Влияние криоконсервированного экстракта плаценты на отдельные биохимические показатели лечебной эффективности и токсичности диклофенака натрия при адъювант- индуцированном артрите в эксперименте

Полный текст

Список сокращений: АА – адъювантный артрит; АлАТ – аланин-аминотрансфераза; АОС – антиоксидантная система; АсАТ – аспартат-аминотрансфераза, в/ж – внутрижелудочно, в/м – внутримышечно; ГГТП – гамма-глутамилтраспептидаза; ДН – диклофенак натрия; ЖКТ – желудочно-кишечный тракт; ИПКиК НАН Украины – Института проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины; КЭП – криоконсервированный экстракт плаценты; НПВП – нестероидные противовоспалительные препараты; ОС – оксидативный стресс; ПОЛ – перикисное окисление липидов; ПОЛ-АОС – перекисное окисление липидов-антиоксидантная система; СОД – супероксиддисмутаза; С-РБ – С-реактивный белок; ТБК-РП – активные продукты тиобарбитуровой кислоты; ЦОГ – циклооксигеназа; 95% ДИ – 95% доверительный интервал

 

ВВЕДЕНИЕ

Среди многочисленных лекарственных средств, которые есть в арсенале клиницистов, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) занимают особое место. Это обусловлено наличием у них неспецифического противовоспалительного и обезболивающего свойств, что обосновывает ежегодное увеличение их продаж на фоне старения населения, поскольку, как известно, частота их применения возрастает с возрастом. НПВП играют особую роль в симптоматической терапии больных с ревматическими заболеваниями: ревматоидный артрит (РА), анкилозирующий спондилоартрит, подагра и др. [1–5].

Однако, не смотря на общепризнанную эффективность НПВП, их применение в клинической практике существенно ограничено риском развития нежелательных побочных эффектов со стороны различных органов и систем, в частности желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), сердечно-сосудистой системы, печени, почек [2–6]. К тому же в 25,0–35,0% случаев пациенты применяют НПВП нерационально и не учитывают наличия факторов риска развития нежелательных эффектов.

Известно, что максимальный риск сердечно-сосудистых осложнений имеет место при приёме препаратов, обладающих высокой селективностью к циклооксигеназе (ЦОГ) 2 типа (коксибов – целекоксиба, эторикоксиба и др.), в то время как риск осложнений со стороны ЖКТ наиболее характерен при приеме неселективных НПВП (диклофенака, индометацина, ибупрофена и др.) [3, 4]. Так в первые 7 дней приёма целекоксиба, повышение риска инфаркта миокарда составляет 92,0–99,0% [3, 7]. Нежелательные реакции со стороны ЖКТ – наиболее распространенная патология, обусловленная ингибированием ЦОГ-1 и как следствие снижением защитного потенциала слизистой оболочки пищеварительного тракта [8, 9]. Неселективные ингибиторы ЦОГ повышают риск ЖКТ-кровотечений в среднем в 4 раза, а селективные – в 3 раза [4, 5].

Проблема ЖКТ-переносимости широко применяемых НПВП обосновывает актуальность поиска эффективных цитопротективных препаратов, способных повышать устойчивость слизистой оболочки пищеварительного тракта [10, 11]. Лечение НПВП-индуцированной эзофагогастроэнтероколонопатии классически направлено на кислотосупрессивную терапию (ингибиторы протонной помпы, Н₂-гистаминоблокаторы и др.), применение гастроцитопротекторов (де-нол, сукральфат и др.) и препаратов, которые восстанавливают содержание простагландинов в слизистой оболочке (мизопростол, ребамипид и др.) [5, 12–14]. Однако все указанные группы лекарственных средств недостаточно удовлетворяют клиницистов, поскольку направлены преимущественно на лечение НПВП-гастропатии, в то время как НПВП способны вызывать поражения, в том числе, и дистальных отделов ЖКТ, а также имеют собственные побочные эффекты [13–19].

Одним из перспективных направлений терапии патологий ЖКТ является использование препаратов биологического происхождения, преимуществами которых является их комплексное фармакологическое действие и хорошая переносимость. [20–22].

В качестве средства коррекции ульцерогенного действия НПВП наше внимание привлек криоконсервированный экстракт плаценты (КЭП) человека, обладающий мультивекторным спектром биологической активности [23–26].

Впервые криоконсервированные препараты плацентарной ткани человека были получены учеными Института проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины (ИПКиК НАН Украины), которые разработали и внедрили в практику уникальную методику его длительного хранения в низкотемпературной среде. Это обеспечило первенство Украины среди европейских стран по опыту криоконсервирования биологических тканей [26–31].

В предыдущих исследованиях нами показано, что КЭП способен нивелировать ульцерогенное действие НПВП, в частности диклофенака натрия, мелоксикама, ибупрофена и др. [32–34]. В то же время по данным литературы КЭП присущи собственные противовоспалительные свойства [35], механизм которых, очевидно, связан с действием содержащихся в нем гормонов (прогестерона, эстрадиола, пролактина, гонадотропина и др.).

Кроме того, КЭП обладает выраженными антиоксидантными свойствами и его противовоспалительное действие, возможно, связано с устранением провоспалительной модуляции реакций системы крови активными формами кислорода и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в результате стимуляции физиологической антиоксидантной системы [35].

