Исследование безопасности биоаналога ромиплостима
- Авторы: Афанасьева А.Н.1, Сапарова В.Б.1,2, Карал-Оглы Д.Д.3, Мухаметзянова Е.И.3, Куркин Д.В.4, Калатанова А.В.1, Макаренко И.Е.1,2, Хохлов А.Л.5, Луговик И.А.1
-
Учреждения:
- Закрытое акционерное общество «Фарм-Холдинг»
- Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
- Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии»
- Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
- Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
- Выпуск: Том 10, № 4 (2022)
- Страницы: 354-370
- Раздел: Статьи
- URL: https://journals.eco-vector.com/2307-9266/article/view/352519
- DOI: https://doi.org/10.19163/2307-9266-2022-10-4-354-370
- ID: 352519
Цитировать
Полный текст
Список сокращений: ИТП – идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура; TPO – тропмбопоэтин; TPO-R – тромбопоэтиновый рецептор; КЗЦ – комплемент-зависимая цитотоксичность; СК – система комплемента; КП – классический путь; БА – биологическая активность; СО – стандартный образец; ВКО – внутренний контрольный образец; ОИ – объект испытания; EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация; IC50 – концентрация полумаксимального ингибирования; МАТ – моноклональные антитела; ЛП – лекарственный препарат; ЧДД – частота дыхательных движений; плотность – удельный вес; рН – водородный показатель; TP – общий белок; GLU – глюкоза; BIL – билирубин (в моче); UBG – уробилиноген; KET – кетоновые тела; RBC – количество эритроцитов; MCV – средний объем эритроцита; Hgb – гемоглобин; MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците; MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците; Hct – гематокрит; Plt – количество тромбоцитов; PCT– тромбокрит; MPV – средний объем тромбоцитов; PDW – относительная ширина распределения тромбоцитов по объему; WBC – лейкоциты; MON – моноциты; LYM – лимфоциты; NE – нейтрофилы; EO – эозинофилы; BA – базофилы; АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время; ПВ – протромбиновое время; ALP – щелочная фосфатаза; ALT – аланинаминотрансфераза; AST – аспартатаминотрансфераза; LDH – лактатдегидрогеназа; TB – общий билирубин (крови); UREA – мочевина; CRE – креатинин; CHOL – холестерин; TG – триглицериды; ; ALB – альбумин; GLB – глобулин; ALB/GLB – альбумин/глобулиновое соотношение; Mean – среднее статистическое; SD – стандартное отклонение; Т-тест – t-критерий Стьюдента; Me – медианна; Q1 – 1 квартиль; Q3 – 3 квартиль; U-критерий – U-критерий Манна-Уитни.
ВВЕДЕНИЕ
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП) – это тяжелое заболевание, которое характеризуется тромбоцитопенией (<100×109/л) и требует для поддержания свёртываемости крови стимуляторов тромбопоэза [1–3]. В настоящее время на территории Российской Федерации (РФ) зарегистрировано всего 2 препарата, относящихся к этой группе – Энплейт® (Nplate, AMGEN EUROPE, B.V.)1 и Револейд® (Revolade, NOVARTIS PHARMA, AG)2. Действующее вещество препарата Энплейт® – ромиплостим – было многократно проверено на эффективность и показало свою терапевтическую активность при лечении идиопатической тромбоцитопенической пурпуры. Это позволило пациентам получать современную терапию, улучшающую качество жизни [1, 4–6]. Однако этот препарат производится за пределами РФ, что повышает его стоимость для потребителя, а при создании биоаналога используются более новые технологии, что в конечном счёте влияет на стоимость их производства [7]. Поскольку при ИТП приём стимуляторов тромбопоэза требуется постоянно [3, 8], их наличие и экономическая доступность являются жизненно важными для пациентов. Создание биоаналога ромиплостима позволит повысить доступность лечения на территории РФ.
Ромиплостим (Рис. 1) представляет собой пептидное антитело, содержащее четыре связывающих TPO-R (тромбопоэтиновый рецептор, MPL) домена с высокой аффинностью к TPO-R и один домен IgG1 Fc-носителя, которое не имеет гомологии последовательностей с эндогенным тромбопоэтином (ТPO) [9–11]. Ромиплостим связывается и активирует TPO-R на предшественниках мегакариоцитов в костном мозге. Он связывается так же, как эндогенный ТРО, и может вытеснять ТРО из связи с рецептором. Ромиплостим, аналогично TPO, активирует многие из тех же путей, что приводит к устойчивому повышению количества тромбоцитов [9, 12–15]. Гораздо меньше известно об эффектах, опосредованных Fc-областью молекулы ромиплостима. Например, одним из возможных вариантов может быть комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ), поскольку этот механизм реализован в моноклональных антителах (МАТ) посредством связывания Fc-фрагмента для активации системы комплемента [16–18].
Рисунок 1 – Химическая структура ромиплостима
Примечание: ромиплостим представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из домена рецептора Fc на N-конце, слитого с доменом связывания рецептора тромбопоэтина на С-конце.
Известно, что система комплемента (СК) является неотъемлемой частью как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. Этот комплекс состоит из группы белков плазмы, которые взаимодействуют каскадным образом [19]. СК может быть активирована тремя разными путями, один из которых – классический путь (КП) обычно активируется антителами. Он опосредует специфические иммунные реакции и функционирует как часть адаптивного иммунитета. КП запускается тогда, когда молекула комплемента C1q связывается с Fc-частями антигена. Связывание с антителом вызывает конформационные изменения в молекуле C1q, приводящие к активации двух протеаз C1r и дальнейшему распаду двух молекул C1s (другая сериновая протеаза). Комплекс C1 теперь связывается с C2 и C4 и расщепляет их. Продукт C4b ковалентно связывается с клеточной поверхностью и образует комплексы C4bC2. Активированные C1s далее расщепляют C4bC2 и генерируют C4bC2a, которая представляет собой конвертазу C3/C5 КП. Затем, если активация комплемента не ограничена, она переходит к образованию мембранно-атакующего комплекса (МАК) и лизису клетки-мишени [19].
Общепризнано, что (МАТ) могут опосредовать эффекты, которые невозможно полностью выявить с помощью исследований in vitro, что обуславливает целесообразность проведения исследований биоэквавалентности на животных3.
ЦЕЛЬ. Изучение in vitro и in vivo безопасности биоаналога ромиплостима GP40141 в сравнении с референтным препаратом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
In vitro определение комплемент-зависимой цитотоксичности
КЗЦ для препаратов ромиплостима оценивали в сравнении с показательным методом КЗЦ для препарата ритуксимаб. Этот препарат представляет собой химерное МАТ, специфически связывающееся с антигеном CD20 на поверхности нормальных и злокачественных В-лимфоцитов и инициирующее иммунологические реакции, которые опосредуют лизис В-клеток. Один из рабочих механизмов препарата идёт через КЗЦ [20]. В тесте КЗЦ для ромиплостима в качестве тест-системы использовали клеточную линию лимфобластов мыши (Mus musculus) со стабильной экспрессией TPO рецептора человека 32D hTPOR clone 63 (Selvita Group). Эффект комплемент-зависимой цитотоксичности сравнивался для оригинального препарата ромиплостима (AMGEN, Нидерланды) и его биоаналога GP40141 (ООО «ГЕРОФАРМ», Россия). Концентрацию комплемента подбирали исходя из отсутствия токсичности самого комплемента на клетки, в результате выбрали разбавление 1:14.
