CHARACTERISATION AND STUDY OF 1- [2- (2-BENZOYLPHENOXY) ETHYL] -6-METHYLURACIL MECHANISM OF ACTION


Cite item

Full Text

Abstract

The aim of the study is to identify 1-[2-(2-benzoylphenoxy) ethyl]-6-methyluracil using various methods of analysis, as well as to study its action mechanism against wild-type and mutant forms of HIV-1 reverse transcriptase (RT).Materials and methods. To characterize the structure of the test substance, a few kinds of analysis (X-ray diffraction, elemental, thermal) as well as a few kinds of spectroscopy (UV, IR, and NMR) have been used. The study of the action mechanism of the compound as a potential drug was carried out by evaluating the inhibitory activity against HIV-1 RT wild-type and its mutant forms corresponding to drug-resistant viral strains.Results. The studies have been carried out to confirm the structure of 1-[2-(2-benzoylphenoxy)ethyl]-6-methyluracil. The UV spectrum has a pronounced absorption maximum when measuring a solution of the substance in tetrahydrofuran at the concentration of 0.10 mg / ml. In the IR spectrum, there are specific bands in the range of 4000-370 cm-1. These factors make it possible to use UV and IR spectra to identify the test compound in the substance. It has also been established that the number and mutual arrangement of functional groups, the integrated intensity of signals in the 1H-NMR spectrum, as well as the structure of the carbon skeleton, correspond to the structure of 1-[2-(2-benzoylphenoxy) ethyl]-6-methyluracil. The results of studying the action mechanism showed that the test compound is an effective inhibitor of wild-type HIV-1 RT with an inhibition constant of 0.2 µM, as well as an enzyme inhibitor (mutation G190A) with an inhibition constant of 8 µM; enzyme (mutation Y181C) with an inhibition constant of 10 µM, as well as a reverse transcriptase (RT) inhibitor (mutation L100I, K103N, V106A) and a double mutant K103N / Y181C with an inhibition constant of more than 20 µM.Conclusion. As a result of the performed X-ray structural, elemental, 1H-NMR and 13C-NMR analyzes, the structure of 1-[2-(2-benzoylphenoxy)ethyl]-6-methyluracil has been confirmed. The possibility of using UV, IR and NMR spectroscopy, as well as thermal analyzes to confirm the authenticity during the verification of 1-[2-(2-benzoylphenoxy)ethyl]-6-methyluracil, has been shown. The developed methods can be used in the quality control and included in the draft of practice guidelines for the investigated substance. The studies of the action mechanism of the compound of HIV-1 RT reverse transcriptase have shown that this compound belongs to the group of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) of HIV-1.

