Cerebroprotective effect of some phenolic acids under conditions of experimental brain ischemia

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Повреждение головного мозга в результате ишемических явлений остается основной причи- ной смерти и инвалидизации во всем мире [1, 2]. Социальные и экономические последствия инсульта требуют разработки эффективных фармакотерапев- тических подходов, в связи с чем становится акту- альным поиск новых соединений, применяемых для лечения и профилактики данной патологии. Для мирового научного и медицинского сообщества является острой проблема совершенствования фар- макологической коррекции и реабилитации лиц, перенесших острые нарушения мозгового кровоо- бращения [3]. Однако, на сегодняшний день проблема фарма- кологической коррекции инсульта остается трудно- достижимой целью, несмотря на различные крупные исследования, посвященных изучению патогенеза нарушений мозгового кровообращения и новых сое- динений, способные на него влиять [4, 5]. Опираясь на результаты новых отечественных и зарубежных исследований, можно полагать, что в чис- ле соединений, способных влиять на звенья ишемиче- ского инсульта особую роль занимают растительные биоактивные вещества, которые могут стать эффек- тивным средством лечения церебральной ишемии. Такие предположения, в основном, связаны с положи- тельными эффектами, которыми обладают вещества растительного происхождения. К ним относятся широ- та спектра фармакологической активности, возмож- ность применять данные соединения в комплексной терапии, а также минимальный риск возникновения нежелательных побочных эффектов [6, 7]. Известно, что коричная кислота обладает анти- оксидантной, противовоспалительной, антиапопти- ческой активностью [8]. На сегодняшний день мно- гими учеными также установлено положительное влияние различных фенольных соединений на те- чении нейро-дегенеративных заболеваний, в част- ности, болезни Альцгеймера [9]. Кофейная кислота (3,4-дигидроксициннаминовая кислота) является фе- нольным соединением, которое широко встречается в лекарственных растениях, а также фруктах, овощах, вине, кофе и оливковом масле [10]. Кофейная кис- лота обладает различными видами фармакологиче- ской активности, в том числе антиоксидантной [11], антигипертензивной [12], противовирусной [13], про- тивовоспалительной [14] и антидиабетической [15]. Недавно было также оценено церебрпротективное действие кофейной кислоты [16-18]. Галловая кислота является вторичным метаболитом, присутствующим в большинстве растений. Известно, что этот метаболит обладает рядом фармакологических свойств, включая антиоксидантные, противомикробные, противовоспа- лительные и противоопухолевые свойства [19]. ЦЕЛЬ - оценить церебропротективное действие кофейной, галловой, 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутил- коричной кислот в условиях экспериментальной це- ребральной ишемии. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Биологическая модель Эксперимент был на 42 крысах-самцах линии Wistar массой 220-240 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово». Все прово- димые с животными манипуляции, а также их со- держание соответствовали требованиям Европей- ской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других на- учных целей (Страсбург, 1986 г.). Проведение дан- ного исследования было одобрено Независимым Этическим Комитетом ПМФИ - филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России. Крысы размещались в макролоновых клетках, где в качестве подстилоч- ного материала использовали гранулированную древесную фракцию при относительной влажно- сти 60±5% и температуре воздуха 22±2°С. Корм и воду животные получали в свободном доступе. Предварительно крысы были рандомизированы по поведенческой активности в тестах УРПИ и ТЭИ. В ходе проведения исследования были сформирова- ны семь экспериментальных групп. Первая группа крыс - ложнооперированные (Л/О) животные (n=6). Вторая группа животных (n=6) - группа негативного контроля (НК), получала 0,9% раствор натрия хло- рида в эквивалентном объеме. Второй и последую- щим группам крыс (n=6 каждая группа) воспроизво- дили ишемическое повреждение головного мозга методом необратимой окклюзии правой средней мозговой артерии, при этом группы животных № 3-7 получали исследуемые соединения и препара- ты сравнения (Рис. 1). Референтные препараты и исследуемые соединения В качестве препаратов сравнения были выбраны этилметилгидроксипиридина сукцинат (Мексикор, 100 мг/кг, ЭкоФармИнвест, Россия) [20, 21] (рис. 1). Препараты сравнения и исследуемые соединения вво- дили интрагастрально на следующие сутки после вос- произведения ишемии и далее на протяжении 3 суток. Исследуемые соединения: 4- гидрокси-3,5-ди-трет-бу- тилкоричную, кофейную и галловую кислоты, вводили животным в дозировке 100 мг/кг (Рис. 1). Модель фокальной ишемии головного мозга Фокальную ишемию головного мозга моделиро- вали путем необратимой правосторонней тер- моко- агуляции средней мозговой артерии под хлоралги- дратным наркозом (350 мг/кг). Область ниже и правее глаза депилировали, делали надрез и раздвигали мяг- кие ткани, обнажая отросток скуловой кости, который удаляли. Далее буром проделывали трепанационное отверстие и термокоагулятором пережигали среднюю мозговую артерию под местом ее пересечения с обо- нятельным трактом. В дальнейшем, по возможности, восстанавливали топографию мягких тканей. Шов обрабатывали 5% спиртовым раствором йода. Забор биоматериала осуществляли на 4-й день после вос- произведения фокальной ишемии. Когнитивные тесты До воспроизведения ишемии, животные всех групп обучались навыку условного рефлекса пассив- ного избегания (УРПИ) и теста экстраполяционного избавления (ТЭИ). Суть теста УРПИ заключается в фор- мировании памятного следа у животных, после чего время латентного захода в темный отсек, где пода- ется ток, удлиняется, либо крыса вообще не заходит в него. Тест экстраполяционного избавления также позволяет оценить когнитивные функции животных, основываясь на времени подныривания крысы из цилиндра. Последующие воспроизведения УРПИ и ТЭИ, а также оценка поведенческой̆ активности и эмоционального статуса животных проводилась на четвертые сутки с помощью тестов УРПИ (фиксирова- лось латентное время захода крыс в темный отсек) и тест экстраполяционного избавления ТЭИ (фиксиро- валось время подныривания крыс) [22, 23]. Определяемые лабораторные показатели В качестве биоматериала в работе использовали головной мозг и кровь животных. Исследуемые по- казатели: концентрация молочной и пировиноград- ной кислот в сыворотке крови, величина зоны не- кроза и степень отека мозговой ткани. Содержание молочной и пировиноградной кислот в сыворотке крови определяли энзиматическим колориме- трическим методом с применением стандартного набора реактивов производства НПФ «Арбис +» (Санкт-Петербург, Россия). Оценку зоны некроза производили трифенилтетразолиевым методом, в основе которого лежит изменение оптической плотности хлороформного экстракта формазана между некротизированным и интактным участком головного мозга [24]. Оценку степени гидратации головного мозга производили методом высушива- ния, для чего у животных извлекали головной мозг, инкубировали 24 часа при 60ºС. Величину отека го- ловного мозга устанавливали по разнице масс до и после инкубации [23]. Методы статистического анализа Обработку результатов эксперимента проводили методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). По- лученные данные проверяли нормальность распре- деления с помощью критерия Шапиро-Уилка. В том случае, если данные распределения оказывались нормальными, для сравнения средних использовали ANOVA с апостериорным критерием Ньюмена-Кейс- ла. В случае ненормального распределения резуль- татов опыта, дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Вил- коксона. РЕЗУЛЬТАТЫ В тесте УРПИ после воспроизведения ишемии у крыс НК группы отмечено снижение латентного вре- мени захода крыс в темный