Pharmacology complex compound of pro-gly-pro-leu with heparin: hypoglycemic, fibrinolitic and anticoagulant effects in rats with hyperglycemia

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Известно, что заболеваемость сахарным диабетом 2 типа (инсулиннезависимым, СД2) постоянно растет. Сахарный диабет - это комплекс физиологических дисфункций, характеризующихся стойким повышением глюкозы крови (гипергликемия), обусловленное инсулинорезистентностью, недостаточной секрецией инсулина и избыточным выделением глюкагона в кровь [1, 2]. Гипергликемия и развитие сахарного диабета обычно сопровождаются дисфункцией противосвертывающей системы (ПСС) и гиперкоагуляцией, проявляющейся повышением агрегации тромбоцитов, снижением антикоагулянтной и фибринолитической активности крови [3, 4]. Имеются данные о том, что такие аминокислоты как аргинин, лейцин играют важную роль в профилактике сахарного диабета. Лейцин стимулирует выработку инсулина поджелудочной железой, что приводит к нормальному уровню глюкозы в крови больных сахарным диабетом [5, 6]. Короткие регуляторные пролин- и глицинсодержащие пептиды (глипролины) постоянно вырабатываются в организме в процессе синтеза и деградации коллагена [7]. Некоторые глипролины (Arg-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Arg, Leu-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Leu) проявляют защитный антидиабетогенный эффект, одновременно стабилизируя показатели гемостаза при метаболических нарушениях. Показано, что многократное интраназальное введение этих пептидов крысам со стойкой гипергликемией (подобной начальной стадии СД2 человека) приводило к положительным изменениям в инсулярной и свертывающей системах организма. При этом отмечено снижение уровня глюкозы, повышение антикоагулянтного и фибринолитического потенциала плазмы, а также угнетение агрегации тромбоцитов в плазме крови животных [3, 4, 8, 9]. Один из природных антикоагулянтов системы гемостаза - гепарин является компонентом внутренней среды организма, который синтезируется тучными клетками печени, базофильными лейкоцитами и другими клетками. Он относится к антикоагулянтам быстрого действия, ингибирует тромбин-свертываю щую активность, а также проявляет гипогликемическое действие в организме. Гепарин способен образовывать комплексы с аминокислотами и пептидами за счет наличия в его молекуле структурных областей связывания с этими лигандами [10, 11]. Экспериментально показано, что введение животным гепариновых комплексов с глипролинами приводило к повышению антикоагулянтной, фибринолитической и антитромботической активности крови [12, 13]. Было установлено, что интраназальное введение комплекса гепарина с пептидом Arg-Pro-Gly-Pro животным с гипергликемией повышает антикоагулянтные свойства плазмы крови, фибринолитическую активность ферментативной и неферментативной природы, снижает агрегацию тромбоцитов и защищает крыс от развития сахарного диабета [13]. В настоящем исследовании изучались гипогликемические, антикоагулянтные и фибринолитические эффекты созданного нами комплекса пептида Pro-Gly-Pro-Leu (PGPL) с нефракционированным гепарином при его многократном интраназальном введении животным со стойкой гипергликемией, подобной СД2 у человека. Цель исс ледования. Получить комплекс пептида Pro-Gly-Pro-Leu (PGPL) и нефракционированного гепарина, изучить его влияние на уровень глюкозы и антикоагулянтно-фибринолитические свойства и показать его способность восстанавливать нарушенные функции инсулярной и свертывающей систем крови при экспериментальной гипергликемии у крыс. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение комплекса PGPL-гепарин В данном исследовании мы использовали нефракционированный гепарин фирмы Serva (Германия). Пептид PGPL был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН (Москва, Россия). Комплексное соединение этого пептида с гепарином при соотношении компонентов 1:1 (моль/моль) было создано по ранее описанному протоколу с некоторой нашей модификацией [12]. Гепарин и пептид PGPL растворяли в дистиллированной воде, перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при 37°C, рН 7.2. Продукт реакции осаждали 1%-ой уксусной кислотой, рН 5.0-5.2 и центрифугировали в течение 30 мин при 3000×g, осадок растворяли в 0.85%-м NaCl (физиологическом растворе), рН 7.2-7.4. Образование связи между гепарином и пептидом оценивали с помощью перекрестного электрофореза при 20ºC в 0,053 М фосфатном буфере, рН 7.0 при градиенте потенциала 7.3 в/см в течение 2 ч. Далее электрофореграммы окрашивали 0,033%-ым раствором Азура II, который выявляет кислые группы гепарина [12]. Животные, дизайн исследования и введение препаратов 50 крыс-самцов линии Wistar (возраст 10 мес., масса тела 320-350 г) были получены из Научного центра биомедицинских технологий, филиал «Столбовая» (Москва, Россия). Животные содержались в пластиковых клетках в стандартных условиях вивария при температуре окружающей среды (21-24o C), 12-часовом цикле день/ночь и относительной влажности воздуха 60±10% при свободном доступе к пище и воде в период эксперимента. Все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с соблюдением этических принципов по использованию лабораторных животных и были одобрены локальным этическим комитетом (Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия). После адаптации в течение 10 дней все животные были разделены на 5 групп по 10 крыс в каждой (рис. 1). Группа 1 - крысы с гипергликемией, получавшие 0,85%-й физиологический раствор. Группа 2 - крысы с гипергликемией, получавшие комплекс PGPL-гепарин (1 мг/кг массы тела). Группа 3 - крысы с гипергликемией, получавшие PGPL (20 мкг/кг массы тела). Группа 4 - крысы с гипергликемией, получавшие гепарин (0,98 мг/кг массы тела). Группа 5 состояла из здоровых животных. Растворенные в 0,85%-м растворе натрия хлорида препараты (комплексное соединение PGPL-гепарин, пептид PGPL и гепарин) готовили ежедневно перед введением животным. Доза комплекса PGPL-гепарин была выбрана на основании предыдущих исследований [13]. Дозы компонентов комплекса, т. е. пептида PGPL и гепарина, были эквивалентны их содержанию в комплексном соединении. Экспериментальную стойкую гипергликемию (ГГ) у крыс групп 1-4 индуцировали ежедневным однократным внутрижелудочным введением 40%-го раствора глюкозы в дозе 2,5 мл/кг массы тела в течение 7 дней, после чего крысы этих групп продолжали получать раствор глюкозы в течение всего эксперимента. После развития ГГ крысам 2-4 групп интраназально вводили исследуемые препараты в объеме 25 мкл один раз в сутки в течение 5 дней. Крысы 1-й и 5-й групп в те же сроки получали интраназально 0.85%-й NaCl в качестве плацебо. На 22-й день эксперимента, через 1 ч после последнего введения препаратов, у каждого животного отбирали кровь для биохимических анализов. В конце эксперимента (28-е сутки) повторный забор крови проводили через 1 ч после последнего введения глюкозы на фоне отмены приема препаратов. Проведение биохимических анализов Кровь для анализа брали из яремной вены (vena jugularis), используя в качестве консерванта 3.8%-й цитрат натрия в соотношении кровь:консервант как 9:1. В цельной крови определяли концентрацию глюкозы с помощью анализатора Accutrend GC (Roche, Германия) с использованием специальных тест-полосок.Далее кровь центрифугировали при 2000×g в течение 15 мин при комнатной температуре для получения бедной тромбоцитами плазмы, в которой оценивали антикоагулянтнуй активность по тесту активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) на анализаторе свертывания крови «АСК 2-01» (Россия); показатели фибринолиза по тестам суммарной (СФА), неферментативной (НФ) фибринолитической активности на нестабилизированном фибрине, ферментативной фибринолитической активности (ФФ) и активности тканевого активатора плазминогена (ААП) в эуглобулиновой фракции плазмы на стабилизированном фибрине [14]. Все