Аддитивное нейропротективное действие производных 3-гидроксипиридина и эритропоэтина человека на модели геморрагического инсульта у крыс

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Значение инсульта как медицинской и социальной проблемы с каждым годом возрастает во всем мире, что связано с увеличением среднего возраста населения, а также с увеличением числа людей с факторами риска цереброваскулярных заболеваний и сердечно-сосудистой системы.

В настоящее время для профилактики и лечения цереброваскулярных заболеваний широко применяются лекарственные препараты и новые соединения так называемого нейропротективного действия, в основе которого лежат разнообразные механизмы, включающие антиоксидантный, антигипоксический, антиапоптический и другие эффекты.

В клинической практике в терапии цереброваскулярных заболеваний широко применяются антиоксидантные препараты на основе 3-гидроксипиридина, например мексидол, этоксидол, эмоксипин; так как они ингибируют процессы перекисного окисления липидов, повышают активность антиоксидантных ферментов, за счет чего модулируется активность рецепторов и мембраносвязанных ферментов [1].

Однако, несмотря на достижения современной нейрофармакологии, наблюдается рост числа больных с данной патологией, их высокая летальность (50–70% больных) [2] и инвалидизация (примерно 2/3 больных) [3]. Вопросы медикаментозной поддержки больных с острым нарушением мозгового кровообращения остаются важнейшей проблемой современной фармакологии и неврологии.

Уже несколько десятилетий накапливаются экспериментальные данные, подтверждающие высокий нейропротекторный потенциал эритропоэтина. Его молекула наиболее известна, как положительный регулятор эритропоэза, который вырабатывается преимущественно в почках в ответ на снижение парциального давления кислорода. Однако, спектр физиологических эффектов эритропоэтина довольно широк и позволяет рассматривать его, как агент с универсальной цитопротекторной направленностью. Запускаемые ими метаболические каскады метаболических процессов приводят к повышению устойчивости клеток к повреждению, что объединяют в понятие «негематопоэтических эффектов эритропоэтина» [4]. При ишемических поражениях разных органов эритропоэтин обуславливает ангиогенное, антиоксидантное, противовоспалительное и антиапоптотическое действие [5], что приводит к уменьшению объёма повреждения. В то же время, ввиду активации большого количества вторичных посредников эритропоэтин способен обуславливать развитие таких негативных эффектов, как увеличение продукции эндотелина, повышение концентрации тканевого ренина, изменение баланса простагландинов сосудистой ткани, стимуляция ангиогенеза и пролиферация клеток гладких мышц сосудов [6, 7]. Карбамилированный дарбэпоэтин принципиально отличается от препаратов на основе эритропоэтина, сочетая в себе лучшие качества препаратов предыдущих поколений [8, 9].

ЦЕЛЬЮ данного исследования является изучение терапевтической эффективности производных 3-гидроксипиридина и эритропоэтина, а также их комбинаций при моделировании внутричерепной гематомы у крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Соответствие правилам организации проведения лабораторных исследований

Исследование проведено в соответствии с утверждёнными правилами лабораторной практики Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГОСТ 51000.3-96 и 51000.4-96) от 19 июня 2003 года № 267 «О надлежащих правилах лабораторной практики», заключение локального этического комитета № 6 от 05.10.2018.

Дизайн исследования

Самцы крыс линии Вистар массой 200–250 граммов были распределены на несколько групп: 1 – ложно оперированные крысы (10 животных), которых наркотизировали, затем проводили скальпирование и трепанацию черепа, но не осуществляли деструкцию мозговой ткани; 2 – животные с геморрагическим инсультом, не получающие лекарственных препаратов (контрольная группа, 23 крысы); 3 группа – животные с геморрагическим инсультом, которым вводили этоксидол (23 крысы); 4 – животные с моделированной патологией, которые получали карбамилированный дарбэпоэтин (20 крыс), 5 – крысы с геморрагическим инсультом, получавшие карбамилированный дарбэпоэтин и этоксидол (23 крысы).