В первый день эксперимента проводили рассев клеток и внесение объектов испытания (ОИ) с комплементом сыворотки крови кролика (Cedarlane, CL3441-S50). Для ОИ были подобраны концентрации, которые используются для оценки специфической биологической активности (БА) на клеточной линии 32D-hTPOR clone (63: 10; 3,3; 1,1; 0,4; 0,1; 0,04; 0,005; 0,002; 0,001; 0,0002 нг/мл). Данные концентрации добавлялись в среду для анализа RPMI Basal, состоящей из RPMI 1640 (Биолот, 1.3.4.), 1 мМ ХЕПЕС (Биолот, 1.2.6.1.), 10 мМ пирувата натрия (Биолот, 1.4.004.), до 1,5 г/л бикарбоната натрия (Sigma-Aldrich, S5761), до 4,5 г/л глюкозы безводной (PanReac AppliChem, 141341), пенициллин-стрептомицин (Биолот, 1.3.18.), к которой добавляли 10% эмбриональной бычьей сыворотки FBS (Capricorn, FBS-11A). После приготовления ОИ подготавливали комплемент сыворотки крови кролика с разбавлением 1:14 и рассевали линию в лунки 96-луночного белого планшета (Corning, 3917) в концентрации 5000 клеток/лунка, подсчёт клеток проводили с помощью счётчика клеток Countess II FL (ThermoFisher Scientific, США). Добавляли к клеткам в разные лунки ОИ с комплементом и ОИ без комплемента. Инкубировали 24±4 ч при 37°С и 5% диоксидом углерода. Затем остужали планшет до комнатной температуры в течение 1 ч и вносили в каждую лунку реагент CellTitter-Glo (Promega, G7571) в эквиобъемном соотношении с культуральной жидкостью. Клетки лизировали механически на орбитальном шейкере в течение 2 мин также при комнатной температуре. Затем инкубировали планшеты в течение 10 мин для стабилизации люминесцентного сигнала, после чего регистрировали люминесценцию на мультимодальном микропланшетном ридере CLARIOstar (BMG Labtech, Германия). Настройки на приборе включали Presets Ultra Glo, время интегрирования – 0,4 сек на 1 лунку.
В тесте КЗЦ для ритуксимаба в качестве тест-системы использовали клеточную линию B-лимфобластов человека WIL2-S. В качестве ОИ использовали стандартный образец (СО) ритуксимаба (Mabxience, Испания) и внутренний контрольный образец ритуксимаба (ВКО). В первый день эксперимента аналогично с КЗЦ для ромиплостима, проводили рассев клеток и внесение ОИ с комплементом сыворотки крови кролика. Для КЗЦ ритуксимаба концентрация комплемента была подобрана в соотношении 1:7, в которой отсутствовала токсичность самого комплемента. Для ОИ были подобраны концентрации 5000, 2000, 800, 320, 128, 51, 20, 8, 3, 1.3, и 0,5 нг/мл, разбавление которых проводили в аналогичной с КЗЦ для ромиплостима среде анализа. После приготовления ОИ подготавливали комплемент сыворотки крови кролика и рассевали линию в лунки 96-луночного черного планшета (Corning, 3603, США) в концентрации 10000 клеток/лунка. Инкубировали планшет при 37°С и 5% диоксиде углерода в течение 2 ч, а затем добавляли alamarBlue™ Cell Viability Reagent (Thermo Fisher Scientific, DAL1100, США) и снова ставили инкубировать до 24 часов. По истечении времени регистрировали флюоресценцию на мультимодальном микропланшетном ридере CLARIOstar. Анализ данных для двух тестов проводился в интегрированном программном обеспечении MARS Data Analysis, а статистический анализ в программе GraphPad Prism 9.3.1.471, где нормировали данные в процентах относительно нулевого контроля, затем строили четырехпараметрическую кривую зависимости доза-реакция для подсчета величины EC50 (полумаксимальная эффективная концентрация).
In vivo исследование безопасности
Исследование проводилось на базе ФГБНУ «Научно-исследовательский институт приматологии» (г. Сочи, Россия) в строгом соответствии со стандартами Rus-LASA4,5 [20]. Проведение исследования было одобрено независимым локальным этическим комитетом (выписка из протокола № 61 от 09.02.2021).
В качестве тест системы были использованы клинически здоровые макаки яванские (Macaca fascicularis). ОИ филогенетически достаточно близки человеку и, при этом, в рамках доклинических исследований безопасности оригинального препарата у них не отмечалось образования нейтрализующих антител к ромиплостиму, в отличии от крыс, мышей и макак-резусов в исследованиях аналогичной продолжительности, что позволяет в наибольшей степени предсказать риски, связанные с первичной фармакодинамикой у людей6. Все это позволило рассматривать данных животных как наиболее релевантных для сравнительного исследования безопасности.
В соответствии с решением Совета ЕЭК 8,9 при формировании экспериментальных групп необходимо придерживаться гибкого подхода – допустимо использовать животных только одного пола и только одну дозу препаратов – что позволяет в полной мере следовать принципу Reduce (сокращение числа используемых животных) из основополагающих принципов гуманности 3R7. Однако применение подобных способов сокращения количества животных требует обоснования. Животные одного пола были использованы в силу того, что токсикологический профиль оригинального препарата ромиплостим не различался между самцами и самками в рамках многочисленных токсикологических экспериментов, что указывает на отсутствие специфических токсических проявлений, связанных с полом8. Из этого следует, что введение животных двух полов не приведет к получению дополнительной информации о безопасности вещества и противоречит биоэтическому принципу Reduce. Следующим шагом к сокращению количества животных стало упразднение контрольной группы. Согласно Решению Директивы ЕС 89, допустимо проводить исследование с измененным дизайном (используя лишь одну дозу биоаналогичного (биоподобного) лекарственного препарата (ЛП) и оригинального (референтного) ЛП. Для того, чтобы сравнивать динамику показателей животных, проводилось снятие всех основных лабораторных и функциональных показателей до начала дозирования для того, чтобы исходные данные животных выступали некоторым контролем последующих точек измерения.