данные обработаны статистически и выражены в виде среднего ± SD (стандартное отклонение). Нормальность распределения выявляли по критерию Шапиро-Уилка, групповые различия анализировали методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с применением критерия Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений. Статистически значимыми считались значения Р <0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Получение комплексного соединения PGPL-гепарин Установлено образование комплексного соединения пептида PGPL с гепарином в чистой системе. Это соединение было получено с оптимальным молярным соотношением компонентов 1:1. Использование перекрестного электрофореза показало взаимодействие и возникновение химической связи между аминогруппами пептида PGPL и кислотными группами гепарина. Как видно на рис. 2, при перпендикулярном нанесении на носитель растворов гепарина и пептида PGPL и их последующей миграции в электрическом поле, наблюдалось исчезновение окраски на кислые карбоксильные и сульфатные группы гепарина (краситель Азур II) в месте встречи веществ. Далее изучали гипогликемическое действие и влияние на систему гемостаза комплексного соединения PGPL-гепарин и его компонентов - пептида PGPL и гепарина в эквивалентных дозах в условиях стойкой ГГ у крыс. Влияние комплексного соединения PGPL-гепарина на уровень глюкозы крови После индукции гипергликемии на 18-ые сутки эксперимента уровень глюкозы в крови крыс с ГГ (группа 1) был достоверно выше, чем у здорового контроля (группа 5) (6.25 ± 0.35 ммоль/л против 4.8 ± 0.25 ммоль/л соответственно; Р <0.01), что составило 130%. Введение комплексного соединения PGPL-гепарин крысам снижало этот показатель на 21% (4.96 ± 0.23 ммоль/л; Р <0.01). Введение составных частей комплекса (PGPL или гепарина) оказывало более слабый гипогликемический эффект, что приводило к меньшему снижению уровня глюкозы в крови на 13 и 9% соответственно (до 5.41 ± 0.21 ммоль/л с PGPL и 5.71 ± 0.56 ммоль/л с гепарином; Р <0.05). На 28-й день эксперимента (через 6 дней после отмены лечения) уровень глюкозы в крови крыс группы 1 продолжал повышаться и составил 179% относительно здоровых животных (группа 5) (9.0 ± 0.42 ммоль/л против 5.02 ± 0.32 ммоль/л; Р <0,01). В то же время уровень глюкозы в крови крыс группы 2, получавших комплекс, составил 5.8 ± 0.72 ммоль/л (Р <0.01), тогда как введение и PGPL, так и гепарина не изменяли этот показатель (Р >0.05) (рис. 3). Влияние комплексного соединения PGPL-гепарин на антикоагулянтную активность плазмы крови по тесту АЧТВ Как видно на рис. 4, на 18-й день эксперимента у крыс с ГГ (группа 1) антикоагулянтная активность плазмы крови составила 27.6 ± 6.32 с, т.е. была снижена на 29% по сравнению со здоровыми нормальными крысами (Р <0.01). Этот вывод подтверждает, что через 12 дней после индукции ГГ прокоагулянтная активность крови повышается в организме ГГ животных. У ГГ крыс антикоагулянтная активность после терапии комплексом и гепарином достоверно увеличивалась на 89 и 34%, соответственно (52.2 ± 7.58 с - группа 2; Р <0.01 и 37.0 ± 5.22 с - группа 4; Р <0.05), тогда как введение PGPL не изменяло антикоагулянтную активность плазмы крови крыс (P >0.05). На 28-й день эксперимента, т.е. через 6 дней после отмены введения препаратов антикоагулянтная активность крови достоверно отличалась от ГГ контроля (28.3 ± 3.52 с) только в группе 2 после применения комплекса PGPL-гепарин (44.9 ± 5.01 с; Р <0.01) на 58% (рис. 4). Введение составных частей комплекса (PGPL и гепарина) не приводило к достоверному изменению данного параметра (Р >0.05). Влияние комплексного соединения PGPL-гепарин на фибринолитическую активность (СФА, НФ, ФФ и ААП) плазмы крови Показано, что у крыс с ГГ (группа 1) угнеталась фибринолитическая активность плазмы крови по сравнению со здоровыми животными группы 5 (табл. 1). Так, показатели СФА, НФ и ФФ у ГГ животных были снижены на 19, 28 и 32%, соответственно, по сравнению с