Методика моделирования геморрагического инсульта

Острый гeморрагический инсульт моделировали в области внутренней капсулы правого полушария, согласно методике А.Н. Макаренко и соавторов [10] в авторской модификации, которая была разработана, реализована и защищена авторским свидетельством [11]. Операция выполнялась в условиях общей анестезии. После премедикации препаратом «Xyla» в дозе 0,1 мл крысам в качестве базисного наркоза внутрибрюшинно вводился хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг. По достижению глубокого наркоза проводился забор крови с помощью шприца из хвостовой вены крысы. Затем проводилась обработка операционного поля, линейный разрез кожи головы в теменной области. Разрез выполнялся во фронтальной плоскости, с последующим проведением гемостаза. Длина разреза составляла 1,5 см. В дальнейшем выполнялось скелетирование кости, отделение надкостницы. С помощью стоматологического бора накладывалось трепанационное отверстие в правой теменной области. Диаметр трепанационного отверстия составлял 3 мм. Далее, с помощью устройства для стереотаксического введения, вводилась пункционная игла в области внутреннeй капсулы (координаты H=4 мм, L=3,1 мм, А=1,5 мм от брeгмы по атласу G. Pаxinos) на глубину 3,0 мм. Затем устройство фиксировалось, и внутрь иглы вводился мандрен-нож, осуществлялась деструкция мозговой ткани (мандрен-нож проворачивался в три оборота почасовой и в три оборота против часовой стрелки). Мандрен-нож извлекался и в стерильных условиях крысе вводилась аутокровь, взятая из хвостовой вены животного, в объеме 0,11 мл на 100 г веса. Введение крови осуществля- лось струйно. Эффективность введения определялось по наличию стволовых судорог. После чего пункционная игла извлекалась, рана осушалась, производился контроль гемостаза и послойное ушивание раны. Ложно оперированным животным проводили скальпирование и трепанацию черепа.

Исследуемые препараты вводились животным внутрибрюшинно. Карбамилированный дарбэпоэтин, ООО «Фармстандарт», Россия, вводился предварительно трехкратно в дозе 100 мкг/кг с интервалом 3 дня (суммарная доза 300 мкг/кг), последнее введение за 1 час до операции. Производное 3-гидроксипиридина этоксидол, ОАО «Синтез», Россия, вводился однократно за 1 час до операции в дозе 50 мг/кг (согласно межвидовому коэффициенту пересчёта средней терапевтической дозы для человека). Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалeнтном объёме.

Влияние препаратов на выживаемость животных

Наблюдения проводились в тeчeниe 14 дней после опeрации на 1, 3, 7 и 14-е сутки. Изучались характеристики поведения и состояния животных на 1, 3, 7 и 14-е сутки.

Исследование неврологического статуса

Для оценки нарушения поведения и состояния животных после геморрагического инсульта использовали комплекс методов, традиционно применяемых для этих целей в эксперименте. Для оценки неврологического статуса использовали метод оценки неврологического дефицита по шкале оценки инсульта McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) [12]. Для оценки мышечного тонуса путём измерения силы хвата конечностей нами был разработан динамометрический программно-аппаратный комплекс.

При оценке неврологического статуса по шкале оценки инсульта McGrow в модификации И.В. Ганнушкинной (с легкими симптомами – до 3 баллов) – провисающие движения, слабость конечностей, односторонние полупрозрачные, тремор, маневрирующие движения; и при тяжелых проявлениях неврологических расстройств (от 3,5 до 10 баллов) – парезах и параличах конечностей, а также боковом положении и угнетении сознания.

Измерение силы животных в хватательной пробе осуществлялось при помощи динамометра. В качестве критерия сравнения определялась относительная величина (удельная сила), вычисляемая путём деления максимальной силы хвата на массу тела крысы.

С целью оценки ориентировочно-исследовательского поведения использовалась платформа для изучения двигательной активности лабораторных животных ACTI-TRACK (PANLAB HARVARD APPARATS). Тестирование крысы осуществлялось в течение 5 минут в инфракрасном мониторе активности до создания патологии, а также на 1, 3, 7 и 14-е сутки после моделирования геморрагического инсульта.