Full Text

119 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021Таблица 1 - Основные кристаллографические данные и параметры уточнения структуры 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаБрутто формулаC20H18N2O4Молекулярная масса350,36Температура, K120Пространственная группа, ZP21/n, 4Параметры ячейки:4a, Å8,1352(7)b, Å13,7868(11)c, Å15,0957(12)a, °90b, °98,443(2)g, °90Объем ячейки, V, Å31674,8(2)Плотность, dвыч, г·см-31,390Коэффициент поглощения, m, см-10,98Фактор структуры F(000)736Размер кристаллов, мм0,25 × 0,17 × 0,14Кристаллическая форма, цветПризмы, коричневый2qmax, °61,36Число измеренных отражений22276Число независимых отражений5160Число отражений с I>2s (I)3182Количество уточняемых параметров[I>2s (I)]:286R10,0511wR20,1258GOF1,000Остаточная электронная плотность, e·Å-3(rmin/rmax)0,344/-0,212Таблица 2 - Дифракционные максимумы образца 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаУгол 2q, °Межплоскостное расстояние (d), ÅОтносительная интенсивностьУгол 2q, °Межплоскостное расстояние (d), ÅОтносительнаяинтенсивность4,70618,76090,30%35,1562,550631,30%8,67610,184260,50%35,4392,530892,90%11,7357,5353119,00%36,2232,477870,70%12,7656,929515,40%36,8922,434491,40%13,0746,766180,50%37,3672,40460,30%13,3586,622924,00%37,7992,378130,30%14,0486,299418,10%37,9672,3680,50%14,5556,0808221,20%38,3642,344391,00%16,2875,437795,20%38,8532,316031,00%17,3525,106539,30%39,0732,303480,90%18,2924,8462416,30%39,2922,291130,50%18,7464,729730,70%39,862,259810,40%19,5184,544449,50%40,2092,240980,70%20,5444,319713,60%40,7752,211160,20%21,3524,158133,10%40,9962,199740,60%21,9574,04488,10%41,8182,158380,10%22,5493,939920,50%41,7672,16090,10%22,8823,8833712,00%42,3642,131840,30%23,2533,822183,00%43,2542,090010,10%23,5523,774453,10%43,8922,061091,90%24,4153,64283100,00%44,3812,039521,00%25,4633,4953310,20%44,7932,02171,10%26,2873,387521,30%45,3241,999230,20%26,8543,3173527,00%46,4121,954880,30%DOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-114-129 120ОРИГИНАЛːНАЯ СТАТːЯISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021Угол 2q, °Межплоскостное расстояние (d), ÅОтносительная интенсивностьУгол 2q, °Межплоскостное расстояние (d), ÅОтносительнаяинтенсивность27,4693,244382,30%46,7351,942130,10%28,0683,17651,30%47,4171,915770,10%28,8643,090731,00%47,9311,896430,40%29,2823,047512,10%47,9891,894260,80%29,8042,995330,20%48,5971,871992,10%30,2392,953211,20%49,1311,852850,50%30,5202,926692,40%49,9991,822710,70%30,8652,894781,50%51,3321,778480,30%31,2272,861960,10%52,2851,748260,90%32,2852,770593,60%52,8311,731490,50%32,8022,728121,10%56,2841,633180,30%33,5762,666932,60%57,5461,600320,10%33,9982,634830,40%58,4321,578150,10%34,5082,597050,50%59,0641,562770,20%34,8692,570930,40%Таблица 3 - Результаты элементного анализа 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаФармацевтическая субстанцияС,%(M±σ), n=2Н,%(M±σ), n=2N,%(M±σ), n=21-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацил68,22±0,085,24±0,037,81±0,04Теоретический расчет68,605,118,00Таблица 4 - Характеристические максимумы полос поглощения образца субстанции (в см-1) в ближней и средней ИК области 8000-370 см-1Фармацевтическая субстанцияМаксимумы поглощения, см-11-[2-(2-бензоилфенок-си)этил]-6-метил-урацил4002,5; 3940,0; 3914,1; 3896,3; 3861,3; 3847,4; 3831,5; 3811,5; 3788,7; 3775,7; 3741,0; 3707,2; 3697,4; 3682,9; 3653,6; 3640,3; 3623,9; 3318,4; 3186,1; 3157,8; 3080,0; 3060,6; 3036,4; 3014,2; 2967,7; 2933,3; 2900,5; 2881,0; 2864,3; 2792,1; 2587,1; 2552,3; 2470,9; 2443,9; 2427,6; 2386,4; 2354,8; 2341,2; 2303,6; 2240,7; 2189,0; 2105,5; 2090,1; 2075,2; 2038,8; 2016,0; 1987,2; 1951,2; 1924,4; 1888,1; 1860,0; 1823,9; 1701,3; 1665,7; 1613,6; 1596,2; 1578,6; 1531,9; 1483,0; 1473,8; 1462,9; 1449,1; 1442,1; 1427,0; 1409,3; 1393,1; 1358,1; 1313,7; 1292,2; 1270,8; 1242,8; 1179,2; 1151,7; 1121,2; 1107,8; 1075,2; 1062,4; 1043,3; 1025,0; 996,0; 982,0; 971,9; 959,6; 944,6; 929,9; 894,2; 869,8; 852,2; 833,3; 807,7; 775,5; 766,4; 755,3; 731,4; 717,1; 704,2; 689,1; 634,1; 609,9; 567,6; 533,5; 509,0; 461,9; 435,9; 418,2; 376,7Таблица 5 - Результаты анализа ЯМР 1Н,13C спектров 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаФармацевтическая субстанцияПоложениеГруппаХимический сдвиг, δ 1H, ppmХимический сдвиг, δ 13С, ppm1-[2-(2-бензоилфенокси) этил]-6-метилурацил1Ar, α-CH7,21 д113,16 с2Ar, β-CH7,10 т121,61 с3Ar, β-CH7,50 т132,23 с4Ar, α-CH7,29 д128,94 с5Ar, ipso-C-155,71 с6Ar, ipso-C-129,13 с7C=O-196,05 с9Ar, ipso-C-136,92 с10,14Ar, α-CH7,67 д129,71 с11,13Ar, β-CH7,46 т129,08 с12Ar, γ-CH7,60 т134,07 с16O-CH24,18 т66,25 с17N-CH23,85 т43,47 с19C=O-151,82 с20NH11,10 с-21C=O-162,76 с22=CH5,12 с101,55 с23=C-154,49 с26CH31,82 с19,88 сПримечание: обозначения: т - триплет, с - синглет, д - дуплет, к - квартет 121 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021Спектроскопия ядерного магнитного резонансаЭкспериментальную работу по определению ЯМР спектров исследуемого вещества проводи-ли на ЯМР-спектрометре Bruker Avance-IIIHD 500 (Bruker, Германия). Навеску 1-[2-(2-бензоилфенок-си)этил]-6-метилурацила, массой 20 мг, растворяли в 600 мкл дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-d6). Полученный раствор без дальнейшей обработки “asis” помещали в ЯМР-спектрометр для регистрации 1H, 13С, HC-HMQC и HC-HMBC спектров. Регистрацию спектров 1Н-ЯМР проводили при ра-бочей частоте 500,13 МГц, 13C при рабочей частоте 125,76 МГц. Для подтверждения строения углеродно-го скелета потенциального продукта регистрировали спектры 13C в фазочувствительном варианте JMOD (CH3, CH - сигналы с отрицательными фазами, CH2, C -сигналы с положительными фазами), а также инверс-ные гетероядерные корреляции HC-HMQC (прямые взаимодействия C-H), HC-HMBC (дальние взаимодей-ствия C-H). Отнесение в спектре 13C-JMOD произво-дили на основе анализа двумерных инверсных кор-реляций HC-HMQC и HC-HMBC. Для подтверждения строения углеродного скелета были зарегистрирова-ны спектры ЯМР 13C в фазочувствительном варианте JMOD (сигналы C, CH2 направлены вверх, сигналы CH, CH3 вниз), HC-HMQC, HCHMBC.