В связи с этим, для эксперимента отобрали 12 половозрелых самцов массой 2,65–3,95 кг. Животных делили на группы по уровню тромбоцитов, который был измерен за 7 дней до введения препаратов, после чего, для устранения предпочтений исследователя, экспериментальные группы были составлены путем рандомизации животных из сформированных групп. Животные были разделены на 2 группы, по 6 самцов в каждой. Группа 1 получала биоаналог GP40141, группа 2 – оригинальный препарат ромиплостим (табл. 1).
Таблица 1 – Схема распределения экспериментальных животных по группам
№ группы | Животные | Объект испытаний/ контрольный образец | Способ введения | Доза, мкг/кг | Продолжительность введения | |
Пол | Количество в группе | |||||
1 | ♂ | 6 | GP40141 | подкожно | 100 | 28 дней, 1 раз в 72 часа |
2 | ♂ | 6 | Ромиплостим | 100 | ||
Примечание. ♂ – мужской пол.
При подборе доз в рамках исследований безопасности критически важной точкой является выбор дозировки и кратности введения объекта испытаний и контрольного образца, так как, с одной стороны, они должны позволить в полной мере оценить потенциальные неблагоприятные последствия и этим самым обезопасить участников клинических исследований, а, с другой стороны, не быть излишними, не допуская напрасных страданий животных в рамках исследований9,10,11. В связи с этим, в качестве разумного компромисса, была выбрана дозировка 100 мкг/кг, так как она позволяет значительно (в 10 раз) превысить терапевтическую дозу для клинического применения12 и использовалась в более ранних исследованиях безопасности оригинального препарата ромиплостим13. Данная доза была напрямую экстраполирована из клинической практики на животных, коэффициент пересчета доз не применялся.
Препараты вводили многократно, на протяжение 28 дней с кратностью 1 раз в 72 ч, так как данная кратность введения повторяет дизайн исследования оригинального препарата ромиплостим и позволяет добиться стабильной системной экспозиции в плазме животных14. Содержимое флакона с объектами испытания и СО представляло собой порошок, разведенный в 0,72 мл стерильной водой для инъекций с целью получения концентрации 250 мкг/0,5 мл (500 мкг/мл) сразу после приготовления. Препараты конкретному животному вводились в одно и то же место на протяжении всего исследования (28 дней).
Кормление и содержание животных осуществлялось в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. На протяжении всего эксперимента животные содержались в индивидуальных клетках, на которых указывались инвентарный номер животного, группа и пол. Клетки были оборудованы центральным водопроводом. Температура окружающего воздуха была 21–28°С, относительная влажность 40–70%, естественная продолжительность светового дня (г. Сочи). Рацион животных состоял из гранулированного корма, яиц, сухофруктов, свежих фруктов и хлеба. Кормление осуществляли в три этапа: 8–9 ч гранулированная кормовая смесь; 11–12 ч сочные корма, рисовая каша и печенье; 14–15 ч гранулированная кормовая смесь. Вода предоставлялась ad libitum и соответствовала требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01, ГН 2.1.5.1315-03, ГН 2.1.5.2280-0715,16,17.
В ходе исследования ежедневно оценивались смертность, внешний вид (кожа, шерсть, глаза, нос, дыхание, стул, слизистые оболочки, положение тела, поведение и координация) и потребление корма. Масса, температура тела, частота дыхательных движений (ЧДД) оценивались в 0, 15 и 29 сутки вместе с отбором проб мочи и крови животных.
Отбор проб мочи осуществляли с поддона клетки в пробирки. Анализировали следующие показатели: цвет, прозрачность, удельный вес (плотность), водородный показатель рН, белок (UP), глюкоза (GLU), билирубин (BIL), кетоновые тела (KET), эритроциты (ERY), лейкоциты (LEY), уробилиноген (UBG). Анализ проводили на анализаторе DocUReader 2 PRO с использованием тест-полосок этой же фирмы.
Отбор проб крови для клинического анализа осуществляли в капиллярные пробирки Microvette Sarstedt, 200 мкл, с К3-ЭДТА. В образцах крови экспериментальных животных определяли следующие показатели: гемоглобин (Hgb), количество эритроцитов (RBC), количество лейкоцитов (WBC), лейкоцитарную формулу (LYM), моноциты (MON), нейтрофилы (NE), эозинофилы (EO), базофилы (BA), количество тромбоцитов (Plt), гематокрит (Hct), средний объем эритроцита (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC), тромбокрит (PCT), средний объем тромбоцитов (MPV), относительная ширина распределения тромбоцитов по объему (PDW). Анализ проводился на автоматическом гематологическом анализаторе MEK 7300К (ООО «ЭКО-МЕД-С М», Россия). Для анализа использовались реагенты для гематологического анализатора фирмы Nihon Kohden (Firenze S.r.l.Ю Италия). Подсчет количества клеток производился методом объемного сопротивления; концентрация гемоглобина определялась спектрофотометрическим методом; гематокрит, тромбокрит, ширина распределения эритроцитов и тромбоцитов вычислялись по гистограммам.
Для определения биохимических показателей за 18 ч до отбора проб крови животных лишали корма, сохраняя свободный доступ к воде. Взятие крови осуществляли в пробирки для получения сыворотки с активатором сгустка и гелем VACUETTE (5 или 8 мл) из левой паховой вены. Из крови получали сыворотку обычным методом: инкубация при комнатной температуре 30 мин, центрифугирование – при 3500 об/мин. Оценивали следующие параметры: аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (AST), коэффициент де Ритиса, общий белок (TP), альбумин (ALB), глобулин (GLB), соотношение альбумин/глобулин (ALB/GLB), щелочная фосфатаза (ALP), билирубин общий (TB), общий холестерин (CHOL), креатинин (CRE), глюкоза (GLU), лактатдегидрогеназа (LDH), триглицериды (TG), натрий (Na+), калий (K+), мочевина (UREA). Биохимический анализ крови проводился на биохимическом анализаторе BioLit-8020 (URIT Medical Electronic Group Co., Ltd, Китай). Для анализа использовались реагенты производства фирмы DAC, Молдова. Используемый метод измерения – колориметрия (кинетика, конечная точка).
Для проведения коагулометрического анализа кровь отбирали в вакуумные пробирки S-Monovette® (Германия) с поршнем объемом 1,4 мл. Для исследования влияния на свертывающую систему крови анализировали активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), фибриноген. Анализ на коагуляционный гемостаз проводился на коагулометре TS 4000 Plus (Россия). Метод определения ПВ-клоттинговый, основан на определении времени свертывания цитратной плазмы крови под действием смеси тромбопластина и ионов кальция. Метод определения АЧТВ: к исследуемой плазме крови последовательно добавляют реагент, представляющий собой водный раствор эллаговой кислоты в комплексе с соевыми фосфолипидами, и кальций хлористый. В процессе измерения АЧТВ регистровали время от момента добавления ионов кальция до момента образования сгустка. Фибриноген определяли методом Клаусса.