Морфологическое исследование

Для макроскопического подтверждения повторяемости результатов, верификации локализации геморрагического очага и степени повреждения по 3 головных мозга крысы из 2, 3 и 5-й групп на 4-е сутки исследовали НАДН-дегидрогеназную активность по общепринятому методу окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым (ТТХ). Мозг животных извлекался, разрезался на 2 фронтальных среза через место входа мандрен-ножа в ткань мозга. Окрашивание проводили в 1% растворе ТТХ (Sigma Aldrich) 30 мин в термостате при 37 °С. Затем проводили фотографирование и макроскопическую оценку срезов.

Для гистологической оценки мозга животных выводили из эксперимента через 24 часа, 7 и 14 суток после начала исследования. Описание и оценку последствий геморрагического инсульта проводили по рекомендациям атласа гистопатологий нервной системы [13]. Крыс декапитировали, забирали головной мозг, фиксировали его в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24–48 часов и заливали в парафин. Фронтальные гистологические срезы головного мозга толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В исследовании были использованы микроскоп «МИКМЕД-6» с бинокулярной насадкой, электрической подсветкой, с цифровой камерой МС-5 и компьютер с программным обеспечением «МСview».

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи STATISTICA 10.0 и Microsoft Excel 2016. После оценки нормальности распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка вычисляли средние арифметические, 95% доверительные интервалы (при параметрическом распределении) и квартильный размах (при непараметрическом распределении). Для оценки достоверности межгрупповых различий при нормальном распределении использовали критерий Стьюдента, при распределении отличном от нормального – критерий Манна-Уитни. Для оценки выживаемости использовали процедуру построения кривых дожития, различия мeжду группами считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние препаратов на выживаемость животных

Во время операции и в течение 1-х суток после нее в контрольной группе погибло 50% крыс с геморрагическим инсультом. Через 1 день 50% крыс с геморрагическим инсультом умерли в контрольной группе. В группе животных, получавших исследуемые вещества, смертность в течение 1-го дня была ниже, чем в контроле (рис. 1). В частности, в группах крыс, получавших карбамилированный дарбэпоэтин или этоксидол, суточная выживаемость составляла 70%. В группе комбинированного применения карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола ранняя выживаемость (1 день) составила 90%.

 

Рисунок 1 – Влияние этоксидола, карбамилированного дарбэпоэтина и их комбинированного применения на показатели выживаемости животных на 1, 3, 7 и 14-е сутки после моделирования геморрагического инсульта

 

Особого внимания заслуживает тот факт, что в группах исследуемых веществ после 7-х суток гибели животных не отмечалось.

Все исследуемые вещества более чем на 40% повышали итоговую (14-суточную) выживаемость по сравнению с контрольной группой (p<0,05). Наилучшие показатели выживаемости на 14-е сутки зафиксированы в группе комбинированного применения этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина – итоговая выживаемость животных этой группы составила 75%.

В группе ложнооперированных животных в течение всего времени наблюдения смертельных исходов не зафиксировано.

Оценка неврологического дефицита по шкале MсGrow

На первый день после операции пoчти у всех крыс наблюдались выраженные неврологические нарушения в виде круговых движений, парезов и параличей конечностей (табл. 1). В группе ложнooперирoвaнных крыс серьезных неврологических изменений не наблюдалось, только у 31% животных этой группы установлена вялость и замедленное движение.

 

Таблица 1 – Влияние этоксидола, карбамилированного дарбэпоэтина и их комбинированного применения на показатели неврологического статуса на 1, 3, 7 и 14-е сутки после моделирования геморрагического инсульта

До моделирования патологии
	контроль	этоксидол	CDEPO	CDEPO +этоксидол
удельная сила	7,0±0,3	7,5±0,2	7,4±0,3	7,7±0,3
McGrow	0	0	0	0
1-е сутки
	контроль	этоксидол	CDEPO	CDEPO +этоксидол
удельная сила	2,7±0,3	3,1±0,2	3,1±0,2*	3,1±0,1*
McGrow	8,1±2,0	6,7±2,4*	7,2±2,0	5,6±1,8*
3-и сутки
	контроль	этоксидол	CDEPO	CDEPO +этоксидол
удельная сила	4,0±0,5	4,5±0,5	4,6±0,2*	5,1±0,3*
McGrow	6,4±2,6	4,3±1,8*	4,2±2,5*	3,9±2,4*
7-е сутки
	контроль	этоксидол	CDEPO	CDEPO +этоксидол
удельная сила	4,5±0,3	4,6±0,3	4,8±0,3	4,2±0,5
McGrow	5,4±2,1	3,3±2,1*	3,2±2,2*	2,9±1,9*
14-е сутки
	контроль	этоксидол	CDEPO	CDEPO +этоксидол
удельная сила	4,7±0,2	5,0±0,5	4,5±0,4	4,5±0,5*
McGrow	5,0±2,5	3,0±0,5	2,4±0,6*	1,1±0,5*