Исследование механизма действия in vitroИзучение механизма действия 1-[2-(2-бензоил-фенокси)этил]-6-метилурацила проводили путем оценки ингибирующей активности в отношении ОТ ВИЧ-1 дикого типа и ее мутантных форм, соответству-ющих лекарственно-устойчивым штаммам вируса, с использованием радиоактивно-меченных нуклеоти-дов. Для экспрессии гетеродимера дикого типа об-ратной транскриптазы ВИЧ-1 использовались клеткиE. coli штамма M15[pRep4] (Qiagen, Германия), кото-рые трансформировали плазмидой p6HRT-PROT. Для получения мутантных форм обратной транскриптазы ВИЧ-1 использовались клетки E. coli штамма Rosetta DE3 (Qiagen, Германия), трансформированные целе-выми плазмидами. В ходе исследования ингибирующей активности 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила в от-ношении мутантных форм ОТ ВИЧ-1 использовали панель мутантных форм ОТ ВИЧ-1 с аминокислотны-ми заменами L100I, K103N, V106A, Y181C, G190A, так как они широко представлены у пациентов с устой-чивостью к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ), приводят к резистентности посредством разных механизмов и являются при-нятыми при определении профиля резистентности новых анти-ВИЧ препаратов. Дополнительно была исследована ингибирующая активность 1-[2-(2-бен-зоилфенокси)этил]-6-метилурацила в отношении двойного мутанта с двумя наиболее часто встреча-ющимися заменами K103N и Y181C. В качестве по-ложительного контроля ингибитора ОТ ВИЧ-1 была использована субстанция препарата Эфавиренз. Кон-станту ингибирования для субстанции определяли по методу Диксона, то есть на основании зависимо-сти обратной скорости ферментативной реакции в присутствии ингибитора от его концентрации.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕОбщий вид молекулы и кристаллической упаков-ки показан на рисунке 2. Основные кристаллографи-ческие данные и параметры уточнения представле-ны в таблице 1. Общий вид дифрактограммы показан на рисунке 3, основные характеристики дифракционных макси-мумов приведены в таблице 2.Уточнение расходимости между эксперимен-тальной и теоретическими данными показало, что образец соответствует одной кристаллической фазе 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила. Дру-гих кристаллических фаз не обнаружено.Полученные данные термического анализа суб-станции 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилура-цил приведены на рисунках 4-6.Процесс потери массы начинается при температу-ре 25-50°С. Снижение массы в данном температурном интервале составляет порядка 1%, что связано с удале-нием остаточных растворителей или влаги в образце. В интервале температур 184-227°С потеря массы состав-ляет порядка 3%, что связано с разрушением кристал-логидрата. После 300°С с субстанцией начинают про-исходить термические изменения, заканчивающиеся термоокислительной деструкцией. На ДТГ кривой пик с вершиной при 203°С соответствует температуре, при которой удаляется кристаллогидратная вода. На кри-вой ДТА эндотермический пик с вершиной при 230°С соответствует температуре плавления образца.Установлено, что кристаллизация 1-[2-(2-бензоил-фенокси)этил]-6-метилурацила наблюдается при тем-пературе 191°С (рисунок 5). Температура плавления и теплота плавления при повторном нагревании не-сколько ниже, чем на первом, что связано с различны-ми условиями формирования кристаллической фазы.На термограмме фиксировали эндотермический пик с минимумом при 195°С. Он связан с удалением кристаллизационной воды. Температура плавления кристаллической фазы составила 227°С (рисунок 6).Результаты элементного анализа представлены в таблице 3.Исходя из полученных результатов, приведен-ных в таблице 3, можно заключить, что содержание определяемых элементов 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурациласоответствует теоретическому содержанию определяемых элементов, рассчитан-ных исходя из брутто-формулы С20Н18N2О4.Спектры 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилу-рацила в УФ-видимом диапазоне представлены на рисунках 7, 8.DOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-114-129 122ОРИГИНАЛːНАЯ СТАТːЯISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021Таблица 6 - Ингибиторная активность ННИОТ в отношении ОТ дикого (WT) и мутантных штаммов ВИЧ-1 in vitroОбратнаятранскриптазаКонстанта ингибирования (Ki, μM)1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилЭфавирензДикий тип0,23 ± 0,04 0,011± 0,002L100I>20a0,14± 0,01K103N>20a0,52± 0,1 V106A>20a0,11± 0,01Y181C12 ± 2,40,053± 0,006G190A8,3 ± 0,40,091± 0,008K103N/Y181C>20a 0,52± 0,08Примечание: aИсследуемое вещество, 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацил, ингибирует мутантные формы ОТ ВИЧ-1 L100I, K103N, V106A и двойной мутант K103N/Y181C в концентрации 20 мкМ с эффективностью 38%, 33%, 22% и 35% соответственно. Усиления ингибиро-вания данных мутантных форм ОТ ВИЧ-1 при более высоких концентрациях 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила не наблюдается, что скорее всего связано с достижением предела растворимости соединения в реакционной смеси, содержащей 10% ДМСОРисунок 4 - Дериватограмма 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаРисунок 5 - Термограмма