Все вышеуказанные факты обосновывают необходимость углубленного изучения механизмов терапевтического, в частности противовоспалительного, действия КЭП при его комбинированном использовании с НПВП.

ЦЕЛЬ. Охарактеризовать влияние криоконсервированного экстракта плаценты и диклофенака натрия при их комбинированном применении на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы, активность воспалительных, деструктивных и цитолитических процессов, а также состояние белкового и липидного обмена по данным биохимических исследований у крыс с экспериментальным ревматоидным артритом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на базе ИПКиК НАН Украины в отделе экспериментальной криомедицины. Работа выполнена в контексте плановой научно-исследовательской работы «Деструктивные и восстановительные процессы в тканях in vivo после воздействия низких температур и биологически активных веществ» (шифр 2.2.6.113, номер государственной регистрации 0117U001049).

Исследование проведено на 28 половозрелых нелинейных крысах-самцах, полученных из вивария ИПКиК НАН Украины, массой 200–220 г, разделенных на 4 группы, по 7 животных в каждой: І –интактные крысы (n=7); ІІ (контроль) – крысы (n=7) с экспериментальным РА без лечения; ІІІ – крысы (n=7) с экспериментальным РА, которым вводили диклофенак натрия (ДН) (8 мг/кг [36], внутрижелудочно (в/ж)); ІV (n=7) – крысы с экспериментальным РА, которым вводили ДН (8 мг/кг, в/ж) и КЭП (0,16 мг/кг [37], внутримышечно (в/м)).

Режим введения и дозировки исследуемых средств

Лечение АА проводилось с 14-го по 28-й день. ДН (ЧАО «Химфармзавод «Красная звезда»», ООО «Фармацевтическая компания «Здоровье»», Украина) вводили в/ж в дозе, равной ЕД₅₀ по противовоспалительной активности на модели карагенин-индуцированного отека – 8 мг/кг в виде эмульсии на полисорбате «Twin-80» [35, 37]. Указанная доза ДН соответствует разовой дозе для человека 88 мг (1,25 мг/кг), что согласуется с клиническими рекомендациями об использовании ДН у больных по 75–100 мг/сут. при его длительном применении и в 1,7 раза ниже его максимальной суточной дозы 150 мг [8].

Препарат КЭП «Криоцелл-криоэкстракт плаценты» (Государственное предприятие «Межведомственный научный центр криобиологии и криомедицины Национальной академии наук, Национальной академии медицинских наук и Министерства здравоохранения Украины», Украина) согласно инструкции, применяется у пациентов парентерально в разовой дозе 1,8 мл [37]. Перед применением препарата «Криоцелл-криоэкстракт плаценты» разовую дозу (0,16 мл/кг) экстемпорально разводили в 0,9% растворе хлорида натрия из расчета 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия /100 г массы тела. КЭП по 0,16 мл/кг массы тела вводили в/м с интервалом 2 дня (всего 5 инъекций), соответственно на 14, 17, 20, 23 и 26 дни, что соответствовало инструкции к его клиническому применению – в/м по 1,8 мл с интервалом 2–3 дня курсом 1–5 инъекций.

Модель хронического иммунного воспаления

Для воспроизведения условий введения крысам НПВП, соответствующих их клиническому применению нами была выбрана модель экспериментального ревматоидного артрита (РА) – адъювантный артрит (АА) у крыс, которая имеет все морфофункциональные признаки РА и сопровождается типичной реакцией, основным звеном которой является Т-клеточный иммунитет [38–40]. АА моделировали путем субплантарного введение полного адъюванта Фрейнда (ПАФ, Thermo Fisher Scientific, США) в заднюю правую конечность из расчета 0,1 мл на крысу. День введения адъюванта принимали за «0» день эксперимента [40–42]. Максимальное проявление местной воспалительной реакции, которая сопровождалась значительным увеличением объема конечности определялась на 12–14 сутки, далее активность воспалительного процесса постепенно уменьшалась.¹

На 28 сутки эксперимента животных выводили из эксперимента и после декапитации животных отбирали образцы крови в пробирки с предварительно внесенным антикоагулянтом (2-х замещенной калийной солью этилендиаминотетрауксусной кислоты). Плазму отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Для получения сыворотки кровь отбирали в стеклянные пробирки без антикоагулянта и выдерживали при комнатной температуре (20–26°С) до полного отделения сыворотки, которую отбирали в пробирку и центрифугировали в течение 15–20 мин при 3000 об/мин.