Статистическая обработка результатов анализа
Статистическая обработка данных in vivo части проводилась с помощью пакетов программного обеспечения R версии 3.5.2. Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверяли на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk`s W-test). В случае нормального распределения рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение, которые вместе со значением n (количество наблюдений) представлены в итоговых таблицах. В случае несоответствия данных закону нормального распределения рассчитывали медиану и квартильный размах. При выявлении межгрупповых отличий в данных с признаками нормального распределения использовали t-критерий Стьюдента, а в данных с признаками ненормального распределения U-критерий Манна-Уитни.
В случаях где применимо, при межгрупповых и внутригрупповых сравнениях сопоставлялись показатели, полученные для животных в различные сроки проведения эксперимента. Для оценки внутригрупповой динамики в данных с признаками нормального распределения использовали t-критерий Стьюдента, а в данных с признаками ненормального распределения – критерий Фридмана. Для анализа частот проявления некоторых параметров (уровень эритроцитов в моче) применялся точный критерий Фишера.
Результаты сравнения считались статистически значимыми при р ≤0,05. Графическое представление данных проводилось в программе GraphPad Prism 9.3.1.471.
РЕЗУЛЬТАТЫ
In vitro комплемент-зависимая цитотоксичность
Для оценки КЗЦ были проанализированы серии 1107017А оригинального препарата ромиплостим и его биоаналога GP40141, данные представлены на рисунке 2 и в таблице 2. Тест КЗЦ ритуксимаб рассматривался как эталонный пример комплемент-зависимой цитотоксичности (Рис. 2А). Для теста КЗЦ ромиплостима рассчитывали EC50 относительно контроля без внесения ОИ и комплемента. С этой целью в программе GraphPad Prism 9 сначала нормировали значения, а затем строили кривую логарифмической реакции, которая имеет симметричную сигмоидальную форму, её также называют четырехпараметрической кривой доза-реакцией. Аналогичным образом рассчитывали и для КЗЦ ритуксимаб.
Рисунок 2 – Графики комплемент-зависимой цитотоксичности
Примечание: А – КЗЦ ритуксимаб, Б – КЗЦ ромиплостим.
Таблица 2 – Показатели относительной активности КЗЦ для ромиплостима
Образец | EC50, нг/мл | R2 | Относительная активность, % |
GP40141 (нг/мл) + комплемент (1:14) | 0,128 | 0,995 | 72% |
GP40141 (нг/мл) | 0,093 | 0,989 | n/a |
Ромиплостим (нг/мл) + комплемент (1:14) | 0,084 | 0,994 | 87% |
Ромиплостим (нг/мл) | 0,073 | 0,992 | n/a |
Образец | IC50, нг/мл | R2 | Относительная активность, % |
Ритуксимаб RM-RX-03 + комлемент (1:7) | 125,6 | 0,951 | n/a |
Ритуксимаб RM-RX-02 + комлемент (1:7) | 121,7 | 0,948 | n/a |
Примечание: n/a – не применимо, R2 – коэффициент детерминации, EC50 – полумаксимальная эффективная концентрация, IC50 – концентрация полумаксимального ингибирования. Подсчёт EC50 и IC50 проводился по 11 концентрационным точкам в 3-х повторностях.
Основной механизм действия ритуксимаба реализуется через комплемент-зависимую цитотоксичность [21–24]. На рисунке 2А показана дозозависимость этого действия, где с увеличением концентрации ритуксимаба уменьшается сигнал жизнеспособных клеток. В отличие от ритуксимаба, для ромиплостима (рис. 2Б), наоборот, с увеличением концентрации препарата увеличивается сигнал жизнеспособных клеток, что является следствием его прямого биологического действия – связывание с рецепторами тромбопоэтина и индуцирование пролиферации клеток. Чтобы отличить пролиферацию от КЗЦ дополнительно смотрели образцы с и без комплемента между которыми нет различий и нет явного снижения сигнала для образцов в присутствии комплемента.
Для полученных значений EC50 рассчитывали относительную активность, сравнивая показатели для препарата без комплемента относительно препарата с комплементом в процентах. Для оригинального препарата ромиплостим и GP40141 получали схожие значения в 87% и 72%, которые можно считать незначительными из-за отсутствия снижения сигнала жизнеспособности клеток при стимуляции препарата совместно с комплементом.
In vivo исследование безопасности
Результаты сравнительной безопасности оригинального препарата ромиплостим и его бионаналога GP40141 на 12 самцах яванских макак представлены в таблицах 3–5 и рисунках 3–5.
Таблица 3 – Динамика изменения среднего веса (г) экспериментальных животных по группам, n=6
Группа | Параметр | День измерений | ||
0 | 15 | 29 | ||
GP40141 (группа 1) | Mean±SD | 3483±397,1 | 3525±248,5 | 3600±249,0 |
Т-тест, p Фон /День | n/a | 0,83 | 0,56 | |
Ромиплостим (группа 2) | Mean±SD | 3150±405,0 | 3116,7±469,8 | 3158±453,2 |
Т-тест, p Фон /День | n/a | 0,90 | 0,97 | |
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,07 | 0,06 | 0,05 | |
Примечание: Mean – среднее статистическое, SD – стандартное отклонение, Т-тест – t-критерий Стьюдента.
Таблица 4 – Динамика изменения средней температуры тела экспериментальных животных по группам, n=6
Группа | Параметр | День измерений | ||
0 | 15 | 29 | ||
GP40141 (группа 1) | Mean±SD | 38,68±0,24 | 38,80±0,18 | 38,63±0,26 |
Т-тест, p Фон/День | n/a | 0,36 | 0,74 | |
Ромиплостим (группа 2) | Mean±SD | 38,68±0,35 | 38,60±0,27 | 38,50±0,36 |
Т-тест, p Фон/День | n/a | 0,79 | 0,39 | |
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 1,0 | 0,24 | 0,48 | |
Примечание: Mean – среднее статистическое, SD – стандартное отклонение, Т-тест – t-критерий Стьюдента.
Таблица 5 – Динамика изменения средней ЧДД/мин экспериментальных животных по группам, n=6
Группа | Параметр | День измерений | ||
0 | 15 | 29 | ||
GP40141 (группа 1) | Mean±SD | 39,00±4,10 | 34,83±4,83 | 32,17±2,48 |
Т-тест, p Фон/День | n/a | 0,14 | 0,006 | |
Ромиплостим (группа 2) | Mean±SD | 34,17±2,71 | 33,50±3,02 | 32,83±2,14 |
Т-тест, p Фон/День | n/a | 0,70 | 0,37 | |
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,04 | 0,58 | 0,63 | |
Примечание: Mean – среднее статистическое, SD – стандартное отклонение, Т-тест – t-критерий Стьюдента.
Рисунок 3 – Показатели гематологического анализа
Рисунок 4 – Показатели биохимического анализа крови
Рисунок 5 – Показатели коагуляционного гемостаза
Влияние на общее состояние животных
На протяжении всего срока эксперимента отклонений в клиническом статусе животных и потреблении ими корма ни в одной из экспериментальных групп выявлено не было, летальности в группах не зафиксировано.
Влияние на динамику массы тела
Данные массы тела экспериментальных животных и статистической обработки представлены в таблице 3.
По результатам статистической обработки не выявлено достоверных отличий между средним весом экспериментальных животных до начала эксперимента с последующими днями наблюдения внутри групп (15-й и 29-й дни). Межгрупповые различия на 29-й день обусловлены тем, что один из самцов продемонстрировал выраженное увеличение массы тела (11%), что привело к уменьшению SD и возникновению статистически значимых различий между группами при отсутствии разницы в динамике прироста массы тела. Данные отличия не связаны с действием препаратов, а обусловлено индивидуальной динамикой роста данного животного.
Влияние на температуру тела
Значения температуры тела и результаты статистической обработки приведены в таблице 4.
Температура тела экспериментальных животных в исследованных временных точках оставалась в пределах нормы и значимо не изменялась относительно фоновых значений.
Влияние на ЧДД
ЧДД измеряли путем подсчета дыхательных движений животных до введения препарата, а также на 15-й и 29-й дни. Результаты статистической обработки приведены в таблице 5.
Из результатов статистической обработки следует, что у обезьян обеих групп фоновые значения ЧДД были выше, чем в последующие дни: динамика изменений была одинаковой. Достоверное отличие в первой группе, относительно исходных значений через 29 дней после введения объекта испытаний, обусловлено высокими фоновыми значениями у некоторых (2 из 6) животных. Достоверное отличие в фоновых значениях между группами обезьян также является следствием большой вариабельности ЧДД у обезьян 1 группы. Учитывая это, можно говорить о том, что препараты оказали соотносимое действие на показатель ЧДД у животных.
Влияние на показатели общего анализа мочи
Анализ проводили в динамике – до начала введения объектов, на 15-й и на 29-й дни. У всех животных на протяжении всего эксперимента моча была желтая и прозрачная. Основные результаты клинического анализа мочи представлены в таблице 6.
Таблица 6 – Динамика показателей общего анализа мочи, n=6
Гр. | Дата | Параметр | Показатели | |||||||
Плотность, г/мл | рН | UP, мг/дл | GLU, мл/дл | LEY, кл/мкл | BIL, мл/дл | UBG, мг/дл | KET, мг/дл | |||
GP40141 (группа 1) | Фон | Me (Q1; Q3) | 1 (1;1) | 8,0 (7,0; 8,6) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) |
15 дней | Me (Q1; Q3) | 1 (1;1) | 9,0 (8,9; 9,0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | |
29 дней | Me (Q1; Q3) | 1 (1;1) | 8,25 (7,5; 8,5) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | |
Критерий Фридмана, p | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | ||
Ромиплостим (группа 2) | Фон | Me (Q1; Q3) | 1 (1;1) | 8,0 (7,4; 9,0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) |
15 дней | Me (Q1; Q3) | 1 (1;1) | 8,5 (8,4; 9,0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | |
U-критерий, p 1 гр./2 гр. | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | ||
29 дней | Me (Q1; Q3) | 1 (1;1) | 8,25 (6,9; 8,6) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | 0 (0;0) | |
Критерий Фридмана, p | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | ||
U-критерий, p 1 гр./2 гр. | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | >0,05 | ||
Примечание: Me – медиана; Q1 – 1 квартиль; Q3 тест – 3 квартиль; U-критерий – U-критерий Манна-Уитни; TP – Общий белок; GLU – глюкоза; LEY – лейкоциты; BIL – билирубин; UBG – уробилиноген; KET – кетоновые тела.
В таблице 7 отдельно представлены результаты по показателям эритроцитов в моче животных. Это связано с тем, что на протяжении эксперимента у некоторых животных было зафиксировано количество эритроцитов, равное 5–10 клеток/мкл. Для сравнения был применен точный критерий Фишера. По результатам сравнения было выявлено, что отличий в динамике групп или между группами на схожих временных точках не отмечалось.
Таблица 7 – Частота проявления эритроцитов в моче (5–10 клеток/мкл), по результатам общего анализа мочи, n=6
День измерений | GP40141 (группа 1) | Ромиплостим (группа 2) | Точный критерий Фишера (межгрупповой анализ), p |
Фон | 1/6 | 1/6 | >0,05 |
15 сутки | 1 | 1/6 | >0,05 |
29 сутки | 1 | 1 | >0,05 |
Точный критерий Фишера (внутригрупповой анализ), фон/15 сутки, p | >0,05 | >0,05 | – |
Точный критерий Фишера (внутригрупповой анализ), фон/29 сутки, p | >0,05 | >0,05 | – |
Также на протяжении всего эксперимента показатели мочи не выходили за пределы внутрилабораторных норм (табл. 8). Все это позволяет заключить, что исследуемые препараты не повлияли на показали мочи животных.
Таблица 8 – Внутрилабораторные нормы для показателей общего анализа мочи
Показатель, единица измерений | Диапазон значений |
Удельный вес (плотность), г/мл | 1,0–1,030 |
Водородный показатель (рН) | 5–9 |
Общий белок (TP), мг/дл | 0–15 |
Глюкоза (GLU), мл/дл | 0–40 |
Эритроциты (ERY), кл/мкл | 0–10 |
Лейкоциты (LEY), кл/мкл | 0–20 |
Билирубин (BIL), мл/дл | 0–0,5 |
Уробилиноген (UBG), мг/дл | 0–1,8 |
Кетоновые тела (KET), мг/дл | 0–50 |
Влияние на показатели клинического анализа крови
Анализ проводили в динамике – до начала введения объектов, на 15-й и на 29-й дни. Результаты клинического анализа представлены в таблицах 9 и 10. Данные показателей клинического анализа крови, по которым наблюдались межгрупповые отличия, представлены на рисунке 3.
Таблица 9 – Гематологические показатели экспериментальных животных по группам, n=6
Гр. | Дата | Параметр | Показатели | |||||||||
RBC, 1012/л | MCV, фл | Hgb, г/л | MCH, пг | MCHC, г/л | Hct, % | Plt, ×109 /л | PCT, % | MPV, фл | PDW, % | |||
GP40141 (группа 1) | Фон | Mean±SD | 6,6±0,56 | 63,7±4,55 | 126±4,4 | 19,3±1,70 | 303±6,9 | 41,5±1,24 | 309±68,0 | 0,2±0,04 | 8,0±0,75 | 16,5±0,36 |
15 дней | Mean±SD | 6,1±0,62 | 63,8±4,86 | 115±2,1 | 18,9±1,73 | 297±7,7 | 38,7±1,57 | 757±183,2 | 0,5±0,09 | 7,0±0,66 | 17,8±0,74 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,24 | 0,97 | 0,0003 | 0,71 | 0,21 | 0,006 | 0,0002 | <0,0001 | 0,03 | 0,003 | ||
29 дней | Mean±SD | 5,8±0,28 | 62,7±4,83 | 109±7,0 | 19,0±1,70 | 303±7,1 | 36,2±2,06 | 717±153,6 | 0,5±0,07 | 6,4±0,66 | 17,3±0,72 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,01 | 0,74 | 0,0007 | 0,73 | 0,84 | 0,0003 | 0,0001 | 0,0001 | 0,002 | 0,04 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,25 | 0,77 | 0,10 | 0,97 | 0,29 | 0,04 | 0,68 | 0,16 | 0,13 | 0,25 | ||
Ромиплостим (группа 2) | Фон | Mean±SD | 6,6±0,53 | 63,2±2,45 | 123±4,4 | 18,8±1,02 | 298±6,7 | 41,4±2,24 | 308±99,5 | 0,2±0,06 | 7,7±0,75 | 16,9±0,93 |
15 дней | Mean±SD | 6,4±0,57 | 63,0±2,93 | 120±7,6 | 18,7±1,22 | 297±8,5 | 40,4±2,91 | 818±249,5 | 0,6±0,16 | 7,0±0,39 | 17,8±0,85 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,65 | 0,93 | 0,35 | 0,90 | 0,82 | 0,51 | 0,0009 | 0,0006 | 0,09 | 0,11 | ||
Т-тест, р, гр.1/гр.2 | 0,41 | 0,82 | 0,18 | 0,79 | 0,86 | 0,24 | 0,64 | 0,54 | 0,96 | 0,94 | ||
29 дней | Mean±SD | 5,6±0,48 | 62,3±2,71 | 105±5,3 | 18,7±1,24 | 300±10,5 | 35,0±2,62 | 661±194,3 | 0,5±0,12 | 7,0±0,42 | 17,5±0,98 | |
Т-тест, p Фон/ 29 дней | 0,009 | 0,56 | <0,0001 | 0,92 | 0,66 | 0,001 | 0,003 | 0,002 | 0,08 | 0,34 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,03 | 0,66 | 0,003 | 0,98 | 0,56 | 0,007 | 0,25 | 0,19 | 0,89 | 0,52 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,50 | 0,84 | 0,22 | 0,78 | 0,66 | 0,39 | 0,59 | 0,91 | 0,08 | 0,69 | ||
Примечание: Mean – среднее статистическое; SD – стандартное отклонение; Т-тест – t-критерий Стьюдента; RBC – количество эритроцитов; MCV – средний объём эритроцитов; Hgb – гемоглобин; MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците; MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците; Hct– гематокрит; Plt– количество тромбоцитов; PCT– тромбокрит; MPV – средний объем тромбоцитов; PDW– относительная ширина распределения тромбоцитов по объему.
Таблица 10 – Лейкоцитарная формула экспериментальных животных по группам, n=6
Гр | Дата | Параметр | WBC, ×109 /л | MON, % | LYM, % | NE, % | EO, % | BA, % |
GP40141 (группа 1) | Фон | Mean±SD | 9,5±2,91 | 4,2±1,13 | 34,4±6,42 | 59,0±6,89 | 1,9±1,38 | 0,6±0,41 |
15 дней | Mean±SD | 11,0±2,53 | 4,4±0,83 | 33,7±6,00 | 59,0±6,66 | 2,4±1,41 | 0,6±0,27 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,34 | 0,82 | 0,85 | 0,98 | 0,59 | 1,00 | ||
29 дней | Mean±SD | 11,8±2,65 | 4,7±1,84 | 30,1±5,87 | 63,0±4,33 | 1,4±0,67 | 0,8±0,32 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,17 | 0,57 | 0,25 | 0,25 | 0,47 | 0,41 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,60 | 0,65 | 0,32 | 0,25 | 0,18 | 0,31 | ||
Ромиплостим (группа 2) | Фон | Mean±SD | 9,2±1,73 | 4,2±1,06 | 35,4±8,41 | 58,0±7,60 | 1,6±1,28 | 0,8±0,27 |
15 дней | Mean±SD | 11,3±2,25 | 3,9±0,99 | 32,1±10,08 | 61,9±11,38 | 1,5±0,96 | 0,6±0,37 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,10 | 0,62 | 0,55 | 0,50 | 0,88 | 0,39 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,87 | 0,43 | 0,75 | 0,61 | 0,26 | 0,93 | ||
29 дней | Mean±SD | 14,2±5,53 | 5,2±1,47 | 24,5±14,08 | 67,4±15,58 | 2,0±2,87 | 0,9±0,29 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,06 | 0,21 | 0,13 | 0,21 | 0,75 | 0,43 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,26 | 0,11 | 0,31 | 0,50 | 0,68 | 0,15 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,37 | 0,64 | 0,39 | 0,52 | 0,63 | 0,58 |
Примечание: Mean – среднее статистическое; SD – стандартное отклонение; Т-тест – t-критерий Стьюдента; WBC – лейкоциты; MON – моноциты; LYM – лимфоциты; NE – нейтрофилы; EO – эозинофилы; BA – базофилы.
Ни по одному показателю клинического анализа крови группы не различались между собой. Однако при анализе различий динамики внутри групп наблюдалось увеличение количества тромбоцитов (Plt), тромбокрита (PCT), а также снижение количества эритроцитов (RBC), уровня гемоглобина (Hgb) и гематокрита (Hct) в обеих группах. В первой группе эти показатели значимо отличались в 15-й и 29-й день от фона (p <0,05), в группе 2 они отличались в 29-й день относительно фона и 15-го дня (p <0,05). Также отмечалось увеличение индекса распределения тромбоцитов (PDW) в группе 1 и аналогичная тенденция в группе 2, а также снижение среднего объема тромбоцитов (MPV) внутри групп на 15-й и 29-й дни относительно исходных значений (Рис. 6). Так как данные показатели имели аналогичную динамику (относительно исходных значений) в группах, получавших GP40141 и ромиплостим, с высокой степенью вероятности, можно утверждать, что они оказывали сопоставимые эффекты на гематологические показатели. Подобные изменения отмечались при исследованиях оригинального препарата и, наиболее вероятно, связаны с его первичной фармакодинамикой18,19.
Влияние на показатели биохимического анализа крови
Анализ проводили в динамике – до начала введения объектов, на 15-й и на 29-й дни. Данные показателей биохимического анализа крови по всем показателям представлены в таблицах 11 и 12, а показатели, по которым наблюдались межгрупповые отличия, представлены на рисунке 4.
Таблица 11 – Биохимические параметры крови животных (часть 1), n=6
Гр. | Дата | Параметр | Показатели | |||||||
GLU ммоль/л | ALP Ед/л | ALT Ед/л | AST Ед/л | КдР | LDH Ед/л | TB ммоль/л | UREA ммоль/л | |||
GP40141 (группа 1) | Фон | Mean±SD | 4,0±0,96 | 1064±322,3 | 26,7±5,99 | 37,0±8,85 | 0,8±0,29 | 579±197,3 | 4,7±1,30 | 6,1±0,37 |
15 дней | Mean±SD | 4,3±0,55 | 1238±141,3 | 31,2±4,49 | 45,7±12,31 | 0,7±0,16 | 651±165,2 | 7,5±2,99 | 6,2±0,37 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,54 | 0,053 | 0,17 | 0,19 | 0,90 | 0,51 | 0,06 | 0,60 | ||
29 дней | Mean±SD | 4,5±1,64 | 1142±365,3 | 28,5±5,82 | 41,2±16,74 | 0,8±0,19 | 543±314,0 | 4,6±1,93 | 6,2±0,57 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,48 | 0,71 | 0,60 | 0,60 | 1,00 | 0,82 | 0,96 | 0,68 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,70 | 0,15 | 0,40 | 0,61 | 0,87 | 0,47 | 0,07 | 1,00 | ||
Ромиплостим (группа 2) | Фон | Mean±SD | 5,7±1,29 | 1294±245,9 | 29,2±9,93 | 39,0±17,33 | 0,8±0,15 | 693±96,4 | 4,9±1,11 | 8,8±1,13 |
15 дней | Mean±SD | 4,0±1,39 | 1363±133,1 | 31,3±7,94 | 36,0±10,26 | 0,9±0,12 | 675±83,7 | 6,9±1,31 | 8,8±0,97 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,06 | 0,56 | 0,69 | 0,72 | 0,31 | 0,73 | 0,02 | 0,98 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,67 | 0,75 | 0,97 | 0,17 | 0,14 | 0,76 | 0,64 | 0,0001 | ||
29 дней | Mean±SD | 4,7±1,24 | 1322±159,0 | 35,5±12,60 | 37,5±15,14 | 1,0±0,23 | 699±141,5 | 5,1±1,35 | 9,0±1,16 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,22 | 0,82 | 0,36 | 0,88 | 0,08 | 0,93 | 0,73 | 0,77 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,37 | 0,64 | 0,51 | 0,84 | 0,23 | 0,72 | 0,04 | 0,77 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,85 | 0,29 | 0,24 | 0,70 | 0,06 | 0,29 | 0,61 | 0,0003 | ||
Примечание: Mean – среднее статистическое; SD – стандартное отклонение; Т-тест – t-критерий Стьюдента; GLU – глюкоза; ALP – щелочная фосфатаза; ALT – аланинаминотрансфераза; AST – аспартатаминотрансфераза; LDH – лактатдегидрогеназа; TB – общий белок; UREA – мочевина; КдР - коэффициент де Ритиса.
Таблица 12 – Биохимические параметры крови животных (часть 2), n=6
Гр. | Дата | Параметр | Показатели | ||||||||
CRE ммоль/л | CHOL ммоль/л | TG ммоль/л | TP г/л | ALB г/л | GLB г/л | ALB/ GLB | K+ ммоль/л | Na+ ммоль/л | |||
GP40141 (группа 1) | Фон | Mean±SD | 144±25,2 | 3,5±1,18 | 0,4±0,09 | 71,7±15,00 | 41,7±9,14 | 30,0±7,4 | 1,4±0,29 | 4,2±0,90 | 118±2,4 |
15 дней | Mean±SD | 164±18,9 | 3,9±0,81 | 0,5±0,23 | 79,2±11,58 | 49,2±3,87 | 30,0±12,8 | 2,1±1,41 | 5,2±0,86 | 115±2,7 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,16 | 0,47 | 0,18 | 0,36 | 0,09 | 1,00 | 0,26 | 0,07 | 0,07 | ||
29 дней | Mean±SD | 138±28,6 | 5,1±0,71 | 0,5±0,26 | 70,8±10,63 | 40,3±6,80 | 30,5±3,94 | 1,32±0,09 | 4,23±1,04 | 116±10,3 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,71 | 0,34 | 0,25 | 0,91 | 0,78 | 0,89 | 0,41 | 0,89 | 0,63 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,10 | 0,35 | 0,95 | 0,22 | 0,02 | 0,93 | 0,19 | 0,12 | 0,85 | ||
Ромиплостим (группа 2) | Фон | Mean±SD | 143±9,5 | 4,1±0,84 | 0,3±0,18 | 83,0±4,29 | 45,2±1,72 | 37,8±3,92 | 1,2±0,13 | 4,7±0,50 | 144±9,6 |
15 дней | Mean±SD | 148±16,6 | 4,6±1,02 | 0,5±0,14 | 84,5±5,28 | 47,3±3,67 | 37,2±5,42 | 1,3±0,29 | 5,2±0,71 | 150±5,1 | |
Т-тест, p Фон/15 дней | 0,54 | 0,42 | 0,11 | 0,60 | 0,22 | 0,81 | 0,45 | 0,15 | 0,22 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,14 | 0,23 | 0,92 | 0,33 | 0,42 | 0,23 | 0,19 | 0,91 | <0,0001 | ||
29 дней | Mean±SD | 140±9,3 | 3,9±0,38 | 0,4±0,32 | 84,5±5,54 | 46,5±3,83 | 38,0±3,95 | 1,2±0,17 | 4,9±0,55 | 148±4,1 | |
Т-тест, p Фон/29 дней | 0,59 | 0,61 | 0,70 | 0,61 | 0,46 | 0,94 | 0,73 | 0,40 | 0,39 | ||
Т-тест, p 15/29 дней | 0,33 | 0,17 | 0,49 | 1,00 | 0,71 | 0,77 | 0,62 | 0,46 | 0,47 | ||
Т-тест, р, гр. 1/гр. 2 | 0,93 | 0,35 | 0,55 | 0,02 | 0,08 | 0,01 | 0,31 | 0,17 | <0,0001 | ||
Примечание: Mean – среднее статистическое; SD – стандартное отклонение; Т-тест – t-критерий Стьюдента; CRE – креатинин; CHOL – холестерин; TG – триглицериды; TP – общий билирубин; ALB – альбумин; GLB – глобулин; ALB/ GLB – альбумин/глобулиновое соотношение.
Оценка внутригрупповой динамики показала только увеличение уровня билирубина на 15-й день, по сравнению с исходными значениями в обеих группах (p <0,05). При оценке межгрупповой динамики отмечалось, что на протяжении всего эксперимента группы 1 и 2 не различались между собой ни по одному показателю, кроме содержания мочевины и натрия в крови (p <0,05).
Влияние на свёртывающую систему крови
В динамике – на 0, 15 и 29-й дни – у экспериментальных животных производили забор крови для оценки параметров коагуляционного гемостаза. Данные полученных результатов представлены на рисунке 5.
Введение оригинального препарата ромиплостим и GP40141 не приводило к изменениям показателей коагуляционного гемостаза, не было выявлено достоверных отличий ни между группами обезьян, ни между фоновыми значениями и результатами на 15-й и 29-й день после введения объектов.
ОБСУЖДЕНИЕ
КЗЦ для оригинального препарата ромиплостим так же, как и для его аналога GP40141, не была отмечена для линии 32D hTPOR clone 63. Основной механизм действия ромиплостима связан с активацией сигнальных путей, которые способствуют жизнеспособности клеток, их росту, эндомитозу мегакариоцитов, созреванию мегакариоцитов и, что важно, продукции тромбоцитов [9]. Fc-область молекулы ромиплостим не связывается специфически с белками комплемента и соответственно не вызывает иммунной реакции.
Согласно результатам in vivo исследования оригинальный препарат ромиплостим и его биоаналог GP40141 можно считать сопоставимыми по профилю безопасности. За время исследования не было зафиксировано отклонений в клиническом статусе животных, летальность в группах также не отмечена. Масса тела и ЧДД имели схожую динамику на протяжении всего эксперимента. Также не отмечалось различий по показателям коагуляционного гемостаза и общего анализа мочи, динамика по данным показателям была аналогичной. Значения большинства показателей клинического анализа крови оставались стабильными по сравнению с исходными значениями. Исключением являлось увеличение количества тромбоцитов и тромбокрита, а также снижение уровня эритроцитов, гемоглобина и гематокрита, межгрупповых отличий, при этом, не отмечалось ни по одному из показателей. Анализ биохимических показателей крови выявил только увеличение уровня билирубина на 15-й день, по сравнению с исходными значениями в обеих группах, а при оценке межгрупповой динамики отмечалось, что на протяжении всего эксперимента группы 1 и 2 не различались между собой ни по одному показателю, кроме содержания мочевины и натрия в крови. Учитывая, что отличия наблюдались в каждой точке измерения (до введения, 15-й и 29-й день), при этом динамика показателей не отличалась между группами, можно сказать, что эти различия обусловлены не действием препаратов, а отображают изначальную разницу в группах. Все это указывает на то, что исследуемые препараты оказали сопоставимое влияние на биохимические показатели крови.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сравнение профилей безопасности для оригинального препарата ромиплостим и его биоаналога GP40141 как in vitro, так и in vivo, показало схожие результаты. Для in vitro в тесте КЗЦ препараты при добавлении комплемента показали пролиферативную активность, гибели клеток не наблюдалось. На основании данных, полученных в результате in vivo исследования, можно заключить, что GP40141 (объект испытаний) и ромиплостим (СО) переносились животными удовлетворительно, не было отмечено отклонений в потреблении пищи, не было зафиксировано отклонений в клиническом статусе и летальных случаев. Введение объекта испытаний и стандартного объекта не приводило к значительному изменению веса и температуры тела экспериментальных животных по сравнению с исходными значениями. Также не отмечалось отличий по показателям мочи и параметрам гемостаза на протяжении всего исследования. Выявленные изменения по гематологическим параметрам носили однонаправленный характер в обеих группах и были связаны с первичной фармакодинамикой GP40141 (объект испытаний) и ромиплостима (СО). Изменения в биохимических параметрах крови также носили однонаправленный характер в обеих группах. По результатам проведенного in vivo исследования можно заключить, что токсикологический профиль для препаратов схож и они являются сопоставимыми по профилю безопасности.
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА
Работа выполнена при финансовой поддержке ООО «ГЕРОФАРМ». Спонсор не оказывал влияние на выбор материала для публикации, анализ и интерпретацию данных.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Исследование in vitro и in vivo было организовано ЗАО «Фарм-Холдинг» входит в группу компаний ООО «ГЕРОФАРМ». In vitro исследование проводилось в ЗАО «Фарм-Холдинг» по договору финансирования ООО «ГЕРОФАРМ». In vivo исследование проводилось в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» по договору финансирования ООО «ГЕРОФАРМ». Производителем препарата GP40141 биоаналога ромиплостима является ООО «ГЕРОФАРМ».
ВКЛАД АВТОРОВ
А.Н. Афанасьева – написание и редактирование текста, анализ и интерпретация результатов исследования in vitro, проведение исследования in vitro; В.Б. Сапарова – разработка дизайна исследования in vitro, анализ и интерпретация результатов исследования in vitro, редактирование текста; Д.Д. Карал-Оглы – проведение исследования in vivo, редактирование текста; Е.И. Мухаметзянова – проведение исследования in vivo; Д.В. Куркин – интерпретация результатов исследования in vitro и in vivo, утверждение текста; А.В. Калатанова – разработка дизайна исследования in vivo, интерпретация результатов in vivo; И.Е. Макаренко – разработка дизайна исследования, критический пересмотр содержания статьи, утверждение окончательного варианта статьи для публикации; А.Л. Хохлов – интерпретация результатов исследования in vitro и in vivo, утверждение текста; И.А. Луговик – разработка дизайна исследования in vivo, написание и редактирование текста in vivo.
1 Государственный реестр Лекарственных средств Российской Федерации. Энплейт®. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=e7a25c3e-1caa-44c0-81fe-5967882a071a.
2 Государственный реестр Лекарственных средств Российской Федерации. Револейд®. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=e021350c-54ad-4b52-b1fe-28b4e4fd0f9e.
3 Решение ЕЭК от 03.11.2016 № 89 «Об утверждении правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза». 2016. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_207925/.
4 ГОСТ 33218-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за нечеловекообразными приматами, 2014.
5 ГОСТ 33215-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур, 2014.
6 СHMP assessment report for Nplate. Procedure No. EMEA/H/C/942. EMEA/654269/2008. 2022. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/nplate-epar-public-assessment-report_en.pdf.
7 Директива Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ%3AL%3A2010%3A276%3A0033%3A0079%3Aen%3APDF
8 Решение ЕЭК от 03.11.2016 № 89 «Об утверждении правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза».
9 Там же.
10 Product monograph including patient medication information Nplate® romiplostim for injection. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.amgen.ca/-/media/Themes/CorporateAffairs/amgen-ca/amgen-ca/documents/products/en/nplate_pm.pdf.
11 СHMP assessment report for Nplate. Procedure No. EMEA/H/C/942. EMEA/654269/2008, 2022.
12 Решение ЕЭК от 03.11.2016 № 89 «Об утверждении правил проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза».
13 Там же.
14 Там же.
15 СанПиН 2.1.4.1074-01. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://docs.cntd.ru/document/901798042
16 ГП 2.1.5.1315-03 Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-литьевого и культурно-бытового водопользования. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://files.stroyinf.ru/Data2/1/4294815/4294815336.pdf
17 ГН 2.1.5.2280-07 Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://pravo.gov.ru.
18 CHMP assessment report for Nplate. Procedure No. EMEA/H/C/942. EMEA/654269/2008.
19 Product monograph including patient medication information Nplate® romiplostim for injection.
Дополнительные файлы