ДСК, полученная при сканировании 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила 123 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021Рисунок 6 - Термограмма ДСК, полученная при сканировании 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаРисунок 7 - Спектр поглощения в области 210-900 нм 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила в тетрагидрофуране с концентрацией 0,1 мг/мл в кювете с длиной оптического пути 1,00 ммРисунок 8 - Спектр поглощения в области 235-900 нм 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила в диметилсульфоксиде с концентрацией 0,1 мг/мл в кювете с длиной оптического пути 1,00 ммDOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-114-129 124ОРИГИНАЛːНАЯ СТАТːЯISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021Рисунок 9 - ИК-спектр поглощения в области 4000-370 см-11-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилав таблетках калия бромидаРисунок 10 - ЯМР1H спектр 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаРисунок 11 - ЯМР 13C JMOD спектр 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила 125 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021Рисунок 12 - ЯМР HC-HMQC спектр 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаРисунок 13 - ЯМР HC-HMBC спектр 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилаDOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-114-129 126ОРИГИНАЛːНАЯ СТАТːЯISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021В спектрах виден максимум поглощения при 251,0 нм для раствора в ТГФ и 254,5 нм для раствора в ДМСО. При этом оптическая плотность для ДМСО возрастает гораздо быстрее, чем для ТГФ, поэтому в случае ТГФ возможно измерение от 210 нм. Для по-лучения выраженного максимума поглощения суб-станции в УФ-видимом диапазоне рекомендуются следующие условия измерения: раствор в тетраги-дрофуране спектральной чистоты, концентрацией 0,10 мг/мл, измерение в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1,00 мм, регистрация спектра в ди-апазоне 210-900 нм, фон - чистый ТГФ.На рисунке 9 приведен общий вид ИК-спектра поглощения образца в таблетках калия бромида.В спектрах образца в ИК области наблюдается множество узких и характеристичных полос, которые сведены в таблицу 4. Кроме того, в спектре образца в KBr в районе 3400 см-1 присутствует широкая полоса, соответствующая влаге, поглощенной бромидом ка-лия, поэтому она была исключена из рассмотрения.Из-за сложности молекулы идентифицировать и однозначно отнести все сигналы к определенным функциональным группам не представляется воз-можным. Поэтому ИК-спектроскопия для данной мо-лекулы может быть использована как дополнитель-ная, наряду с ЯМР-спектроскопией.Полученный спектр ЯМР 1Н анализируемого ве-щества представлен на рисунке 10.Важнейшей характеристикой спектра ЯМР явля-ется химический сдвиг (δ), который зависит от струк-туры молекулы. Электронная плотность протонов в молекулах определяется характером химической связи и индукционными эффектами окружающих групп, вследствие чего экранирование протонов ста-новится различным и их сигналы проявляются в раз-ных областях спектра.Произведено отнесение сигналов в спектре 1H (рис. 10). Из спектра видно, что в образце присут-ствуют сигналы, относящиеся как к алифатическим фрагментам, так и к ароматическим кольцам. Также виден сигнал группы NH. В целом спектр основного продукта не противоречит предложенной структуре. Также в спектре 1H в ароматической области присут-ствуют малоинтенсивные сигналы примесей в следо-вых количествах, которые из-за их низкого содержа-ния невозможно идентифицировать. Для подтверждения строения углеродного скеле-та были зарегистрированы спектры ЯМР 13C в фазочув-ствительном варианте JMOD (сигналы C, CH2 направле-ны вверх, сигналы CH, CH3 вниз), HC-HMQC, HCHMBC. Эти спектры представлены на рисунках 11-13.Произведено отнесение сигналов в спектре 13С (ри-сунок 11). Из спектра видно, что в образце присутству-ют сигналы, относящиеся как к алифатическим фраг-ментам, так и к положениям в ароматических кольцах карбонильных групп. В целом, спектр 1-[2-(2-бензоил-фенокси)этил]-6-метилурацила не противоречит пред-ложенной структуре. Также видны сигналы минорных примесей. Содержание их в образце находится ниже предела обнаружения спектроскопии ЯМР 13C.По результатам интерпретации инверсных дву-мерных корреляционных спектров HC-HMQC и HC-HMBC (рис. 12, 13) было сделано полное отнесение сигналов в спектрах 1H и 13C, подтверждено строение углеродного скелета продукта. Из рисунков 12,13 так-же видно, что распределение двумерных корреля-ционных сигналов не противоречит предложенной структуре предполагаемого продукта. Результаты от-несения полос к функциональным группам молекул исследуемого вещества представлены в таблице 5.Установлено, что количество и взаимное распо-ложение функциональных групп, интегральная ин-тенсивность из сигналов в спектре1H соответствует структуре 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилура-цила. Строение углеродного скелета соответствует структуре исследуемого соединения. Современные инструментальные методы анали-за позволяют всецело охарактеризовать фармацев-тическую субстанцию, что крайне необходимо для ее стандартизации, разработки методов контроля качества и последующего их включения в проекты нормативной документации [26]. В данной работе мы продемонстрировали результаты рентгенострук-турного, элементного, термогравиметрического, ДСК анализов, УФ-, ИК- и ЯМР- спектроскопии 1-[2-(2-бен-зоилфенокси)этил]-6-метилурацила - соединения, разрабатываемого в качестве лекарственного канди-дата для лечения ВИЧ-инфекции.