отсек на 10% (р<0,05), время подныривания животных в тесте экстрапо- ляционного избегания было увеличено на 69,6% (р<0,05) относительно Л/О группы животных. Тесты УРПИ и ТЭИ показали, что все экспери- ментальные соединения положительно влияют на когнитивные функции крыс на фоне церебральной ишемии. В тесте УРПИ на фоне введения всех иссле- дуемых соединений наблюдалось статистическое значимое увеличение времени латентного захода в темный отсек. В сравнении с группой животных НК максимальный эффект был отмечен при введении кофейной кислоты: увеличение латентного времени захода в темный отсек составило 239,39% (р<0,05), на фоне введения галловой кислоты - 129,09% (р<0,05), 4- гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты - 90,15% (р<0,05). Введение животным Мексикора вызывало увеличение время захода в темный отсек на 71,2% (р<0,05). Отметим, что все фенольные со- единения превосходили по своему эффекту рефе- ретный препарат: кофейная кислота - на 103,74% (р<0,05), галловая кислота - 33,8% (р<0,05), 4-ги- дрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричная кислота - 11,06 (р<0,05) (Рис. 2). В тесте экстраполяционного избавления (ТЭИ) оценивали показатель латентного времени под- ныривания. В данном тесте в сравнении с груп- пой животных НК у крыс, получавших 4-гидрок- си-3,5-ди-трет-бутилкоричную кислоту, отмечено уменьшение времени подныривания на 1042,2% (р<0,05), тогда как при применении кофейной кис- лоты и галловой кислоты данный показатель умень- шился на 358,9% (р<0,05) и 229,48% (р<0,05) соот- ветственно. В этих же условиях введение Мексикора уменьшало время подныривания относительно груп- пы крыс НК на 96,69% (р<0,05). Следовательно, 4- ги- дрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричная, кофейная и гал- ловая кислоты превосходили референтный препарат в данном тесте на 477,7% (р<0,05), 132,14% (р<0,05), и 66,6% (р<0,05), соответственно. (Рис. 2). Воспроизведение фокальной ишемии головно- го мозга крысам вызвало развитие отека и некроза мозговой ткани (52,38±3,03), что соответствует лите- ратурным данным [26]. Наблюдалось значительное увеличение образования лактата (176,8% (р<0,05)), пирувата (99,9% (р<0,05)), а также гомоцистеина (352,2% (р<0,05)) (Табл. 1). Введение референтного препарата способствовало уменьшению концентрации лактата, пирувата и гомо- цистеина. Так, у группы животных, получавших Мекси- кор, наблюдалось снижение лактата (16,3% (р<0,05)), пирувата (71,68% (р<0,05)), и гомоцистеина (73,45% (р<0,05)), относительно группы крыс НК. (Табл. 1). При введении животным 4-гидрок- си-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты было отмече- но снижение концентрации лактата в сыворотке кро- ви на 151,26% (р<0,05), пирувата на 38,78% (р<0,05), гомоцистеина на 102,18% (р<0,05) относительно группы животных НК. Стоит подчеркнуть, что на фоне применения 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты, наблюдалось большее уменьшение обра- зования лактата - 115,96% (р<0,05) и гомоцистеина - 16,5% (р<0,05) по сравнению с группой крыс, полу- чавшей Мексикор. (Табл. 1). У крыс, получавших галловую кислоту также на- блюдали снижение образования лактата, пирувата и гомоцистеина на 48,02% (р<0,05), 33,3% (р<0,05), 28,8% (р<0,05) соответственно относительно группы крыс НК. В сравнении с группой, получавшей Мекси- кор введение галловой кислоты больше снижало уро- вень образования лактата на 27,2% (р<0,05) (Табл. 1). Введение кофейной кислоты также вызывало снижение образования лактата - 40,37% (р<0,05) пирувата - 96,6% (р<0,05) и гомоцистеина - 59,6% (р<0,05) относительно группы крыс НК. При сравне- нии с группой животных, которой вводили Мекси- кор, отмечено, концентрация лактата и пирувата в сыворотке крови была на 20,65% (р<0,05) и 14,52% (р<0,05) выше у данной группы животных, нежели у крыс, получавших кофейную кислоту (Табл. 1). У крыс, получавших Мексикор отмечено сниже- ние отека мозговой ткани относительно группы крыс НК на 9,36% (р<0,05). Введение крысам кофейной, 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной и галловой кислот вызывало уменьшение гидратации мозговой ткани относительно группы животных НК на 11,08% (р<0,05), 10,47% (р<0,05) и 9,92% (р<0,05), соответ- ственно (Рис. 3). По влиянию на степень формирования некро- за головного мозга, из трех экспериментальных соединений и референтного препарата наиболее эффективным оказалось введение крысам 4-ги- дрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты. Так, относительно группы крыс НК, введение 4- гидрок- си-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты уменьшало степень некроза на 165,11% (р<0,05), кофейной кис- лоты на 122,79% (р<0,05), при этом введение крысам Мексикора - на 83,4% (р<0,05). Подчеркнем, что 4-ги- дрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричная кислота превосхо- дила Мексикор на 44,8% (р<0,05) (Рис. 3). ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Фокальная церебральная ишемия приводит к истощению энергетических запасов мозга. В биохи- мических тестах это проявляется снижением содержа- ния макроэргов (АТФ, креатинфосфата), увеличением количества недоокисленных продуктов (АДФ, АМФ, лактат, пируват, гомоцистеин), снижением энерге- тического заряда системы, а также развитием лакта- цидоза [26]. Лактат, пируват, гомоцистеин относятся к веществам - биомаркерам различных нейродеге- неративных заболеваний, в числе которых инсульт, болезнь Альцгеймера, а также патологий, вызванны- ми снижением функций митохондрий [27]. Наше ис- следование показало, что фенолокислоты оказывают положительное влияние на энергообмен в головном мозге на фоне церебральной ишемии у крыс, снижая концентрацию лактата, пирувата и гомоцистеина в сыворотке крови. Отдельно стоит отметить уменьше- ние степени некротизированности ткани мозга при введении животным экспериментальных соедине- ний. Потенциальный церебропротективный эффект фенольных соединений может быть связан с химиче- ской структурой данных веществ и их антирадикаль- ным действием [28]. Церебропротективное действие 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной, кофейной и галловой кислот также может быть связано с их анти- оксидантными, противоапоптическими, и противо- воспалительными свойствами [8-19]. Возможно, что фенольные соединения улучшают функциональную активность митохондрий, которые наиболее чувстви- тельны к ишемическим состояниям организма [29]. Митохондрии - органеллы, являющиеся одними из основных производителей активных форм кислорода (АФК). Так как АФК играют одну из ключевых ролей в индукции митохондриальных пор, предотвращение развития окислительного стресса - эффективный ме- тод остановки клеточной гибели, а антиоксиданты, в частности, фенолокислоты, могут быть использованы в качестве средств фармакологической коррекции митохондриальной дисфункции на фоне фокальной ишемии головного мозга. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричная, кофей- ная и галловая кислоты на фоне церебральной ише- мии крыс улучшали метаболические процессы и энергообмен мозга, оказывали положительное вли- яние на когнитивные функции. Экспериментальные соединения могут обладать потенциальной церебро- протективной активностью на фоне фокальной ише- мии головного мозга животных, о чем свидетельству- ют данные эксперимента. Это создает предпосылки для дальнейшего углубленного изучения фенольных соединений, в частности, производных коричной кислоты, с целью подтверждения церебропротектив- ных свойств, а также для продолжения поиска сое- динений растительного происхождения, способных оказывать церебропротективное действие.

About the authors

A. V. Voronkov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: prohor77@mail.ru

D. I. Pozdnyakov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: pozdniackow.dmitry@yandex.ru

S. A. Nigaryan

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: 79682650210@yandex.ru

References

Supplementary files