность неровная, шероховатая, с многочисленными шаровидными выступами и включениями. Микропрофиль микрокапсул с хитозаном (рис. 4в) имеет скачкообразный рельеф, что значительно отличается от микропрофиля без хитозана (рис. 4г) с пилообразной поверхностью. При данной концентрации натрия альгината начинают проявляться различия в поверхности микрокапсул с хитозаном и без него. На рис. 5а поверхность морщинистая, слабо ячеистая, видимые включения отсутствуют. На рис. 5б поверхность микрокапсулы гладкая, с длинными, извилистыми, неглубокими впадинами. Выступы крупные, пологие, со слабой поперечной исчерченностью. Включения отсутствуют. Микропрофили (рис. 5в и 5г) имеют характерные отличия. Поверхность с хитозаном имеет крупнозубчатый профиль с узкими и мелкопильчатыми пиками, а без хитозана наоборот, более ровная и сглаженная, а также имеет волнообразный сглаженный вид. Амплитудные параметры профиля для образцов (см. табл. 1) сильно разнятся по отношению друг к другу, что позволяет судить об отличиях микрокапсул с хитозаном и без него. На рис. 6а микрокапсула сильно морщинистая, покрыта неглубокими многочисленными впадинами. Поверхность неравномерно шероховатая. Имеются пологие высоты различной формы. На рис. 6б поверхность микрокапсулы гладкая, глубоко извилистая, выступы крупные, пологие, поперечно исчерченные. Включения отсутствуют. На рис. 6в микропрофиль имеет крупнозубчатый вид с вытянутыми пильчатыми пиками. Микропрофиль без хитозана волнообразный, сглаженный. На основании микропрофилей проведены вычисления амплитудных параметров шероховатости. Результаты приведены в табл. 1. На основе проведённых исследований, установлено, что, микрокапсулы, не обработанные раствором хитозана, имеют гладкую, поперечно исчерченную поверхность с крупными высотами и глубокими впадинами. С увеличением концентрации натрия альгината поверхность становится более гладкой, пики - крупнее, выше и шире, впадины - глубже и более извилистыми. Микрокапсулы, обработанные раствором хитозана, напротив, имеют шероховатую поверхность, небольшие высоты и неглубокие впадины, и с увеличением концентрации натрия альгината поверхность становится более шероховатой, высоты равномерно распределяются микрокапсуле. При концентрации натрия альгината 0,5%, 1% и 1,5% отличия между микрокапсулами с хитозаном и без хитозана неявные, но при концентрациях 2,0%, 2,5% и 3% характерные особенности становятся чёткими. Микропрофили позволили рассчитать необходимые параметры шероховатости. Вычисленные данные подтвердили различия в характере поверхности микрокапсул. Для образцов с хитозаном и концентрацией натрия альгината 0,5%, 1%, 2% и 3% характерна отрицательная асимметрия, что свидетельствует о том, что распределение имеет длинный левый «хвост», и отрицательный эксцесс (кроме образца с 1%). Микрокапсулы без хитозана с концентрацией натрия альгината 1-2% имеют положительную асимметрию с близкими показателями, т.е. длинный правый «хвост». Образцы с хитозаном и без хитозана при концентрации 1,5% имеют разную положительную асимметрию при разных эксцессах, а при концентрации 3% - одинаковую отрицательную асимметрию с разными, но отрицательными эксцессами. Наблюдается некоторое чередование знака асимметрии и эксцесса у образцов с увеличением концентрации. На рис. 7 представлены поверхности микрокапсул с различной концентрацией натрия альгината, обработанных раствором хитозана и без обработки при площади сканирования 5×5 мкм2 . При площади сканирования 5×5 мкм2 также можно наблюдать проявление различий в структуре поверхности микрокапсул с хитозаном и без хитозана, но чётко видные отличия заметны только при концентрации натрия альгината 2,5% и 3%. При концентрации 2% наблюдаются слабо различимые характерные признаки. Также при данной площади сканирования, описанные выше характерные признаки и структурные особенности поверхности микрокапсул при различной концентрации натрия альгината, менее заметны, вследствие