Полученные данные подтверждают ожидаемое строение молекулы: визуализация молекулы рентге-нодифракционным исследованием, рассчитанная эле-ментным анализом брутто-формула С20Н18N2О4, взаим-ное расположение функциональных групп и строение углеродного скелета на ЯМР-спектре соответствует ожидаемой структуре соединения. Выявленные ха-рактерные пики УФ- и ИК-спектров указывают на на-личие основных функциональных групп, свойствен-ных 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацилу. Результаты рентгенофазового исследования свиде-тельствуют о наличии одной кристаллической фазы образца, что согласуется с данными термических ме-тодов анализа, установивших отсутствие полиморфов субстанции. В ходе ЯМР-анализа были обнаружены малоинтенсивные сигналы примесей в следовых ко-личествах, однако их содержание оказалось крайне малым, что свидетельствует о надлежащем синтезе и высокой степени очистки субстанции. Важнейшим этапом исследования стало изуче-ние механизма действия 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацил в отношении ОТ ВИЧ-1. Было показано, что 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацил является эффективным инги-битором ОТ как дикого штамма ВИЧ-1, так и ряда ее мутантных форм (таблица 6). Активность объекта 127 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021испытаний зависит от мутаций в сайте связывания ненуклеозидных ингибиторов ОТ, действующих по неконкурентному механизму. Результаты, представленные в таблице 6, под-тверждают, что объект исследования относится к группе ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (ННИОТ) ВИЧ-1. Следует отметить, что эфавиренз ингибировал полимеразную активность ОТ в более низких концентрациях, чем 1-[2-(2-бензо-илфенокси)этил]-6-метилурацил, при равной проти-вовирусной активности in vitro.Высокая изменчивость ВИЧ приводит к многочис-ленным заменам аминокислот в ОТ, формирующим резистентность вируса к ННИОТ [27]. Согласно лите-ратурным данным [28], большинство выявленных му-таций локализовано в гидрофобном кармане, центре связывания ННИОТ ВИЧ, вблизи каталитического цен-тра фермента. Среди пациентов с резистентностью к ННИОТ наиболее частыми являются мутации K103N (56,98%) и Y181C (24,95%). Мутации G190A, L100I, V106A встречаются реже (8,16%, 6,92% и 2,37% соответствен-но), но также сильно влияют на успех антиретровирус-ной терапии, так как приводят к потере ингибирующей активности невирапина более чем на 2 порядка [29]. Мутации L100I, K103N и Y181C являются характерными также для пациентов с резистентностью к эфавирен-зу и делавердину [30]. Известно, что мутации Y181C и V106A вызывали падение активности каправирина - потенциального ННИОТ второго поколения, снятого с клинических испытаний [31]. Для лерсивирина, ННИ-ОТ, созданного на основе каправирина и прошедшего клиническую фазу IIb, удалось добиться устойчивости к этим мутациям, однако наблюдалось падение ак-тивности при наличии мутации L100I [32]. Умеренная потеря активности в отношении мутации V106A была характерна для соединения GW69564 [33], модифи-кация структуры которого позволила создать другую молекулу (GW695634), дошедшую до III фазы клиниче-ских испытаний. Предложено несколько механизмов устойчивости ОТ к действию ННИОТ: мутации L100I и G190A стерически препятствуют размещению ННИОТ в гидрофобном кармане [34], мутация Y181C приводит к утрате взаимодействий с аминокислотными остатками внутри кармана [35], мутация K103N затрудняет про-никновение ННИОТ в гидрофобный карман [36, 37].В ходе работы была продемонстрирована спо-собность 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилура-цила ингибировать не только ОТ ВИЧ-1 дикого типа, но и ее наиболее распространенные мутантные формы с аминокислотными заменами L100I, K103N, V106A, Y181C, G190A, широко представленными у пациентов с устойчивостью к ННИОТ и приводящими к резистентности посредством разных механизмов. Данные мутации часто изучаются при определении профиля резистентности новых антиретровирус-ных препаратов. Дополнительно была показана ин-гибирующая активность 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацила в отношении двойного мутан-та с двумя наиболее часто встречающимися замена-ми K103N и Y181C, что крайне важно для разработки нового антиретровирусного препарата, нацеленного на преодоление резистентности вируса. Для под-тверждения активности соединения к различным штаммам и клиническим изолятам инфекции требу-ется проведение исследований in vitro на культурах клеток, инфицированных ВИЧ.ЗАКЛЮЧЕНИЕТаким образом, результаты проведенных ис-следований свидетельствуют о том, что УФ-спектр соединения имеет выраженный максимум погло-щения при измерении раствора субстанции в тетра-гидрофуране в концентрации 0,10 мг/мл, в ИК спек-тре наблюдаются специфичные полосы в области 4000-370 см-1, что позволяет использовать УФ и ИК спектры для идентификации исследуемого вещества в субстанции. В результате проведенных рентгено-структурного, элементного, 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР анали-зов была подтверждена структура 1-[2-(2-бензоилфе-нокси)этил]-6-метилурацила. Показана возможность применения УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии, а также термических анали-зов для подтверждения подлинности при входном контроле субстанции. Разработанные методы могут быть использованы в контроле качества и включены в проект НД на субстанцию 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]-6-метилурацил.Исследования механизма действия исследуемо-го вещества в отношении ОТ ВИЧ-1 показали, что сое-динение относится к группе ННИОТ ВИЧ-1
×