таковыми у здоровых крыс (Р <0.05). Также у крыс группы 1 ААП была меньше на 36% по сравнению с крысами группы 5 (P <0.01). После интраназального введения комплекса PGPL-гепарин, пептида PGPL и гепарина фибринолитическаяю активность плазмы крови крыс со стойкой ГГ приводило к повышению фибринолиза всех типов (СФА, НФ, ФФ, ААП), но в разной степени. Так, у крыс группы 2, получавших комплекс, на 22-й день эксперимента эти показатели увеличились на 89, 115, 69 и 177% (Р <0.01), соответственно, по сравнению с ГГ контролем (группа 1). При этом параметры фибринолиза превышали значения у здоровых животных (группа 5). В то же время применение пептида приводило к достоверному возрастанию СФА на 21% (Р <0.05), ФФ - на 36% (Р <0.05) и ААП - на 35% (Р <0.05) в плазме крови крыс группы 3, но не изменяло НФ по сравнению с ГГ контролем (Р >0.05). Введение гепарина вызывало достоверное увеличение только ФФ - на 30% (Р <0.05) и ААП - на 53% (Р <0.01) у крыс группы 4 по сравнению с ГГ контролем. На 28-й день эксперимента у крыс с ГГ (группа 1), сохранялся пониженный фон фибринолиза: СФА, НФ, ФФ (Р <0.01 во всех случаях) и ААП (Р <0.05) были достоверно ниже (на 27, 30, 44 и 51% соответственно), чем у здоровых животных (группа 5). В то же время в группе 2 даже после прекращения применения комплекса отмечалось статистически значимое повышение фибринолитической активности: СФА - на 35%, НФ - на 49%, ФФ - на 63% и ААП - на 140% по сравнению с ГГ контролем (Р <0.01). Эти показатели соответствовали значениям здорового контроля. Кроме того, в группе 3 (PGPL) наблюдалось достоверное повышение только ФФ (на 22%, Р <0.05) и ААП (на 67%, Р <0.05). В этих условиях в группе 4 после прекращения введения гепарина достоверных отличий показателей фибринолитической активности по сравнению с ГГ контролем не выявлено (Р >0.05). ОБСУЖДЕНИЕ Анализируя полученные результаты, необходимо отметить, что прогрессирование сахарного диабета сопровождается подавлением ингибирования инсулярной [15] и противосвертывающей систем. Депрессия ПСС характеризуется усиленной агрегацией тромбоцитов, сниженной антикоагулянтной и фибринолитической активностью плазменного гемостаза, что приводит к повышению тромбогенного потенциала крови, а также часто вызывает образование тромбов [8]. По данным литературы у ГГ крыс подавление функции ПСС сопровождается повышением свертываемости крови, снижением фибринолиза и значительным возрастанием уровня глюкозы крови [3, 4, 13]. Подобный эффект наблюдался и в нашей модели экспериментальной гипергликемии. В данном исследовании оценивалось влияние комплексного соединения PGPL-гепарин и его компонентов - гепарина и пептида PGPL на гемостатическую и инсулярную системы ГГ крыс. Показано, что в ситуации, когда развивалась стойкая гипергликемия, комплекс PGPL-гепарин оказывал защитное действие на функциональное состояние и инсулярной, и гемостатической систем организма, что нами выявлено впервые. Как пептид PGPL, так и гепарин в дозах, эквивалентных их содержанию в комплексе, стимулировали антикоагулянтно-фибринолитический фон крови и снижали уровень глюкозы. Установлено, что противосвертывающие эффекты комплекса превышали действие его составных частей: в плазме крови повышались СФА (в результате активации НФ и тканевого активатора плазминогена) и антикоагулянтная активность крови. Кроме того, действие комплекса PGPL-гепарин было пролонгированным, поскольку сохранялось и через 6 дней после окончания его применения.