чего при концентрации 2% трудно отличить микрокапсулы с хитозаном и без него. На следующем этапе исследований методом спектрофотометрии была определена эффективность микрокапсулирования. На основе полученных данных построен график зависимости эффективности микрокапсулирования винпоцетина от концентрации натрия альгината (рис. 8.). Так, при концентрации натрия альгината 2,5% эффективность микрокапсулирования максимальна и составляет 86,8%. При данной концентрации происходит насыщение, и при её дальнейшем увеличении эффективность снижается. В результате проведенных биофармацевтических исследований показано влияние на высвобождение винпоцетина концентрации раствора натрия альгината, используемой при получении микрокапсул (рис. 9).Степень высвобождения винпоцетина из образцов микрокапсул с концентрацией раствора натрия альгината 1% максимальна и составляет 41,17%. Из микрокапсул с 2,5% концентрацией раствора натрия альгината наблюдается более медленное высвобождение, к 45 минутам эксперимента составляет 4,5%. Далее были изучены технологические свойства микрокапсул (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что микрокапсулы представляют собой непрозрачные, желтовато-белые или жёлтые среднемелкие, крупные и очень крупные изодиаметрические (равноосные) среднетяжёлые частицы, обладающие хорошейсыпучестью, что позволяет использовать их в качестве наполнителя для капсулированных форм. Таким образом, в результате проведенных исследований получены модельные образцы микрокапсул винпоцетина. Методом атомно-силовой микроскопии проведено исследование морфологических особенностей альгинат-хитозановых микрокапсул. Обработанные хитозаном микрокапсулы имеют характерные отличия в структуре поверхности от микрокапсул без хитозана. Различия наиболее чётко проявляются при концентрации натрия альгината 2,5% и 3%. Амплитудные параметры имеют отличия при разных концентрациях. У образцов с хитозаном преобладает отрицательная асимметрия (0,5%, 1%, 2%, 3%), эксцесс распределён равномерно. У образцов без хитозана преобладает положительная асимметрия (1%, 1,5%, 2%) и положительный эксцесс. Существует некая закономерность чередования знака асимметрии и эксцесса у образцов с хитозаном. При изменении масштабов сканирования происходит изменение характеристик поверхности микрокапсул. Наиболее чётко отличительные детали структуры видны при масштабе 2×2 мкм2 . При концентрации раствора натрия альгината 2,5% эффективность микрокапсулирования максимальна (86,8%). При изучении влияния концентрации раствора натрия альгината на степень высвобождения винпоцетина из образцов микрокапсул установлено, что концентрации 1% степень высвобождения составляет 41,17%, а при 2,5-4,5%. Данные микрокапсулы можно использовать для изготовления капсул с модифицированных высвобождением. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, установлено, что с увеличением степени шероховатости микрокапсул происходит повышение эффективности микрокапсулирования. С увеличением концентрации раствора натрия альгината происходит снижение степени высвобождения вещества. Это может быть объяснено тем, что винпоцетин обладает сродством к натрию альгинату, который связывает его в комплекс, и с повышением концентрации раствора натрия альгината в водной среде прочность связывания возрастает. Полученные при исследовании результаты перспективны для дальнейшего детального изучения микрокапсулированного винпоцетина с целью создания его лекарственных форм.

About the authors

Yu. A. Polkovnikova

Voronezh State University

Email: juli-polk@mail.ru

N. A. Severinova

Voronezh State University

Email: natali-sewer@yandex.ru

K. N. Koryanova

Pyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University

Email: kskor-16@mail.ru

U. A. Tulskaya

Voronezh State University

Email: tulskaia1994@mail.ru

M. V. Grechkina

Voronezh State University

Email: grechkina_m@mail.ru

References

Supplementary files