Примечание: *p<0,05 – различия статистически достоверны при сравнении с животными контрольной группы

 

Крысы, получавшие исследуемые вещества, в течение всего времени наблюдения имели статистически достоверный менее выраженный неврологический дефицит по сравнению с группой контроля.

Группа крыс, получавших комбинацию препаратов этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина, уже с первых суток отличалась более быстрым восстановлением неврологических нарушений. К 7-м суткам более 50% крыс, получавших комбинацию исследуемых препаратов, имели легкий неврологический дефицит (до 3 баллов по шкале MсGrow) в видe замедленности движений, слабости конечностей, одностороннего полуптоза и манежных движений. К 14-м суткам у крыс этой группы наблюдался лишь незначительные изменения в неврологическом статусе – 1,1±0,5 по шкале инсульта MсGrow.

Исследования мышечного тонуса

Исследование силы хвата лап крыс выявило, что в первые сутки после инсульта мышечный тонус в контрольной группе и в группе, получавшей карбамилированный дарбэпоэтин, существенно не отличаются и составляют в среднем 56% (тaбл. 1). На фоне введения этоксидола снижение мышечного тонуса за 1-й день составило 38,3%, что было значительно меньше, чем в контрольной группе. Самое большое снижение мышечного тонуса наблюдалось в группе крыс, получавших комбинацию изученных препаратов, и составило 27,4%. На 3-и сутки отмечался прирост мышечной силы во всех группах, причём в группах, получавших исследуемые вещества, прирост оказался достоверно выше, чем в контрольной группе. На 7-е и 14-е сутки статистически значимое возрастание мышечной силы было только при введении карбамилированного дарбэпоэтина и комбинации карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола.

Влияние исследуемых препаратов на двигательную активность животных с геморрагическим инсультом. В течение 1–7-х суток после моделирования геморрагического инсульта показатели общей активности (рис.2), общей дистанции (рис. 3) при воздействии этоксидола и комбинации препаратов карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола были достоверно выше, чем в контрольной группе.

 

Рисунок 2 – Влияние этоксидола, карбамилированного дарбэпоэтина и их комбинированного применения на показатели общей активности, вычисляемые программой «Acti-Track», на 1, 3, 7 и 14-е сутки после моделирования геморрагического инсульта

Примечание: *p<0,05 – различия статистически достоверны при сравнении с животными контрольной группы.

 

Рисунок 3 – Влияние этоксидола, карбамилированного дарбэпоэтина и их комбинированного применения на показатели общей дистанции, вычисляемые программой «Acti-Track», на 1, 3, 7 и 14-е сутки после моделирования геморрагического инсульта

Примечание: *p<0,05 – различия статистически достоверны при сравнении с животными контрольной группы

 

Показатели общей активности и пройденной дистанции крыс, получавших карбамилированный дарбэпоэтин, на 1-е сутки значительно уступали результатам животных, получавших этоксидол и комбинацию препаратов и не имели достоверных различий с группой контроля. Однако к 3-м суткам активность животных, получавших карбамилированный дарбэпоэтин, нарастала и не имела статистически значимых отличий от групп других исследуемых веществ. Следует отметить, что к 14-м суткам показатели активности животных этой группы даже превышали таковые в группе этоксидола, и ненамного уступали группе комбинации препаратов.

Наиболее сильно и быстро показатели общей активности уже с 1-х суток повышала комбинация препаратов, по сравнению с их монотерапией.

Высокие показатели активности контрольной группы на 14-е сутки можно объяснить высокой летальностью в данной группе и выживаемостью лишь наиболее сильных особей с высоким регенераторным потенциалом.

Морфологическое исследование

Для макроскопического подтверждения повторяемости результатов и адекватности методики клиническим случаям геморрагического инсульта проведено исследование мозга умирающих на 1 и 4–5 сутки путём окрашивания срезов мозга 2,3,5-трифенилтеразолием хлористым (рис. 4).

 

Рисунок 4 – Эффективность аддитивного нейропротекторного действия карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола при моделировании геморрагического инсульта у крыс. Макроскопический снимок окрашенных трифенилтетразолием хлористым срезов мозга

Примечание: А. Срез мозга умирающей крысы контрольной группы на 1-е сутки. B. Срез мозга умирающей крысы из группы контроль на 5-е сутки. С. Срез мозга умирающей крысы из группы CDEPO+этоксидол

 

Макроскопическая оценка подтвердила адекватность применения нейропротективной терапии в модели геморрагического инсульта (рис.4). Очевидно, что причины смертности на 1-е сутки были связаны как с непосредственным воздействием введённой в ткань мозга крови, так и с дислокационными осложнениями, однако начиная с 4-х суток смертность обусловлена массивным перифокальным некрозом.

Микроскопическое исследование случайно выбранных в каждой группе крыс показало следующее. У животных контрольной группы на 1-е сутки после моделирования внутримозгового кровоизлияния по периферии гематомы выявлялся выраженный отек, нарушение гистоархитектоники слоев нейронов коры, выраженные ишемические изменения, кариолизис нейронов, умеренно выраженная перифокальная лейкоцитарная реакция и менее выраженная глиальная реакция (рис. 5А). Отмечается полиморфизм нейронов: набухание тел нейронов, ядра нейронов деформированы, базофильны, ядрышки смещены к периферии, деформированы. Местами ядро и ядрышки почти или совершенно неразличимы. Кариолизис нейронов, умеренно выраженная перифокальная лейкоцитарная реакция и менее выраженная глиальная реакция (рис. 5А). На 7-е сутки, умеренно выраженная перифокальная лейкоцитарная реакция сменилась на умеренно выраженную глиальную и макрофагальную реакцию с примесью единичных гемосидерофагов (рис. 5В). На 14-е сутки умеренно выраженная глиальная и макрофагальная реакция сохраняется, количество гемосидерофагов незначительно увеличилось (рис. 5С).

 

Рисунок 5 – Ткань головного мозга крысы в области гематомы

Примечание: А – контрольная группа на 1-е сутки; В – контрольная группа на 7-е сутки; С – контрольная группа на 14-е сутки. Окрашивание: гематоксилин и эозин; ×400

 

При анализе группы с использованием препарата этоксидол перифокальный отек менее выражен по сравнению с контрольной группой (рис. 6А) и группой карбамилированного дарбэпоэтина (рис. 7А), но более выражен, чем в группе комбинированного применения карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола (рис. 8А). У животных, получавших карбамилированный дарбэпоэтин и комбинацию препаратов, были более ярко выражены признаки воспалительной реакции с развитием лейкоцитарной инфильтрации. В тоже время, ее выраженность не достигала той степени интенсивности, которая отмечалась в контрольной группе. На 7-е сутки глиальная и макрофагальная реакция в группах этоксидола (рис. 6В) и карбамилированного дарбэпоэтина (рис. 7В) опережала контрольную группу, а в группе комбинированного применения карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола (рис. 8В) выявлялись более выраженные процессы резорбции в виде скопления немногочисленных макрофагов с внутриклеточным скоплением кровяного пигмента (гемосидерофаги). На 14-е сутки процессы резорбции в группах этоксидола (рис. 6С) и карбамилированного дарбэпоэтина (рис. 7С) опережали контрольную группу, но признаки резорбции и организации в группе комбинированного применения карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола (рис. 8С) более выражены в виде скопления многочисленных гемосидерофагов с внутриклеточным скоплением кровяного пигмента (гемосидерофаги) и внеклеточным скоплением кровяного пигмента.