About the authors

E. A. Jain

Moscow State University named after M.V. Lomonosov

Email: ekaterina.korsa@gmail.com
Bldg. 1, 27, Lomonosov Ave., Moscow, Russia, 119991

D. V. Demchenko

St. Petersburg Institute of Pharmacy

Email: demchenko.dv@doclinika.ru
Bldg. 245, 3, Zavodskaya St., Vil. Kuzmolovsky, Vsevolozhsky district, Leningrad region, Russia, 188663

A. A. Ozerov

Volgograd State Medical University

Email: prof_ozerov@yahoo.com
1, Pavshikh Bortsov Sq., Volgograd, Russia, 400131

M. N. Makarova

St. Petersburg Institute of Pharmacy

Email: makarova.mn@doclinika.ru
Bldg. 245, 3, Zavodskaya St., Vil. Kuzmolovsky, Vsevolozhsky district, Leningrad region, Russia, 188663

V. G. Makarov

St. Petersburg Institute of Pharmacy

Email: makarov.vg@doclinika.ru
Bldg. 245, 3, Zavodskaya St., Vil. Kuzmolovsky, Vsevolozhsky district, Leningrad region, Russia, 188663

V. Yu. Balabanyan

Moscow State University named after M.V. Lomonosov

Email: bal.pharm@mail.ru
Bldg. 1, 27, Lomonosov Ave., Moscow, Russia, 119991

References

  1. Chen B. Molecular Mechanism of HIV-1 Entry// Trends Microbiol. - 2019. - Vol.27, №10. -P. 878-891. doi: 10.1016/j.tim.2019.06.002.
  2. Gulick R.M., Flexner C. Long-Acting HIV Drugs for Treatment and Prevention // Annu Rev Med. - 2019. - Vol.70. - P.137-150. doi: 10.1146/annurev-med-041217-013717.
  3. Cooper V. Clatworthy J., Harding R., Whetham J; Emerge Consortium. Measuring quality of life among people living with HIV: a systematic review of reviews // Health Qual Life Outcomes. - 2017. - Vol.15 , No.1.- P. 220. doi: 10.1186/s12955-017-0778-6
  4. Eggleton J.S., Nagalli S. Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART). 2021. In: StatPearls// Treasure Island (FL): StatPearls Publishingю - 2021
  5. Dionne B. Key Principles of Antiretroviral Pharmacology // Infect Dis Clin North Am. - 2019. - Vol.33, No.3. - P.787-805. doi: 10.1016/j.idc.2019.05.006.
  6. Gupta R.K., Gregson J., Parkin N., Haile-Selassie H., Tanuri A., Andrade Forero L., Kaleebu P., Watera C., Aghokeng A., Mutenda N., Dzangare J., Hone S., Hang Z.Z., Garcia J., Garcia Z., Marchorro P., Beteta E., Giron A., Hamers R., Inzaule S., Frenkel L.M., Chung M.H., de Oliveira T., Pillay D., Naidoo K., Kharsany A., Kugathasan R., Cutino T., Hunt G., Avila Rios S., Doherty M., Jordan M.R., Bertagnolio S. HIV-1 drug resistance before initiation or re-initiation of first-line antiretroviral therapy in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-regression analysis // Lancet Infect Dis. - 2018. - Vol.18, No.3. - P.346-355. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30702-8.
  7. Wang Y., De Clercq E., Li G. Current and emerging non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) for HIV-1 treatment // Expert Opin Drug Metab Toxicol. - 2019. - Vol.15, No.10. - P.813-829. doi: 10.1080/17425255.2019.1673367.
  8. Das K., Martinez S.E., DeStefano J.J., Arnold E. Structure of HIV-1 RT/dsRNA initiation complex prior to nucleotide incorporation // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2019. - Vol.116, No.15. - P.7308-7313. doi: 10.1073/pnas.1814170116.
  9. Das K., Arnold E. HIV-1 reverse transcriptase and antiviral drug resistance // Part 2. Curr Opin Virol. - 2013. - Vol.3, No.2. - P.119-28. doi: 10.1016/j.coviro.2013.03.014.
  10. Das K., Martinez S.E., Bauman J.D., Arnold E. HIV-1 reverse transcriptase complex with DNA and nevirapine reveals non-nucleoside inhibition mechanism // Nat Struct Mol Biol. - 2012. - Vol.19, No.2. - P.253-259. doi: 10.1038/nsmb.2223.
  11. Liu S., Abbondanzieri E.A., Rausch J.W., Le Grice S.F., Zhuang X. Slide into action: dynamic shuttling of HIV reverse transcriptase on nucleic acid substrates // Science. - 2008. - Vol.322, No.5904. - P.1092-1097. doi: 10.1126/science.1163108.
  12. Schauer G.D., Huber K.D., Leuba S.H., Sluis-Cremer N. Mechanism of allosteric inhibition of HIV-1 reverse transcriptase revealed by single-molecule and ensemble fluorescence // Nucleic Acids Res. - 2014. - Vol.42, No.18. - P.11687-11696. doi: 10.1093/nar/gku819.