Биохимические методы исследования крови²

1. Содержание активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-РП) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически по методу Asakawa Т. et al. [43] по реакции с ТБК и рассчитывали по показателям оптической плотности, определенным по светопоглощению при длине волны λ=535 нм, учитывая коэффициент молярной экстинкции окрашенного в красный цвет комплекса, который равен 1,56 × 105 моль^-1/см^-1 и выражали в мкмоль/л;
2. Активность cупероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови (КФ 1.15.1.1.) определяли спектрофотометрически по методу Костюка В.А. и соавт. [44], основанному на подавлении реакции окисления кверцетина, по показателям оптической плотности, определенным по светопоглощению при длине волны λ=406 нм. Активность СОД выражали в % ингибирования окисления кверцетина;
3. Содержание серомукоида в сыворотке крови определяли спектрофотометрически по методу Weimer H.E. и Moshin R.J., который заключается в осаждении белков сыворотки крови 1,8 М раствором перхлорной кислоты (HCIO₄), выделении серомукоида из фильтрата с помощью фосфорно-вольфрамовой кислоты и дальнейшем количественном определении по разнице светопоглощения при длине волны λ=260 нм и λ=280 нм. Содержание серомукоида определяли в единицах оптической плотности (ед. опт. плотн.) и выражали в ммоль/л (коэффициент пересчета = 1; 1 ед. опт. плотн. =1 ммоль/л);
4. Содержание С-реактивного белка (С-РБ) в сыворотке крови определяли по степени агглютинации и помутнения согласно инструкции использования латексного диагностического теста для выявления С-реактивного белка в сыворотке крови «С-РБ латекс-тест» (ООО НПЛ «Гранум», Украина) и выражали в мг/л;
5. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови (КФ 2.6.1.1) определяли спектрофотометрически по методу Reitman S. и Frankel S. и выражали в мкмоль/(мл×ч). Исследования проводились с использованием наборов для биохимических исследований «АЛТ (Райтман-Френкеля с калибратором)» (ООО НПП «Филисит-Диагностика», Украина);
6. Активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови (КФ 2.6.1.1) определяли спектрофотометрически по методу Reitman S. и Frankel S. И выражали в мкмоль/(мл×ч). Исследования проводились с использованием наборов для биохимических исследований «АсАТ (Райтман-Френкеля с калибратором)» (ООО НПП «Филисит-Диагностика», Украина);
7. Активность гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом и выражали в Ед/л. Исследования проводились с использованием наборов для биохимических исследований «ГТП» (ООО НПП «Филисит-Диагностика», Украина);
8. Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом и выражали в мкмоль/л. Исследования проводились с использованием наборов для биохимических исследований «Щелочная фосфатаза» (ООО НПП «Филисит-Диагностика», Украина);
9. Содержание общего белка в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом по биуретовой реакции и выражали в г/л. Исследования проводились с использованием наборов для биохимических исследований «Общий белок» (ООО НПП «Филисит-Диагностика», Украина);
10. Содержание общих липидов в сыворотке крови определяли спектрофотометрически по цветовой реакции с сульфофосфованилиновим реактивом, которая основывается на том, что продукты распада ненасыщенных жирных кислот, образующихся после кислотного гидролиза липидов, взаимодействуют с фосфорнованилиновим реактивом с образованием окрашенных комплексов, имеющих максимум поглощения при длине волны λ=530 нм. Липидные экстракты получали по методу Bligh E. G. и Dyer W. I. [45]. Фосфолипиды фракционировали методом Svetashev V. I. и Vaskovsky V. E., путем двумерной микротонкошаровой хроматографии [46]. Фосфолипиды идентифицировали по методу [47] и выражали их содержание по уровню неорганического фосфора в г/л.

Биоэтические аспекты исследования

Животных содержали в условиях вивария ИПКиК НАН Украины. В течении 14 дней крысы находились на карантине (в соответствии с санитарными нормами «Структура и содержание экспериментальных биологических клиник» (Приказ № 755 от 12.08.1997 г.) на водно-пищевом рационе со свободным доступом к пище и воде (согласно Приложения от 04.12.1977 г. к Приказу №163 от 10.03.1996 г. «Про суточные нормы кормления лабораторных животных и продуцентов»). Все экспериментальные исследования над лабораторными животными проводили в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики и с соблюдением основных положений Конвенции Совета Европы об охране позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях от 18 марта 1986 г.; Директивы Европейского парламента и Совета Евросоюза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, используемых для научных целей; приказ Министерства здравоохранения Украины от 14 декабря 2009 г. №944 «Об утверждении порядка проведения доклинического изучения лекарственных средств и экспертизы материалов доклинического изучения лекарственных средств» и Закона Украины от 21 февраля 2006 г. № 3447-IV «О защите животных от жестокого обращения».

Комплексная программа исследований рассмотрена и согласована Комитетом по биоэтике при ИПКиК НАН Украины (выписка из протокола № 2 от 11 марта 2020).

Статистическая обработка полученных результатов

Проведена с использованием прикладной программы для работы с электронными таблицами «Microsoft Office Excel 2003; 2013» (Microsoft Corporation, США) с помощью расширения «Real Statistics» (http://www.real-statistics.com/). Оценку характера распределения величин в каждой группе выборочной совокупности проводили с использованием W-критерия Шапиро-Вилка (Shapiro-Wilk test; n<50). Однородность дисперсий определяли по критерию Левена (Levene’s test). Для оценки значимости выявленных различий исследуемых показателей при разных условиях эксперимента проводили статистический анализ с использованием параметрических и непараметрических критериев. При нормальном распределении независимых величин различия между группами определяли попарно по t-критерию Стьюдента. При ненормальном распределении по крайней мере одной из групп независимых величин различия между ними определяли попарно по непараметрическому ранговому U-критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney). Полученные значения сравнивали с критическими при уровне достоверности выше 95,0% (p≤0,05), выше 99,0% (p≤0,01), выше 99,5% (p≤0,005) и выше 99,9% (p≤0,001) и делали вывод о вероятности погрешности. Цифровые данные в случае нормального распределения величин приведены в виде «M±m» (M±SE), где: M – среднее арифметическое значение; m (SE) – стандартная ошибка среднего арифметического или М (95% ДИ: 5% – 95%), где: 95% ДИ – 95% доверительный интервал. При ненормальном распределении полученных величин данные представлены в виде Ме [LQ; UQ], где Ме – медиана [LQ; UQ] – верхняя граница нижнего (первого) квартиля (lower quartile – LQ) и нижняя граница верхнего (третьего) квартиля (upper quartile – UQ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимические исследования периферической крови крыс с АА (контрольная группа) показали статистически достоверное (р<0,001) увеличение содержания ТБК-РП на 53,7% относительно показателей интактных животных (рис. 1), что указывает на активацию ПОЛ, что вероятно обусловлено развитием системного воспалительного процесса [47, 48].

Как известно продукты ПОЛ способствуют агрегации тромбоцитов, уменьшению синтеза простагландинов с антикоагулянтным действием, формированию синдрома цитолиза, выходу факторов свертывания крови и подавлению деления и регенерации клеток. ТБК-РП выступает эндогенным альдегидом, который является клинико-лабораторным маркером оксидативного стресса и широко применяется для контроля эффективности лечения целого ряда заболеваний – РА, остеоартрит, ишемическая болезнь сердца и др. [49–51].

Монотерапия ДН крыс с АА привела к статистически достоверному (р<0,01) снижению уровня ТБК-РП на 19,0% относительно показателей животных контрольной группы в аналогичные сроки исследования. Комбинированное применение ДН и КЭП сопровождалось более выраженным снижением интенсивности процессов ПОЛ на что указывало уменьшение содержания ТБК-РП у крыс с АА на 31,7% относительно показателей крыс с АА без лечения, что в 1,7 раз превышало аналогично направленные изменения на фоне применения только ДН.

Следует отметить, что у животных с АА, которым вводили ДН и КЭП уровень ТБК-РП на 28 день эксперимента практически сопоставлялся с показателями интактных крыс и составлял 4,3 [3, 6; 4, 5] мкмоль/л (рис. 1), что указывает на нивелирование признаков АА-индуцированного оксидативного стресса и может расцениваться как один из механизмов лечебного действия исследуемых препаратов.

 

Рисунок 1 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на уровень ТБК-РП в периферической крови у крыс с АА на 28-е сутки эксперимента

Примечание: распределение величин ненормальное. Боксы включают результаты от 25-го до 75-го перцентиля, вертикальные линии за пределами боксов – минимальное и максимальное значения. Горизонтальная линия внутри бокса – медиана (► – медиана равна 25 (75) перцентилю), ♦ – среднее значение; ● – p<0,05 относительно показателей интактных крыс, ■ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА без лечения; ▲ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА, леченных ДН

 

Установленная активация ПОЛ у крыс на фоне развития АА согласовывалась с параллельным истощением антиоксидантной системы (АОС) на что указывало статистически достоверно (р<0,01) снижение уровня СОД на 27,9% относительно показателей интактных животных (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на уровень СОД в периферической крови у крыс с АА на 28-е сутки эксперимента

Примечание: распределение величин ненормальное. Боксы включают результаты от 25-го до 75-го перцентиля, вертикальные линии за пределами боксов – минимальное и максимальное значения. Горизонтальная линия внутри бокса – медиана (► – медиана равна 25 (75) перцентилю), ♦ – среднее значение; ● – p<0,05 относительно показателей интактных крыс, ■ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА без лечения; ▲ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА, леченных ДН

 

Как известно, СОД совместно с другими ферментами АОС (каталаза, церулоплазмин, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза и др.) выступают неотъемлемым компонентом ПОЛ-АОС. Оценка функционального состояния АОС определяет уровень компенсаторного и адаптивного ответа организма в условиях возможного развития ОС [51, 52].

Монотерапия ДН крыс с АА привела к статистически достоверному (р=0,03) повышению активности СОД на 20,4% относительно показателей нелеченых животных (ІІ группа), однако данное значение (59,0% ингибирования окисления кверцетина) все же на 13,2% было ниже показателей животных без АА (68,0 [64, 0; 76, 5] %).

На фоне комбинированного применения ДН и КЭП нами отмечено статистически достоверное (р=0,01) повышение активности СОД на 30,6% относительно значений у крыс контрольной группы, что лишь на 5,9% было ниже показателей интактных крыс и указывало на наиболее выраженное восстановление активности АОС.

Для оценки состояния соединительнотканных структур у крыс на фоне развития АА нами исследовался уровень серомукоидов, поскольку именно эта группа гликопротеинов поступает в плазму крови при разрушении, деградации или повреждении соединительной ткани. Кроме того, серомукоиды принято рассматривать как острофазные маркеры воспаления, которые могут служить индикатором выраженности воспалительного процесса поскольку их период жизни составляет около 5 дней [53–56].

Установлено, что на 28-й день эксперимента у крыс с АА отмечено статистически достоверный (р<0,001) рост уровня серомукоида в 2,2 раза относительно показателей интактных крыс (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на уровень серомукоида в периферической крови у крыс с АА на 28-е сутки эксперимента

Примечание: распределение величин ненормальное. Боксы включают результаты от 25-го до 75-го перцентиля, вертикальные линии за пределами боксов – минимальное и максимальное значения. Горизонтальная линия внутри бокса – медиана (► – медиана равна 25 (75) перцентилю), ♦ – среднее значение; ● – p<0,05 относительно показателей интактных крыс, ■ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА без лечения; ▲ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА, леченных ДН

 

Монотерапия ДН крыс с АА привела к статистически достоверному (р<0,01) снижению уровня изучаемого показателя на 31,4% относительно уровня нелеченых животных. Комбинированное применение ДН и КЭП привело к статистически достоверному (р<0,01) еще большему снижению содержанию серомукоида на 17,1% относительно показателей крыс группы монотерапии ДН, который составил соответственно 0,18 [0, 17; 0, 18] ммоль/л.

«Золотым» маркером воспаления практически при всех патологических процессах по праву принято считать С-РБ, поскольку он имеет тенденцию значительно повышаться при повреждениях тканей, инфекциях бактериальной или вирусной природы, воспалении и злокачественных новообразованиях, а при некрозе тканей и вовсе может в течении суток возрастать до 300 мг/л [47, 57–61].

Установлено, что развитие экспериментального РА у крыс привело к статистически достоверному (р<0,001) увеличению уровня С-РБ в 4,5 раза относительно показателей интактных животных (рис. 4).

 

Рисунок 4 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на уровень С-РБ в периферической крови у крыс с АА на 28-е сутки эксперимента

Примечание: распределение величин ненормальное. Боксы включают результаты от 25-го до 75-го перцентиля, вертикальные линии за пределами боксов – минимальное и максимальное значения. Горизонтальная линия внутри бокса – медиана (► – медиана равна 25 (75) перцентилю), ♦ – среднее значение; ● – p<0,05 относительно показателей интактных крыс, ■ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА без лечения; ▲ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА, леченных ДН

 

На фоте монотерапии ДН данный показатель снизился (р<0,001) на 33,3%, а на фоне комбинированного введения ДН и КЭП – снизился (р<0,001) на 61,1% относительно значений у крыс с АА без лечения. Полученные данные указывают на выраженные противовоспалительные свойства ДН, которые потенцируются при совместном применении с КЭП, однако могут быть связаны и с собственной противовоспалительной активностью КЭП.

Установленные биохимические признаки активного воспалительного процесса и развивающийся при этом дисбаланс в системе ПОЛ-АОС обосновывает целесообразность детального анализа активности маркеров цитолиза на фоне лечения крыс с АА – АлАТ, АсАТ и ГГТП [62, 63].

Исследование показало, что развитие АА у крыс сопровождалось увеличением содержания АлАТ на 28,6% (р=0,01), АсАТ на 26,1% (р<0,001) и ГГТП на 62,2% (р<0,001) относительно показателей интактных крыс (табл. 1).

 

Таблица 1 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на маркеры цитолиза в периферической крови крыс с АА на 28-е сутки эксперимента (M±m (95% ДИ) или Ме [LQ; UQ]; n=28)

Исследуемый показатель, единицы измерения	Условия эксперимента
	І группа	ІІ группа	ІІІ группа	ІV группа
	Интактные крысы	Контроль (АА без лечения)	АА + ДН	АА +ДН +КЭП
n	7	7	7	7
Аланин-аминотрансфераза (АлАт), мкмоль/мл/ч	1,4 [1, 3; 1, 6]	1,8 [1, 6; 1, 9] р1-2=0,01	2,2 [2, 1; 2, 3] р1-3<0,01 р2-3=0,01	1,5 [1, 5; 1, 6] р1-4=0,17 р2-4=0,02 р3-4<0,01
Аспартат-аминотрансфераза (АсАт), мкмоль/мл/ч	2,3 [2, 1; 2, 4]	2,9 [2, 9; 3, 5] р1-2<0,001	3,5 [3, 3; 2, 4] р1-3<0,01 р2-3=0,2	2,4 [2, 3; 2, 5] р1-4=0,14 р2-4<0,001 р3-4<0,01
Гаммаглутамил-транспептидаза (ГГТП), Ед/л	22,3±1,81 (95% ДИ: 18,7–25,8)	36,1±0,80 (95% ДИ: 34,6–37,7) р1-2<0,001	27,9±1,30 (95% ДИ: 25,3–30,4) р1-3=0,03 р2-3<0,001	23,9±1,10 (95% ДИ: 21,7–26,0) р1-4=0,5 р2-4<0,001 р3-4=0,04

 

Аминотрансферазы являются сложными белками-ферментами, которые катализируют процессы трансаминирования и обеспечивая синтез отдельных аминокислот в организме. Доказано, что под влиянием повреждающего факторов нарушается энергетический метаболизм гепатоцитов, что приводит к повышению проницаемости клеточных мембран и появлению в сыворотке крови компонентов цитоплазмы.

Поскольку маркер повреждения клеточных – ГГПТ в наибольшей степени содержится в почках, печени и тонкой кишке то можно предположить о наличии воспалительного процесса в указанных органах, что сопоставляется с данными литературы о системности воспалительного процесса при РА, аналогом которого является АА у животных [50].

Применение ДН привело к усилению цитолитических процессов, на что указывало еще большее возрастание исследуемых маркеров в периферической крови – так АлАТ был выше на 22,2% (р<0,01), а АсАТ – на 20,7% (р=0,2) относительно показателей крыс с АА без лечения, что на 57,1% (р<0,01) и 52,2% (р<0,01) соответственно превышало показатели интактных животных (табл. 1). Летальности в группе комбинированного применения ДН и КЭП не отмечено. Указанные изменения со стороны активности аминотрансфераз согласуются с данными о гепатотоксическом действии ДН [3, 8, 64–66].

Также установлено, что на фоне применения ДН ГГТП статистически достоверно (р<0,001) снизилась на 22,9% относительно показателей животных контрольной группы (табл. 1)

Особое внимание привлекают показатели цитолитических процессов у крыс с АА на фоне комбинированного применения ДН и КЭП (табл. 1). Так установлено, что АлАТ статистически достоверно (р<0,01) был ниже на 38,9%, а АсАт – ниже (р<0,01) на 37,9% относительно показателей животных, которым вводили ДН, что соответственно на 16,7% (р=0,02) и 17,2% (р<0,001) было ниже показателей крыс контрольной группы с нелеченым АА. Установленные изменения со стороны аминотрансфераз указывают на способность КЭП нивелировать не только АА-индуцированный цитолитический сидром, но и сопутствующий цитолиз, усиливаемый ДН, что указывает на универсальность его цитопротективной активности, вероятно, обусловленной его способность стабилизировать клеточные мембраны, а также его антиоксидантными свойствами.

Кроме того установлено, что комбинированное применение ДН и КЭП сопровождалось также статистически достоверным (р<0,001) снижением уровня ГГТП на 28,6% относительно нелеченых крыс с АА, что на 11,4% было ниже (р=0,01) чем у крыс, леченных только ДН (табл. 1).

Оценка уровня щелочной фосфатазы в периферической крови у крыс с АА показала, что развитие системного аутоиммунного воспаления сопровождалось статистически достоверным (р<0,001) повышением указанного металлопротеина на 77,3% относительно показателей интактных крыс и составило 390 [335; 405] мкмоль/ч×л (рис. 5).

 

Рисунок 5 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на уровень щелочной фосфатазы в периферической крови у крыс с АА на 28-е сутки эксперимента

Примечание: распределение величин ненормальное. Боксы включают результаты от 25-го до 75-го перцентиля, вертикальные линии за пределами боксов – минимальное и максимальное значения. Горизонтальная линия внутри бокса – медиана (► – медиана равна 25 (75) перцентилю), ♦ – среднее значение; ● – p<0,05 относительно показателей интактных крыс, ■ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА без лечения; ▲ – p<0,05 относительно показателей крыс с АА, леченных ДН

 

Щелочная фосфатаза – гетерогенный энзим, состоящий из отдельных изоферментов, каждый из которых сосредоточен в определенном органе: печени, костной ткани, кишечнике, плаценте. Локализуясь на клеточной мембране, фермент подключается к транспортировке биологически важных соединений, в первую очередь, фосфора. Щелочная фосфатаза активно участвует в процессах фосфорно-кальциевого обмена в организме. Рост активности щелочной фосфатазы указывает на активацию процессов ремоделирования костной ткани, поскольку ее костная фракция синтезируется остеобластами и их предшественниками и участвует в минерализации костного матрикса [50, 67–69]. Повышение активности данного фермента может указывать на повышение остеобластической активности и усиление деструктивных изменений в печени или возникновения холестаза у крыс с АА [3].

Монотерапия ДН привела к статистически достоверному (р<0,01) снижению активности щелочной фосфатазы на 28,2%, а комбинированное применение ДН и КЭП сопровождалось более выраженным снижением активности указанного фермента на 38,5% (р<0,01) относительно показателей нелеченых крыс с АА (рис. 5).

Изучение белкового спектра крови крыс с АА показало, что уровень общего белка практически не имел различий у интактных крыс и крыс с АА (табл. 2).

 

Таблица 2 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на показатели белкового гомеостаза в периферической крови крыс с АА на 28-е сутки эксперимента (M±m (95% ДИ) или Ме [LQ; UQ]; n=28)

Исследуемый показатель, единицы измерения	Условия эксперимента
	І группа	ІІ группа	ІІІ группа	ІV группа
	Интактные крысы	Контроль (АА без лечения)	АА +ДН	АА +ДН +КЭП
n	7	7	7	7
Общий белок, г/л	78,9±1,45 (95% ДІ: 76,0–81,7)	74,6±1,36 (95% ДИ: 71,9–77,2) р1-2= 0,05	74,7±0,92 (95% ДИ: 72,9–76,5) р1-3= 0,03 р2-3= 0,9	81,0±1,50 (95% ДИ: 78,1–83,9) р1-4= 0,3 р2-4=0,01 р3-4<0,01
Альбумины, г/л	35,3±1,69 (95% ДИ: 32,0–38,6)	25,1±1,03 (95% ДИ: 23,1–27,2) р1-2<0,001	27,9±1,30 (95% ДИ: 25,3–30,4) р1-3<0,01 р2-3=0,1	37,4±1,90 (95% ДИ: 33,7–41,2) р1-4=0,01 р2-4<0,001 р3-4<0,01
Глобулины, г/л	45,7±1,54 (95% ДИ: 42,7–48,7)	49,6±1,29 (95% ДИ: 47,0–52,1) р1-2= 0,08	46,7±1,19 (95% ДИ: 44,4–49,0) р1-3=0,6 р2-3=0,1	40,4±0,65 (95% ДИ: 39,2–41,7) р1-4 < 0,01 р2-4 < 0,001 р3-4 < 0,001
Соотношение «альбумины/ глобулины»	0,78±0,039 (95% ДИ: 0,70–0,85)	0,51±0,028 (95% ДИ: 0,46–0,57) р1-2<0,001	0,60±0,035 (95% ДИ: 0,53–0,67) р1-3<0,01 р2-3=0,07	0,93±0,045 (95% ДИ: 0,84–1,02) р1-4=0,03 р2-4<0,001 р3-4<0,001

 

Изучение содержания отдельных белковых фракций показало, что развитие АА у крыс сопровождалось статистически достоверным (р<0,001) снижением содержания альбуминов на 28,7% относительно показателей интактных крыс. Альбумины – наиболее гомогенная фракция протеинов, основной функцией которых является поддержание коллоидно-осмотического давления, а также транспорт углеводов, липидов, гормонов и пигментов. Организм пациента с активным РА более активно потребляет альбумины в месте воспаления, в результате чего развивается гипоальбуминемия.

Кроме того, отмечено, что у крыс с АА незначительно возрастало содержание глобулинов на 8,4% (р=0,04) относительно показателей интактных животных. Как известно, при длительном подостром прогрессирующем процессе наблюдается, главным образом, гипергамаглобулинемия, что связано с ростом уровня аутоантител [50, 51, 70, 71].

Указанные изменения приводили к статистически достоверному (р<0,001) снижению значения альбумин/глобулинового соотношения периферической крови на 34,2% относительно показателей интактных животных (табл. 3). Изменение соотношения протеиновых фракций, как правило, соответствует тяжести РА и отражает динамику воспалительного процесса [50, 51, 70, 72].

Монотерапия ДН привела к статистически достоверному (р=0,04) снижению значения альбумин/глобулинового соотношения на 17,5% относительно крыс с АА без лечения. Комбинированное же применение ДН и КЭП сопровождалось полным повышением (р=0,01) исследуемого соотношения на 19,5% выше чем у интактных животных, что обусловлено повышением уровня альбуминов практически до уровня интактных животных и в то же время на 11,6% ниже (р<0,01) значения у интактных крыс содержание глобулинов (табл. 3).

 

Таблица 3 – Влияние ДН и его комбинации с КЭП на показатели липидного гомеостаза в периферической крови крыс с АА на 28-е сутки эксперимента (M±m (95% ДІ) или Ме [LQ; UQ]; n=28)

Исследуемый показатель, единицы измерения	Условия эксперимента
	І группа	ІІ группа	ІІІ группа	ІV группа
	Интактные крысы	Контроль (АА без лечения)	АА +ДН	АА +ДН +КЭП
n	7	7	7	7
Общие липиды, г/л	3,0 [2, 7–3, 3]	5,1 [4, 5–5, 2] р1-2<0,001	4,4 [4, 2–4, 5] р1-3<0,001 р2-3= 0,07	3,3 [3, 2–3, 4] р1-4= 0,1 р2-4<0,001 р3-4<0,001
Фосфолипиды, г/л	2,1±0,05 (95% ДИ: 2,0–2,2)	2,5±0,09 (95% ДИ: 2,3–2,7) р1-2<0,001	2,0±0,05 (95% ДИ: 1,9–2,1) р1-3=0,6 р2-3<0,001	2,1±0,05 (95% ДИ: 2,0–2,2) р1-4= 0,5 р2-4<0,01 р3-4=0,2
Фосфолипиды относительно общих липидов, %	70,9±5,35 (95% ДИ: 60,4–81,4)	53,2±3,60 (95% ДИ: 46,2–60,3) р1-2=0,02	46,9±1,80 (95% ДИ: 43,3–50,4) р1-3<0,01 р2-3=0,1	65,2±2,47 (95% ДИ: 60,3–70,0) р1-4=0,4 р2-4=0,02 р3-4<0,001

 

Важную роль в жизнедеятельности клетки играют липиды, которые выступают структурными компонентами биомембран, энергетическим субстратом клетки, участвующие в реакциях сигнальной трансдукции, экзо- и эндоцитоза и тому подобное. Кроме того, они участвуют в фиксации белков фосфолипидного бислоя и обеспечивают их соответствующую ориентацию в клеточной мембране, является неполярным средой для жирорастворимых субстратов и кофакторов ферментов, обусловливают их фолдинг, а также выполняют роль регуляторов и модуляторов ферментативной активности [69, 73].

Исследование показало, что у крыс на фоне развития АА отмечается статистически достоверное (р=0,02) снижение доли фосфолипидов в пуле общих липидов на 25,0%. При этом отмечено рост общего уровня липидов (р<0,001) в 1,7 раза и непропорциональный рост содержания фосфолипидов (р<0,001) в 1,2 раза, что обусловлено активацией циклооксигеназного пути метаболизма мембранных фосфолипидов (табл. 3).

На фоне монотерапии ДН отмечено снижение уровня общих липидов (р=0,07) в 1,3 раза и снижение уровня фосфолипидов (р<0,001) так же в 1,3 раза относительно показателей животных с АА без лечения, что соответствовало развитию еще большего дисбаланса содержания фосфолипидов в пуле общих липидов – их содержание снизилось еще на 6,3%, однако указанные изменения не достигли уровня статистической значимости (р=0,1).

На фоне комбинированного применения ДН и КЭП у крыс с АА отмечена статистически достоверная (р=0,02) гармонизация липидного баланса – содержание фосфолипидов вырос на 22,6% относительно показателей животных с АА без лечения и составил соответственно 2,1±0,05 (95% ДИ: 2,0–2,2) г/л. Указанные изменения наблюдались на фоне снижения уровня общих липидов в сыворотке крови (р<0,001) на 35,3% относительно показателей нелеченых крыс и составили соответственно 3,3 [3, 2–3, 4] г/л, что сопоставлялось с показателями интактных животных 3,0 [2, 7–3, 3] г/л.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение диклофенака натрия и криоконсервированного экстракта плаценты крысам с адъювантным артритом привело нормализации уровня активных продуктов тиобарбитуровой кислоты, что указывает на нивелирование признаков артрит-индуцированного оксидативного стресса. Также выявлено статистически достоверное (р=0,01) повышение уровня супероксиддисмутазы на 30,6% относительно значений у крыс контрольной группы.

Установлено усиление противовоспалительных свойств диклофенака натрия на фоне комбинированного применения диклофенака натрия с криоконсервированным экстрактом плаценты – уровень С-реактивного белка снизился (p<0,001) на 61,1% относительно нелеченых крыс, а уровень серомукоида статистически достоверно (р<0,01) снизился на 17,1% относительно показателей крыс группы монотерапии исследуемым НПВП.

Показано, что уровень аланин-аминотрансфераз статистически достоверно (р<0,01) был ниже на 38,9%, а аспартат-аминотрансферазы – ниже (р<0,01) на 37,9% относительно показателей животных, которым вводили диклофенак натрия, что соответственно на 16,7% (р=0,02) и 17,2% (р<0,001) было ниже показателей крыс контрольной группы с нелеченым адъювантным артритом. Установленные изменения со стороны аминотрансфераз указывают на способность криоконсервированного экстракта плаценты нивелировать не только артрит-индуцированный цитолитический сидром, но и диклофенак-индуцированный.

Комбинированное применение криконсервованого экстракта плаценты и диклофенака натрия сопровождалось нормализацией уровня общих липидов и фосфолипидов в сыворотке крови крыс на фоне экспериментального ревматоидного артрита. Так содержание фосфолипидов в пуле фосфолипидов статистически достоверно (р=0,02) выросло на 22,6% относительно показателей животных с адъювантной артритом без лечения.

В дальнейшем, для корректной оценки активности воспалительного процесса целесообразно определение уровня матриксных металлопротеиназ и гомоцистеина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность лаборантам Отдела экспериментальной криомедицины З.Е. Губенко и Л.М. Гордеевой и заведующей вивария Л.В. Бацуновой Института проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины за помощь в проведении экспериментальных исследований.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Данное исследование не имело финансовой поддержки от сторонних организаций.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Ф.В. Гладких – идея, концепция и дизайн исследования, координация и участие в проведении экспериментальной работы, сбор материалов, статистическая обработка и анализ полученных данных, написание основного текста статьи и формулирование выводов; Н.А. Чиж – концепция исследования, участие в проведении экспериментальной работы, сбор материалов, редактирование текста статьи; А.А. Манченко – участие в проведении экспериментальной работы, сбор материалов;

И.В. Белочкина – участие в проведении экспериментальной работы, сбор материалов, поисково- аналитическая работа; И.П. Михайлова – участие в проведении экспериментальной работы, сбор материалов.

 

¹ Стефанов О.В. Доклінічні дослідження лікарських засобів : методичні рекомендації; за ред. член-кор. АМН України О.В. Стефанова. – Київ: Видавничи дім «Авіцена», 2001. – 527 с.

² Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. Москва: МЕДпресс-информ; 2009. 896 с.

Об авторах

Фёдор Владимирович Гладких

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины; ГУ «Институт медицинской радиологии и онкологии им. С.П. Григорьева Национальной академии медицинских наук Украины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: fedir.hladkykh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7924-4048

аспирант (доктор философии в области здравоохранения по специальности «222 – Медицина») отдела экспериментальной криомедицины; младший научный сотрудник группы лучевой патологии и паллиативной медицины отдела радиологии

Украина, 61016, Украина, г. Харьков, ул. Переяславская, д. 23; 61024, Украина, г. Харьков, ул. Пушкинская, д. 82

Николай Алексеевич Чиж

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины

Email: chizh.cryo@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0085-296X

кандидат медицинских наук, старший исследователь, и. о. заведующего отделом экспериментальной криомедицины

Украина, 61016, Украина, г. Харьков, ул. Переяславская, д. 23

Анна Александровна Манченко

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины

Email: anna.gorlenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5982-4504

кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник отдела экспериментальной криомедицины

Украина, 61016, Украина, г. Харьков, ул. Переяславская, д. 23

Ирина Владиславовна Белочкина

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины

Email: ibelochkina@ukr.net
ORCID iD: 0000-0003-0090-2971

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела экспериментальной криомедицины

Украина, 61016, Украина, г. Харьков, ул. Переяславская, д. 23

Ирина Павловна Михайлова

Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины

Email: expcryomed@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9388-2820

научный сотрудник отдела экспериментальной криомедицины

Украина, 61016, Украина, г. Харьков, ул. Переяславская, д. 23

Список литературы

Дополнительные файлы