 

Рисунок 6 – Ткань головного мозга крыс в области гематомы, получавших этоксидол

Примечание: А – на 1-е сутки; В – на 7-е сутки; С – на 14-е сутки. Окрашивание: гематоксилин и эозин; ×400

 

Рисунок 7 – Ткань головного мозга крыс в области гематомы, получавших карбамилированныйдарбэпоэтин

Примечание: А – на 1-е сутки; В – на 7-е сутки; С – на 14-е сутки. Окрашивание: гематоксилин и эозин; ×400

 

Рисунок 8 – Ткань головного мозга крыс в области гематомы, получавших комбинацию карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола

Примечание: А – на 1-е сутки; В – на 7-е сутки; С – на 14-е сутки. Окрашивание: гематоксилин и эозин; ×400

 

Таким образом, по данным гистолoгичeского исследовaния, одновременное введение комбинации карбамилированного дарбэпоэтина и этоксидола приводит к ускорению регресса перифокального отёка и восстановлению микроциркуляции, снижению количества повреждённых нейронов и глиальных элементов, ускорению процессов резорбции и организации очага кровоизлияния.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования подтверждают наличие нейропротективных свойств у всех исследуемых веществ. Однако нейропротективная активность карбамилированного дарбэпоэтина развивалась более медленно – к 3-м суткам, в отличие от этоксидола и комбинации этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина, у которых церебропротективные свойства отмечались уже на 1-е сутки (меньшая выраженность неврологических нарушений и большая активность животных данных групп в инфракрасном мониторе).

Комбинация этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина обладает более выраженными нейропротективными свойствами, нежели изолированное их применение, проявляющаяся более высокими показателями выживаемости животных данной группы, значительным уменьшением выраженности постинсультных нарушений уже с первых суток, а также при гистологическом исследование срезов головного мозга.

Аддитивное действие данных препаратов обуславливается их механизмом действия. Предположительный синергизм достигается за счет воздействия на различные структуры и компоненты клетки.

Этоксидол относится к числу ингибиторов свободнорадикальных процессов. Присутствие 3-гидроксипиридина в молекуле этоксидола обеспечивает его спектр антиоксидантных и мембратопротективных эффектов, а описанные у ряда авторов явления уменьшения эксайтотоксичности глутамата, мoдулирование чувствительности рецепторов, мембранoсвязанных ферментов (умано-стераза, аденилатциклаза), ингибирование свободнорадикальных стадий синтеза простагландинов приводит к поливалентности нейропротективного эффекта [14].

Малaт, входящий в состав этоксидoла, проникает через гематоэнцефалический барьер. Затем он метаболизируется с образованием аденозинтрифосфата. Это происходит даже во время гипоксии, что помогает нервным клеткам пережить отсутствие кислорода. При этом малат может превращаться в фумарат и даже сукцинат. В зависимости от глубины ишемии и энергетического дефицита малaт может превращаться с образованием АТФ в условиях ограниченного количества кислорода в клетке или может восстанавливаться до сукцината «в резерв». Исследователями было установленo, что клетка не расходует АТФ-энергию на транспорт малата в митохондрии, а использует специальный малат-аспартатный челнок. Была продемонстрирована способность малата увеличивать дыхaтельный коэффициент митохондрий и восстанавливать цитохром b5 в присутствии никотинамидадениндинуклеoтида, кoфермента, участвующего в окислительно-восстановительных реакциях [15–17].

Кроветворные функции эритропоэтина обусловлены его влиянием на центральную нервную систему. Рецепторы эритропоэтина экспрессируется на поверхности нейронов [17, 18]. При различных повреждениях ЦНC наблюдается синтез астроцитами эритропоэтина, имеющий нейропротективное действие [19-21], игибируя aпоптоз, он стимулирует пролиферацию нейрoнов и ангиогенез.

Карбамилированный дарбэпоэтин, гипергликозилированный вариант рекомбинантного эритропоэтина человека, обладает менее выраженными гемопоэтическими свойствами нежели базисная молекула за счет гетеродимерному рецептору EpoR/CD131, чем к гомодимерному рецептору EpoR/EpoR [22]. При связывании молекулы карбамилированный дарбэпоэтин, так же как и эритропоэтина, с рецептором EpoR запускается каскад реакций фосфорилирования ключевых белков, таких как Ras-митогенактивирующая протеинкиназа, Янус-киназа-2 и др., которые, в свою очередь, активируют экспрессию генов семейства bcl-xL и синтез антиапоптических белков, подавляющих апоптотическую гибель клеток [23, 24].

Однако, благодаря карбамилированию первичных аминов белка и аминокислотных остатков лизина белка в N-концевой области, не затрагивая профиль гликозилирования целой молекулы, карбамилированный дарбэпоэтин не взаимодействует с классическим эритропоэтиновым рецептором (не стимулирует пролиферацию клеток линии TF1), и не обладает рядом побочный нежелательный эффект, таких как повышение артериального давления и риск образования тромбов, что, в случае цереброваскулярных заболеваний, категорически противопоказано [25–27].

Полученные результаты определяют возможность дальнейшего изучения нейропротективных эффектов комбинации этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина, и возможного будущего её внедрения в клиническую практику для лечения и профилактики цереброваскулярных заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследуемые производные 3-гидроксипиридина и эритропоэтина человека обладают нейропротективным действием, что проявляется в наименьшей выраженности неврологических нарушений и более быстрым уменьшением признаков нейродегенерации, ускоренными процессами организации кровоизлияния.

Нейропротективная активность карбамилированного дарбэпоэтина развивалась более медленно – к 3-м суткам, в отличие от этоксидола и комбинации этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина, у которых церебропротективные свойства отмечались уже на 1-е сутки.

Комбинация этоксидола и карбамилированного дарбэпоэтина обладает более выраженными нейропротективными свойствами, которые проявляются значительным уменьшением выраженности постинсультных нарушений. Эти различия заметны уже к 1-му дню заболевания, что подтверждается более высокой выживаемостью после моделирования патологии, активностью животных данной группы, а также гистoлогическим исследованием срезoв мозга – более быстрым уменьшением перифокальногo отёкa и нарушений микрoциркуляции, меньшим повреждением нейронoв и глиальных элементов и более быстрыми процессами резoрбции и организации кровоизлияния.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Данное исследование не имело какой-либо поддержки от сторонних организаций.

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

П.Д. Колесниченко – работа над концепцией и дизайном исследования, реализация эксперимента, обработка результатов, написание текста; О.В. Щеблыкина – статистическая обработка результатов, редактирование; Н.И. Нестерова – сбор и обработка морфологического материала, полуколичественный морфологический анализ; Д.В. Щеблыкин – сбор и обработка материала, реализация эксперимента; А.В. Нестеров – доработка экспериментальной модели, работа над концепцией и дизайном исследования, реализация эксперимента, морфологической исследование; М.В. Покровский – работа над концепцией и дизайном исследования, административная организация экспериментальной работы; М.А. Жученко – работа над концепцией исследования, производство карбамилированной формы дарбэпоэтина; А.В. Тверской – редактирование морфологического исследования экспериментального материала; К.М. Резников – утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствие конфликта интересов.

Об авторах

Павел Дмитриевич Колесниченко

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: farpavel@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2434-994X

доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Олеся Викторовна Щеблыкина

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: sheolvi31@gmail.com

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Наталья Игоревна Нестерова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»; Судебно-гистологическое отделение ОГБУЗ «Белгородское бюро судебно-медицинской экспертизы»

Email: sushkova-nesterova@mail.ru

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии; врач судебно-медицинской экспертизы судебно-гистологического отделения

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85; 308017, г. Белгород, ул. Волчанская, 159

Дмитрий Валерьевич Щеблыкин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: dmitryshch1@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2420-2243

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Аркадий Витальевич Нестеров

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: nesterov_a@bsu.edu.ru

кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Михаил Владимирович Покровский

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: mpokrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1493-3376

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии, руководитель НИИ Фармакологии живых систем

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Максим Андреевич Жученко

Сектор разработки и доклинических исследований ГЛФ ООО «ФАРМАПАРК»

Email: maksim.zhuchenko@pharmapark.ru

кандидат биологических наук, начальник сектора разработки и доклинических исследований

Россия, 117246, г. Москва, Научный проезд, д. 8, стр. 1

Алексей Владимирович Тверской

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: tverskoy@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1537-6564

кандидат медицинских наук, заведующий кафедрой анатомии и гистологии человека

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Константин Михайлович Резников

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения и cоциального развития Российской Федерации

Email: vrkmf@yandex.ru

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии

Россия, 394036, г. Воронеж, ул. Студенческая, 10

Список литературы

Дополнительные файлы