  13. Wang J., Smerdon S.J., Jäger J., Kohlstaedt L.A., Rice P.A., Friedman J.M., Steitz T.A. Structural basis of asymmetry in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase heterodimer // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1994. - Vol.91, No.15. - P.7242-7246. doi: 10.1073/pnas.91.15.7242.
  14. De Corte BL. From 4,5,6,7-tetrahydro-5-methylimidazo(1,4)benzodiazepin-2(1H)-one (TIBO) to etravirine (TMC125): fifteen years of research on non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase // J Med Chem. - 2005. - Vol. 48, No.6. - P.1689-1696. doi: 10.1021/jm040127p.
  15. Schafer J.J., Short W.R. Rilpivirine, a novel non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor for the management of HIV-1 infection: a systematic review // Antivir Ther. - 2012. - Vol.17, No.8. - P.1495-1502. doi: 10.3851/IMP2254.
  16. Hofstra L.M., Sauvageot N., Albert J., et al. Transmission of HIV Drug Resistance and the Predicted Effect on Current First-line Regimens in Europe // Clin Infect Dis. - 2016. - Vol.62, №5 - P.655-663.
  17. Tang M.W., Shafer R.W. HIV-1 antiretroviral resistance: scientific principles and clinical applications // Drugs. - 2012. - Vol.72, No.9. P. e1-25. doi: 10.2165/11633630-000000000-00000.
  18. Bruccoleri A. Positional adaptability in the design of mutation-resistant nonnucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors: a supramolecular perspective. AIDS Res Hum Retroviruses. 2013 Jan;29(1):4-12. doi: 10.1089/AID.2012.0141.
  19. La Regina G., Coluccia A., Silvestri R. Looking for an active conformation of the future HIV type-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors // Antivir Chem Chemother. - 2010. - Vol.20, No.6. - P.213-37. doi: 10.3851/IMP1607.
  20. Huo Z., Zhang H., Kang D., Zhou Z., Wu G., Desta S., Zuo X., Wang Z., Jing L., Ding X., Daelemans D., De Clercq E., Pannecouque C., Zhan P., Liu X. Discovery of Novel Diarylpyrimidine Derivatives as Potent HIV-1 NNRTIs Targeting the "NNRTI Adjacent" Binding Site // ACS Med Chem Lett. - 2018. - Vol.9, No.4. - P. 334-338. doi: 10.1021/acsmedchemlett.7b00524.
  21. Kang D., Wang Z., Zhang H., Wu G., Zhao T., Zhou Z., Huo Z., Huang B., Feng D., Ding X., Zhang J., Zuo X., Jing L., Luo W., Guma S., Daelemans D., Clercq E., Pannecouque C., Zhan P., Liu X. Further Exploring Solvent-Exposed Tolerant Regions of Allosteric Binding Pocket for Novel HIV-1 NNRTIs Discovery // ACS Med Chem Lett. - 2018. - Vol.9, No.4. - P. 370-375. doi: 10.1021/acsmedchemlett.8b00054.
  22. Озеров А.А., Новиков М.С., Тимофеева Ю.А., Лобачев А.А., Луганченко А.И., Гейсман А.Н. Пиримидиновые ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 - история разработки и перспективы // Вестник ВолгГМУ. - 2012.- №3. - 10-17.
  23. Novikov M.S., Ivanova O.N., Ivanov A.V., Ozerov A.A., Valuev-Elliston V.T., Temburnikar K., Gurskaya G.V., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Balzarini J., Seley-Radtke K.L. 1-uracils as potent anti-HIV-1 agents // Bioorg Med Chem. - 2011. - Vol.19, No.19. - P.5794-5802. doi: 10.1016/j.bmc.2011.08.025.
  24. Петров В.И., Новиков М.С., Луганченко А.И., Озеров А.А., Рогова Н.В. Кластерный подход к созданию биотехнологических лекарственных средств // Медицинская этика. - 2014. - №1. - С. 28-31.
  25. Озеров А.А., Новиков М.С., Луганченко А.И., Хартман Т., Букхайт Р.У. Новые N-производные нуклеиновых оснований -синтез и анти-ВИЧ-1 активность in vitro // Волгоградский научно-мед. журн.- 2012. - №4. - С. 15-18.
  26. Siddiqui M.R., Al Othman Z.A., Rahman N. Analytical techniques in pharmaceutical analysis: A review // Arabian Journal of Chemistry. - 2017. - Vol.10, No.2. - P.1409-1421. doi: 10.1016/j.arabjc.2013.04.016
  27. Rai M.A., Pannek S., Fichtenbaum C.J. Emerging reverse transcriptase inhibitors for HIV-1 infection // Expert Opin Emerg Drugs. - 2018. - Vol.23, No.2. - P.149-157. doi: 10.1080/14728214.2018.1474202.