Ранее действие пептидов PG, PGP и RPGP, гепарина и их комплексных соединений оценивали у здоровых и гипергликемических крыс. У крыс, интраназально получавших гепарин, повышалась только антикоагулянтная активность, а при введении пептидов - усиливались и антикоагулянтные, и фибринолитические свойства крови [12, 13, 16]. Многократное интраназальное введение пептида PGPL в большей дозе (1 мг/кг), чем в настоящей работе, крысам со стойкой ГГ защищало организм от развития гиперкоагуляции. При этом наблюдалось увеличение суммарного и неферментативного фибринолиза крови животных. Положительные изменения в инсулярной и противосвертывающей системах наблюдались в течение 5 дней после окончания применения пептида [9]. Рассматривая механизм действия комплекса на нормализацию уровня глюкозы крови, можно предположить, что PGPL-гепарин оказывал данный эффект и предотвращал развитие СД2 вследствие наличия в его структуре аминокислоты лейцин, которая стимулирует выработку инсулина, обеспечивая нормогликемическое действие [6]. Механизм антикоагулянтного действия гепарина обусловлен блокадой активности тромбина и других коагулянтных белков [17]. В то же время гепарин усиливал активность тканевого активатора плазминогена, что и приводило к усилению ферментативного фибринолиза [10]. Некоторые пептиды являются эффективными ингибиторами тромбина, которые обладают антикоагулянтными свойствами, могут активировать ферментативный фибринолиз и предотвращать образование тромбов в кровотоке. Было установлено, что пролин и глицинсодержащие пептиды PG и PGP могут индуцировать растворение нестабилизированного фибрина [16]. Наличие рецепторов глипролина на эндотелии пока не установлено, но сообщалось о существовании специфических сайтов связывания PGPL на цитоплазматической мембране базальных ядер головного мозга крыс [18]. Возможно, этот пептид, вводимый интраназальным путем, проходит через гематоэнцефалический барьер, проникая в структуры головного мозга и оказывая свое действие через специфические рецепторы. По данным литературы [19, 20], как и по результатам настоящего исследования, отдельные пептиды способны оказывать гипогликемический эффект и препятствовать прогрессированию СД2. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Исследованный нами комплекс PGPL-гепарин усиливал гипогликемическое и антикоагулянтное действие входящих в его состав компонентов - гепарина и пептида благодаря своим структурным особенностям. Он предотвращал образование фибрина за счет наличия у него фибриндеполимеризационной активности, проявлял антикоагулянтную активность, обусловленную его ингибирующим действием на активность тромбина. Появление как PGPL, так и комплекса в кровотоке стимулирует высвобождение тканевого активатора плазминогена из сосудистого эндотелия, что приводит к повышению ферментативных фибринолитических свойств крови, причем действие комплекса оказывается более эффективным. Также показано, что комплекс в значительной степени улучшает функционирование инсулярной системы у гипергликемических крыс, а его составная часть - гепарин модулирует функцию антикоагулянтной системы, участвуя в предотвращении процесса гиперкоагуляции, сопровождающей развитие СД2. В перспективе полученные нами результаты на модели крыс со стойкой гипергликемией могут быть применимы в клинической практике для пациентов с сахарным диабетом 2 типа, которые предрасположены к развитию тромботических осложнений.

About the authors

T. Yu. Obergan

Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology

Email: tobergan@mail.ru
Laboratory of protective blood systems n. a. prof. B.A. Kudryashov

N. F. Myasoedov

Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology

Email: E-mail-nfm@img.ras.ru
Laboratory of protective blood systems n. a. prof. B.A. Kudryashov

M. E. Grigorjeva

Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology

Email: mgrigorieva@mail.ru
Laboratory of protective blood systems n. a. prof. B.A. Kudryashov

L. A. Lyapina

Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology

Email: lyapinal@mail.ru
Laboratory of protective blood systems n. a. prof. B.A. Kudryashov

T. A. Shubina

Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology

Email: shubina@mail.ru
Laboratory of protective blood systems n. a. prof. B.A. Kudryashov

L. A. Andreeva

Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: landr@img.ras.ru

References

Supplementary files