  28. de Bethune, M.P. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), their discovery, development, and use in the treatment of HIV-1 infection: a review of the last 20 years (1989-2009) // Antiviral Res. - 2010. - Vol. 85, No. 1. - P. 75-90. doi: 10.1016/j.antiviral.2009.09.008.
  29. Maga G., Amacker M., Ruel N., Hübscher U., Spadari S. Resistance to nevirapine of HIV-1 reverse transcriptase mutants: loss of stabilizing interactions and thermodynamic or steric barriers are induced by different single amino acid substitutions. // J Mol Biol. - 1997. - Vol. 274, No. 5. - P. 738-747. doi: 10.1006/jmbi.1997.1427.
  30. Mackie N. Resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. In: Geretti AM, editor. Antiretroviral Resistance in Clinical Practice. Изд-во- London: Mediscript; 2006. Chapter 2.
  31. Sato A., Hammond J., Alexander T.N., Graham J.P., Binford S., Sugita K., Sugimoto H., Fujiwara T., Patick A.K.. In vitro selection of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase that confer resistance to capravirine, a novel nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor // Antiviral Res. - 2006. - Vol. 70, No.2. - P. 66-74. doi: 10.1016/j.antiviral.2006.01.001.
  32. Corbau R., Mori J., Phillips C., Fishburn L., Martin A., Mowbray C., Panton W., Smith-Burchnell C., Thornberry A., Ringrose H., Knöchel T., Irving S., Westby M., Wood A., Perros M. Lersivirine, a nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor with activity against drug-resistant human immunodeficiency virus type 1 // Antimicrob Agents Chemother. - 2010. -Vol. 54, No.10. - P. 4451-4463. doi: 10.1128/AAC.01455-09.
  33. Chan J.H., Freeman G.A., Tidwell J.H., Romines K.R., Schaller L.T., Cowan J.R., Gonzales S.S., Lowell G.S., Andrews C.W. 3rd, Reynolds D.J., St. Clair M., Hazen R.J., Ferris R.G., Creech K.L., Roberts G.B., Short S.A., Weaver K., Koszalka G.W., Boone L.R.. Novel benzophenones as non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors of HIV-1 // J Med Chem. - 2004. - Vol.47, No.5. - P.1175-1182. doi: 10.1021/jm030255y.
  34. Hsiou Y., Das K., Ding J., Clark A.D. Jr., Kleim J.P., Rösner M., Winkler I., Riess G., Hughes S.H., Arnold E. Structures of Tyr188Leu mutant and wild-type HIV-1 reverse transcriptase complexed with the non-nucleoside inhibitor HBY 097: inhibitor flexibility is a useful design feature for reducing drug resistance // J Mol Biol. - 1998. - V. 284, No.2. - P. 313-323. doi: 10.1006/jmbi.1998.2171.
  35. Kertesz D.J., Brotherton-Pleiss C., Yang M., Wang Z., Lin X., Qiu Z., Hirschfeld D.R., Gleason S., Mirzadegan T., Dunten P.W., Harris S.F., Villaseñor A.G., Hang J.Q., Heilek G.M., Klumpp K. Discovery of piperidin-4-yl-aminopyrimidines as HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. N-benzyl derivatives with broad potency against resistant mutant viruses // Bioorg Med Chem Lett. - 2010. - Vol. 20, No.14. - P. 4215-4218. doi: 10.1016/j.bmcl.2010.05.040.
  36. Hsiou Y., Ding J., Das K., Clark A.D. Jr., Boyer P.L., Lewi P., Janssen P.A., Kleim J.P., Rösner M., Hughes S.H., Arnold E. The Lys103Asn mutation of HIV-1 RT: a novel mechanism of drug resistance // J Mol Biol. - 2001. - Vol. 309, No. 2. - P. 437-445. DOI: 0.1006/jmbi.2001.4648.
  37. Ren J., Nichols C.E., Chamberlain P.P., Weaver K.L., Short S.A., Chan J.H., Kleim J.P., Stammers D.K. Relationship of potency and resilience to drug resistant mutations for GW420867X revealed by crystal structures of inhibitor complexes for wild-type, Leu100Ile, Lys101Glu, and Tyr188Cys mutant HIV-1 reverse transcriptases // J Med Chem. - 2007. - Vol. 50, No.10. - P. 2301-2309. doi: 10.1021/jm061117m.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2021 Jain E.A., Demchenko D.V., Ozerov A.A., Makarova M.N., Makarov V.G., Balabanyan V.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС 77 - 67428 от 13.10.2016. 

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies