Синергическое действие препарата с координационным комплексом триметилгидразиния пропионата и этилметилгидроксипиридина сукцината на энергетический обмен и дыхание клетки

Полный текст

Список сокращений: ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат; ТМГП – триметилгидразиния пропионат; FCCP – карбонилцианид-n-трифторметокси-фенилгидразон; АТФ – аденозинтрифосфат; АТФ-азы – аденозинтрифосфатаза; АФК – активные формы кислорода; DAMPs – молекулярные паттерны клеточного повреждения; АДФ – аденозиндифосфат; НАДФ – никотинамидадениндинуклеотидфосфа́т; МРБ – митохондриальные разобщающие белки.

ВВЕДЕНИЕ

Патологические состояния, ассоциированные с дисциркуляторными расстройствами и ишемией тканей, являются самыми распространенными причинами смертности и первичной инвалидности населения. Согласно данным WHO Health Estimates¹, лидирующие позиции в списке ведущих неинфекционных заболеваний с высоким риском летального исхода занимают ишемическая болезнь сердца (терминально – инфаркт миокарда) и ишемический инсульт.

В основе патогенеза любого ишемического повреждения тканей лежит дисбаланс между метаболической активностью клеток, выражаемой в потреблении кислорода и субстратов биологического окисления, и адекватной доставкой необходимых питательных элементов [1].

Современные исследования показывают, что ключевым патогенетическим аспектом, определяющим выраженность данного дисбаланса, является нарушение функциональной активности митохондрий клетки. Митохондрии – двумембранные органеллы, выполняющие в клетках множество функций. Прежде всего, митохондриям отводится роль «энергетических станций», обеспечивающих оптимальный пул внутриклеточной энергии [2].

Также митохондрии, регулируют окислительно-восстановительные процессы и реакции апоптоза. В этой связи нарушение митохондриальной активности может привести к дефициту макроэргических соединений, повышению генерации активных форм кислорода (АФК) и программированной гибели клетки по апоптотическому пути [3]. Основным триггером, инициирующим данные процессы, является нехватка кислорода и субстратов окисления [4].

Окклюзия сосуда и последующая гипоксия вызывает ряд тяжелых биохимических и метаболических нарушений, опосредующих сбой функциональной активности митохондрий. Метаболизм клеток переключается с митохондриального окислительного фосфорилирования на анаэробный гликолиз, что приводит к внутриклеточному накоплению лактата и протонов, снижая рН с дальнейшей активацией аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы), прежде всего отвечающей за Na⁺/H⁺ обменник. Однако, в силу быстрого истощения энергоресурсов в виде АТФ, возникает перегрузка клетки ионами натрия и, впоследствие, кальция (в условиях натриевой перегрузки активируется Na⁺/Ca²⁺ АТФ-аза) [5].

Высокое внутриклеточное содержание кальция в ишемизированной клетке нарушает буферную емкость митохондрий, в связи с чем активируется поступление ионов кальция в митохондриальный матрикс. [6]. Поступившие внутрь митохондрий ионы кальция вызывают дисфункцию дыхательной цепи, способствуя гиперпродукции активных форм кислорода и активации механизма гибели клетки (некроз, апоптоз). Также в результате поступления ионов кальция митохондрии «набухают» (феномен митохондриального блеббинга) и разрушаются, высвобождая в цитозоль соединения, усиливающие степень клеточного повреждения [7].

Прежде всего, данные вещества представлены молекулярными паттернами клеточного повреждения (DAMPs), которые активируют путь AGE/RAGE, усиливая иммунологическую реактивность в очаге ишемии [8].

Учитывая особенности описанных выше патогенетических путей ишемического повреждения клеток и центральную роль митохондрий в данных процессах, неудивительно, что именно «энергетические станции» клеток стали главной мишенью для направленной цитопротекции. С целью коррекции митохондриальной дисфункции при ишемии, в настоящий момент применяется ряд химически модифицированных веществ со скаффолдом бенз-γ-пирона, убихинона и трифенилфосфониевым линкером [9], а также вещества, имеющие белковую природу, примером которых могут служить пептиды группы Szeto-Schiller (SS-31) [9, 10]. Однако ряд исследований показывает, что нативные, не подвергшиеся модификации молекулы, могут выступать в качестве средств коррекции митохондриальной дисфункции. Например, сукцинат и его производные [11] или средства, шунтирующие метаболические процессы (триметилгидразиния пропионат, триметазидин) могут препятствовать необратимому повреждению митохондрий клетки [12, 13].

В Российской Федерации в 2022 г. зарегистрирован новый лекарственный препарат из группы нейропротекторов и антиоксидантов – Брейнмакс®, представляющий оригинальный комплекс этилметилгидроксипиридина сукцината (ЭМГПС) и триметилгидразиния пропионата (ТМГП) в виде раствора для внутривенных и внутримышечных инъекций или капсул. Обычно триметилгидразиния пропионат существует в виде цвиттер-иона (дигидрата), имеющего положительный заряд на гидразиновом фрагменте и отрицательный на карбоксилатной группе [14]. В литературе описано, что соли некоторых многоосновных кислот (кислые соли фумаровой и малеиновой кислот, дигидрофосфат, кислая соль щавелевой кислоты, моно- или дизамещенная соль слизевой кислоты, соли памоевой и оротовой кислот) с триметилгидразиния пропионатом демонстрировали особые фармакокинетические и фармакодинамические свойства [15]. Особенностью рассматриваемого лекарственного препарата является образование в процессе приготовления готовой лекарственной формы гидросукцинатного комплекса с триметилгидразинием. Компоненты комплекса связаны между собой водородными связями и электростатическим межмолекулярным взаимодействием, что обеспечивает выгодную конформацию фармакофорных фрагментов для лучшего связывания с рецепторами и более выраженного действия. При этом важно, что компоненты комплекса имеют разные точки приложения действия, в результате чего при их комбинированном применении возможно развитие синергетического эффекта.

ЦЕЛЬ. Оценка митохондриально-направленного действия компонентов гидросукцинатного комплекса с триметилгидразинием, входящего в состав нового лекарственного препарата Брейнмакс®.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

В исследование было включено 50 самцов мышей CBA×B6 возрастом 4–5 мес, полученных из центра генетических ресурсов лабораторных животных ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук». При работе соблюдались требования Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 24.06.1998 г., правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и ГОСТ Р 53434-2009), директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС), правил Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.) и Правил лaбoрaтoрнoй прaктики, принятых в Российской Федерации (приказ MЗ РФ № 708 oт 29.08.2010 г.). Протокол исследования прошел экспертизу в комиссии по биоэтике ООО «Научно-исследовательский институт митоинженерии МГУ» (заключение № 171 от 13.01.2022).

Дизайн исследования

Исследование проводили на изолированных митохондриях печени мыши. Оценивали: потенциал митохондрий, скорость генерации перекиси водорода, скорость дыхания: а) нестимулированного малатом и пируватом, б) стимулированного малатом и пируватом (субстраты комплекса I), сукцинатом (субстрат комплекса II), в) на фоне блокады начального участка электрон-транспортной цепи ротеноном, г) при блокаде фосфорилирования олигомицином, д) на фоне вызванного карбонилцианид-n-трифторметокси-фенилгидразоном (FCCP) разобщения и е) при заблокированном цианидом комплексе IV (цитохром С оксидазе).

Для каждого из показателей в трех экспериментах регистрировали: 1) реакцию на мельдоний, 2) реакцию на ЭМГПС и 3) реакцию на янтарнокислый координационный комплекс триметилгидразиния пропионата и ЭМГПС. Для каждого из опытов проводили 7 независимых повторов эксперимента.

Выделение митохондрий печени

Для получения печени мышей подвергали эвтаназии путем цервикальной дислокации, после немедленно вскрывали брюшную полость животных и иссекали печень. Печень помещали в ледяной фосфатно-солевой буфер (рН=7,0) и хранили на льду до выделения митохондрий, но не дольше 3 мин.

После гомогенизации в приблизительно 20 объемах изотонического раствора суспензию ткани печени переносили в пробирки и осаждали остатки неразрушенных тканей центрифугированием при 1000 g и 4°C в течение 10 мин. Супернатант собирали, избегая попадания в пипетку молочно-белой суспензии, на поверхности и центрифугировали при 14 000 g и 4°C в течение 10 мин. Полученный темный осадок митохондрий отмывали от верхнего светлого рыхлого слоя, собирая последний пипеткой и промывая митохондрии буфером следующего состава: 250 мМ сахароза, 20 мМ Hepes/NaOH, pH 7,5, 0,5 mm EGTA, 0,1% BSA. Осадок суспендировали в 0,5 мл данного буфера и осторожно гомогенизировали 5–10 проходами тефлонового пестика в стеклянном гомогенизаторе на 1 мл (G-Biosciences, США). Гомогенат количественно переносили в новую пробирку и осаждали митохондрии центрифугированием при 12 000 g и 4°C в течение 10 мин. Осадок суспендировали на льду в 70–100 мкл буфера для выделения при помощи пластикового пестика до получения гомогенной суспензии.

Измерение дыхательной функции митохондрий

Аликвоту полученного препарата митохондрий в количестве 50 мкг по белку, определенному по методу с бицинхониновой кислотой (Pierce, США), использовали для определения скорости дыхания, интенсивности окислительного фосфорилирования, степени сопряженности и кальциевой нагрузки митохондрий. Для определения скорости дыхания использовали метод прямой регистрации поглощения кислорода при помощи высокочувствительного оксиграфа (Hansatech, Англия). Для этого аликвоту митохондрий помещали в стеклянную кювету, заполненную 0,5 мл буфера, содержащего: 120 мМ сахарозы, 75мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 5 мМ KH₂PO₄, 20 мМ HEPES, pH=7,5 (титрование NaOH). Измерение потребления кислорода проводили в закрытой системе при 37°С и постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 500 об/мин.

Полученные величины (изменение O₂ во времени, dO₂ /dt) нормировали на содержание белка. Энергизацию митохондрий осуществляли при помощи субстратов I и II комплексов дыхательной цепи. После регистрации скорости дыхания, активированного добавлением в систему 4 мМ пирувата в присутствии 1 мМ малата, исследовали действие ротенона (2 мкМ), блокирующего I комплекс. Для регистрации скорости дыхания митохондрий с активированным комплексом II после добавления ротенона в систему измерения вносили 10 мМ сукцината калия.

Исследование степени сопряженности полученных препаратов проводили в присутствии аденозиндифосфата (АДФ) после стимуляции дыхания путем внесения 0,1 мМ АДФ в систему 1 мкг олигомицина и регистрировали ингибирование стимулированного дыхания. Отношение скоростей стимулированного и нестимулированного дыхания использовали как характеристическую величину (коэффициент дыхательного контроля), позволяющую оценить качество полученного препарата митохондрий и их состояние в исследуемых тканях. Максимальную скорость разобщенного дыхания определяли в присутствии 20–50 нМ протонофора FCCP. При анализе скоростей дыхания из всех значений вычитали величину, соответствующую скорости потребления кислорода в присутствии 0,5 мМ KCN.

Измерение трансмембранного потенциала митохондрий

Для всех полученных препаратов исследовали способность митохондрий к образованию трансмембранного потенциала, величину которого оценивали при помощи измерения отношения поглощения красителя сафранина О при длинах волн 555/523 нм по методу Викстрема [16]. Для этого в микрокювету объемом 250 мкл вносили 25 мкг белка митохондрий и в двухволновом режиме на спектрофотометре Aminco DW2000 (Olis Inc., США) производили регистрацию кинетики изменения соотношения 555/523 нм до и после добавления субстратов дыхания и специфических ингибиторов переноса электрона в дыхательной цепи митохондрий, таких как ротенон, антимицин, малонат и миксотиазол. Диссипация трансмембранного потенциала достигали при помощи FCCP.

Измерение кальциевой емкости

Кальциевую емкость митохондрий определяли методом титрования при измерении светорассеяния на 575 нм, спектрофотометрически на Cary Varian 300 (Agilent, США) и в среде 250 мМ сахарозы, 2 мМ MgCl₂, 5 мМ KH₂PO₄, 20 мМ HEPES, pH=7,4 (титрование NaOH). При этом исследовали как общее количество кальция, индуцирующего падение поглощения, соответствующее максимальному набуханию митохондрий в изоосмотической системе (кальциевой емкости), так и кинетику набухания, характеризующую способность митохондрий к транспорту кальция.

Оценка синтеза АТФ

Уровень синтеза аденозинтрифосфата (АТФ) определяли по АТФ-зависимой люминесценции суспензии митохондрий в различных состояниях, при энергизации субстратами различных комплексов дыхательной цепи. Поскольку уровень продукции АТФ митохондриями при аэробном окислении субстратов определяется активностью АТФ-синтетазы, чувствительной к олигомицину, применение этого ингибитора позволяет рассчитать общее максимальное количество синтезированного в митохондриях АТФ, характеризуя, таким образом, различия в возможностях митохондрий поддерживать энергетический метаболизм.

Измерение генерации перекиси водорода

Генерацию перекиси водорода митохондриями оценивали, используя пероксидазу хрена (Thermo Scientific, США) и её флюорогенный субстрат Amplex Red reagent (Thermo Scientific, США), на флюоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Agilent, США) в присутствии ингибитора каталазы специфическим ингибитором 3-амино-1,2,4-триазолом.

Статистический анализ данных

Для первичного анализа данные табулировали и рассчитывали показатели описательной статистики: среднее (M), стандартное отклонение (SD), стандартную ошибку среднего (SEM). Полученные данные подчинялись закону распределения Гаусса, на основании чего были выбраны параметрические методы статистической обработки. Статистический анализ данных проводили с использованием методов нелинейной регрессии, теста Стьюдента для сравнения и однофакторного дисперсионного анализа (для сравнения нескольких выборок). Различия считали значимыми при р <0,05. Для анализа данных использовали программное обеспечение Microsoft Excel 2016 (Microsoft, США) и Prism 5.0 (Graphpad, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Измерение трансмембранного потенциала митохондрий

При оценке влияния исследуемых препаратов на показатели трансмембранного потенциала митохондрий, было показано, что при добавлении возрастающих концентраций препаратов он снижался. Наименее выраженное влияние оказывал мельдоний, для которого величина полуэффективной концентрации (IC₅₀) составляла 419±17 µM. ЭМГПС оказывал значимо (F (1,22) = 82,90; p <0,0001) более выраженное влияние на потенциал (IC₅₀=275±6 µМ).

Комплекс компонентов триметилгидразиния пропионата и ЭМГПС снижал потенциал митохондрий до IC₅₀=197±5 µM, что значимо меньше по сравнению только с мельдонием (F (1,15) = 166,5; p <0,0001) или только с ЭМГПС (F (1,22) = 107,5; p <0,0001). При добавлении разобщителя FCCP, потенциал митохондрий снижался до нуля вне зависимости от наличия в инкубационной смеси мельдония, ЭМГПС или изучаемого комплекса (Рис. 1).

 

Рисунок 1 – Зависимость мембранного потенциала митохондрий от дозы мельдония, ЭМГПС или комплекса триметилгидразиния пропионата и ЭМГПС (Комплекс I)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями – логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Дыхание митохондрий

Фоновое дыхание митохондрий, в отсутствие экзогенных субстратов дыхания не изменялось при добавлении возрастающих концентраций мельдония. ЭМГПС также несущественно увеличивал скорость базального дыхания митохондрий с 2,2±0,2 до 3,4±0,25 нмоль О₂/мин/мг белка (F (1,47) = 4,34; p = 0,0426), а при добавлении комплекса компонентов скорость базального дыхания увеличивалась с 2,9±0,3 до 6,8±1,0 нмоль О₂/мин/мг белка (F (1,40) = 28,95; p <0,0001), что может свидетельствовать о разобщающем дыхание митохондрий действии комплекса ТМГП и ЭМГПС (Рис. 2). Такой эффект позволяет протонам транслоцироваться в межмембранное пространство посредством специфических респираторных комплексов электронно-транспортной цепи и возвращаться в митохондриальный матрикс независимо от АТФ-синтазы. Установленное протонное «протекание» является важным механизмом распределения энергии в клетке и составляет до 25% основного обмена. Разобщение митохондрий на фоне действия компонентов исследуемого комплекса может рассматриваться как цитопротекторная стратегия, опосредованная митохондриальными разобщающими белками (МРБ), в условиях оксидативного стресса при любом ишемическом повреждении, включая процессы старения, а также диабет и резистентность к противоопухолевым препаратам.

 

Рисунок 2 – Скорость базального дыхания (без добавления экзогенных субстратов) митохондрий печени мыши в присутствии мельдония, ЭМГПС или комплекса компонентов (Комплекс I)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — линейная регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат

 

Затем исследовали дыхание митохондрий, стимулированное субстратами комплекса I (НАДФ-коэнзим Q-оксидоредуктазы), пирувата и малата (Рис. 3). Было обнаружено повышение скорости, стимулированного субстратами комплекса I, дыхания при повышении в ячейке концентрации янтарнокислого комплекса ТМГП и ЭМГПС. Полуэффективные концентрации мельдония и ЭМГПС составили 273±67 и 350±204 µМ, соответственно, и значимо не различались (F (1,90) = 0,21; p = 0,6470). Добавление исследуемого комплекса приводило к более выраженному росту потребления кислорода (IC₅₀=75±6 µМ), что значимо меньше по сравнению с мельдонием (F (1,83) = 34,37; p <0,0001) и ЭМГПС (F (1,83) = 30,17; p <0,0001).

 

Рисунок 3 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 5 мМ пирувата и 1 мМ малата, в присутствии мельдония, ЭМГПС или комплекса компонентов (Комплекс I)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат;

 

После добавления ингибитора комплекса ротенона (2 µМ), скорость стимулированного пируватом и малатом дыхания митохондрий снижалась практически до нуля и не изменялась в зависимости от концентрации мельдония, ЭМГПС или изучаемого комплекса (Рис. 4).

 

Рисунок 4 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 5 мМ пирувата и 1 мМ малата, в присутствии мельдония, ЭМГПС или комплекса компонентов (Комплекс I) и ингибитора комплекса I ротенона (2 µМ)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями – линейная регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Сукцинат является субстратом комплекса II электрон-транспортной цепи, таким образом, в присутствии ротенона стимулированное сукцинатом дыхание позволяет оценить состояние комплексов II, III и IV электрон-транспортной цепи митохондрий. Как показано на рисунке 5, действие исследуемого комплекса на скорость потребления кислорода при поддерживаемом субстратом второго комплекса электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) дыхании было сходно. Полуэффективная концентрация для этих двух веществ составляла 237±81 µМ и 453±1059 µМ и значимо не различалась (F (1,90) = 0,20; p = 0,6596). Эквимолярная смесь компонентов в комплексе стимулировала дыхание с IC₅₀ = 141±27 µМ. Различия с мельдонием (F (1,83) = 3,55; p = 0,0632) и ЭМГПС (F (1,83) = 3,90; p = 0,0516) приближались к уровню статистической значимости.

 

Рисунок 5 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 1 мМ сукцината, в присутствии мельдония, ЭМГПС или изучаемого комплекса (Комплекс I) и ингибитора комплекса I ротенона (2 µМ)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Для оценки сопряженности митохондрий измеряли скорость дыхания в присутствии избытка АДФ и фосфата (Рис. 6), а затем — в присутствии 1 µM олигомицина, ингибитора АТФ-синтазы (Рис. 7). Было установлено, что в присутствии избытка АДФ мельдоний и ЭМГПС не оказывали влияния на скорость дыхания, ни сами по себе, ни в комплексе. На фоне блокады АТФ-синтазы олигомицином мельдоний, ЭМГПС и янтарно-кислый комплекс с триметилгидразинием повышали скорость дыхания с IC₅₀=380±699, 536±1578 и 165±40 µM. Существенные по величине различия IC₅₀ не достигали статистической значимости.

 

Рисунок 6 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 1 мМ АДФ, в присутствии мельдония, ЭМГПС или комплекса с триметилгидразинием (Комплекс I)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Рисунок 7 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 1 мМ АДФ, в присутствии мельдония, ЭМГПС или рассматриваемого комплекса (Комплекс I) и блокатора АТФ-синтазы олигомицина (1 µM)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Скорость разобщенного FCCP дыхания при добавлении мельдония, ЭМГПС или рассматриваемого комплекса не изменялась (Рис. 8).

 

Рисунок 8 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 1 мМ АДФ, в присутствии мельдония, ЭМГПС или рассматриваемого комплекса (Комплекс I) и протонофора FCCP (1 µM)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Наконец, скорость дыхания при угнетении цианидом цитохром C оксидазы при добавлении мельдония, ЭМГПС или комплекса компонентов не изменялась (Рис. 9).

 

Рисунок 9 – Скорость дыхания митохондрий печени мыши, стимулированного 1 мМ АДФ, в присутствии мельдония, ЭМГПС или изучаемого комплекса (Комплекс I) и цианида (1 µM)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Таким образом, данные по влиянию изучаемого комплекса на дыхание митохондрий свидетельствуют о восстановлении обмена кислорода в клетках для обеспечения нормальной жизнедеятельности и модуляциию клеточного метаболизма в условиях кардиоваскулярных рисков.

Оценка синтеза АТФ

По результатам проведеного эксперимента, было установлено, что мельдоний, ЭПГМС и янтарно-кислый координационный комплекс с триметилгидразинием оказывают выраженное влияние на продукцию митохондриями АТФ (Рис. 10). Так, наименее выраженное влияние на скорость продукции АТФ оказывал ЭМГПС, для которого концентрация полумаксимального ингибирования составляла 321±168 µМ. Полумаксимальное снижение продукции АТФ при добавлении мельдония наблюдалось при концентрации вещества 216±6 µМ. Наиболее выраженное снижение продукции АТФ наблюдалось при добавлении координационного комплекса ТМГП и ЭМГПС с IC₅₀=136±4 µМ.

 

Рисунок 10 – Скорость синтеза АТФ митохондриями печени мыши в присутствии мельдония, ЭМГПС или изучаемого комплекса (Комплекс I)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (m±sem), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

Скорость продукции перекиси

Скорость продукции перекиси оценивали флюорометрически. Как показано на рисунке 11, ТМГП, ЭМГПС и изучаемый комплекс снижали продукцию изолированными митохондриями перекиси водорода. Наименьшее влияние на генерацию перекиси проявлял ЭМГПС (EC₅₀=186±6 µM), что значимо меньше, чем у мельдония (IC₅₀=153±11 µM, F (1,113) = 16,36; p <0,0001). Наибольшее подавление продукции перекиси наблюдалось при добавлении к изолированным митохондриям печени мыши комплекса ТМГП и ЭМГПС (IC₅₀=96±10 µM), что значимо меньше, чем для мельдония (F(1,92)=68,94, p <0,0001) или для только ЭМГПС (F(1,99)=310,2, p <0,0001). Данные результаты свидетельствуют о выраженном снижении выработки реактивных форм кислорода и антиоксидантном действии рассматриваемого комплекса, что определяет его протективное воздействие на клетки в условиях ишемии и гипоксии.

 

Рисунок 11 – Скорость продукции H₂O₂ митохондрий печени мыши в присутствии мельдония, ЭМГПС или комплекса ЭМГПС с триметилгидразинием (Комплекс I)

Примечание: точками показаны экспериментальные данные (M±SEM), линиями — логистическая регрессия; ЭМГПС – этилметилгидроксипириднна сукцинат.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Средства метаболической терапии находят все большее применение в практической медицине. Одними из представителей данной фармакотерапевтической группы являются широко известные на отечественном фармацевтическом рынке триметилгидразиния пропионат и этилметилгидроксипиридина сукцинат. Мельдоний является средством, позволяющим «шунтировать» биоэнергетические процессы, переключая клетку на более энергетически выгодный режим функционирования. Как правило, это отражается в снижении интенсивности реакций β-окисления жирных кислот и преобладании реакций углеводного обмена в энергопродукции. Важно, что мельдоний оказывает селективное действие именно на ишемизированную ткань, практически не влияя на интактные тканевые участки, что дает возможность избегать эффекта «обкрадывания» [17].

Действие этилметилгидроксипиридина сукцината направлено, прежде всего, на подавление процессов перекисного окисления липидов и снижение общего пула АФК в клетке, а также стимулирование выработки энергии. Применение ЭМГПС ограничивает продукцию реактивных форм кислорода и азота, устраняет негативные эндотелиальные эффекты в виде повышения активности индуцибельной синтазы оксида азота, повышает активность ферментов эндогенной антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы). Наличие в структуре молекулы сукцинатного фрагмента позволяет данному соединению выступать не только в роли антиоксидантного средства, но и в качестве непосредственного субстрата митохондриального комплекса II, что, учитывая высокую биодоступность, может способствовать высокой метаболической активности. Вариабельность таргетного воздействия ТМГП и ЭМГПС, может лежать в основе их синергизма по отношению к энергопродуцирующей функции клеток. В настоящий момент на отечественном фармацевтическом рынке представлен нейро- и цитопротектор на основе координационного комплекса триметилгидразиния пропионата и этилметилгидроксипиридина сукцината – Брейнмакс® – оказывающий антиамнестический, противогипоксический, антиоксидантный и противоишемический эффекты [18].

В этой связи было проведено исследование, посвященное изучению митохондриально-направленного действия рассматриваемого комплекса. В итоге было показано, что в культуре митохондрий, соединения с рК около 4 (комплекс триметилгидразиния пропионата и этилметилгидроксипиридина сукцинат) действуют как умеренные разобщители митохондриального дыхания. Данный факт может быть связан с наличием в структуре данных соединений положительно заряженного атома третичного азота (триметилгидразиний) и гетероциклического азота (этилметилгидроксипиридина сукцинат), в связи с чем можно предполагать формирование ионных пар между данными соединениями при физиологических условиях и соответствующем значении рН. Интересно, что закрытый метильными группами азот с положительным зарядом может играть роль проникающего катиона и при образовании ионной пары повышать эффективность доставки противоиона (в данном случае сукцината), в том числе и с последующей диссоциацией протона. Таким образом, рассматриваемый координационный комплекс может являться донором дополнительных протонов (протонофором), так необходимых для обеспечения функционирования дыхательной цепи.

Использование разобщителей дыхания (исследуемый комплекс), умеренно увеличивающих протонную проводимость митохондрий, способно элиминировать негативные эффекты, вызванные повышением генерации АФК митохондриями [19].

Данное предположение подтверждается, во-первых, активацией утилизации эндогенных субстратов (пирувата и малата), но в значительно большей степени — при совместном действии исследуемых веществ в диапазоне концентраций порядка десятков нмоль на параметры энергизованных митохондрий. Полученные данные по диссипации мембранного потенциала хорошо коррелируют с данными по снижению генерации перекиси при обратном переносе), при этом, кинетика подавления генерации перекиси обгоняет кинетику подавления синтеза АТФ, что позволяет отнести наблюдаемый феномен к так называемой мягкой деполяризации, когда потенциал ниже порогового значения для образования перекиси, но синтез АТФ еще возможен.

Для того чтобы протонофоры не обладали токсичным действием и не проявляли свою активность в тех случаях, когда клетке требуется синтез АТФ, необходимо, чтобы их активность зависела от функционального состояния митохондрий, например, от потенциала на ее внутренней мембране. В состоянии гиперполяризации протонофор должен снимать только избыток потенциала, но не снижать его чрезмерно, что неизбежно приведет к ингибированию процесса дыхания. Идеальный протонофор не должен ингибировать дыхание митохондрий даже при относительно высоких концентрациях. Ранее предпринимались попытки синтеза веществ, обладающих свойствами «мягких» митохондриальных разобщителей, однако они потерпели неудачу [20].

Таким образом, рассматриваемый янтарнокислый комплекс, вероятно, выступает в качестве такого «мягкого» разобщителя, что уменьшает интенсивность образования АФК и оптимизирует синтез АТФ. В результате работы было показано высокое влияние комплекса на дыхательную функцию митохондрий. Данное исследование показало, что комплекс средств метаболического и антиоксидантного действия повышает базальный уровень дыхания митохондрий, что может быть актуально для повышения исходно нормальной респирометрической функции митохондрий, например, в профилактике гипоксических состояний при отсутствии патологии. Увеличение интенсивности стимулированного дыхания также представляет собой интересный аспект метаболического действия комплекса.

Было показано, что изучаемый комплекс увеличивал интенсивность субстратного дыхания, причем выраженные изменения были получены на всем протяжении митохондриальной дыхательной цепи, что является важным терапевтическим преимуществом в условиях дефицита субстратов окисления – при ишемически-гипоксическом повреждении.

Универсальным метаболическим паттерном ишемий является накопление предшественника сукцината – циклической лимонной кислоты, ответственной за митохондриальную выработку реактивных форм кислорода. Избыток сукцината повторно окисляется сукцинатдегидрогиназой, что приводит к стремительному накоплению реактивных форм кислорода. Триметилгидразиниевый компонент изучаемого комплекса, переводя клетку в анаэробный цикл, снижает доступность молекулярных форм кислорода для оксиления сукцината, таким образом, прерывая патологический каскад образования разрушительных свободных радикалов и оказывая выраженное антигипоксическое действие [21].

Кроме того, учитывая метаболический профиль действия триметилгидразиния пропионата, а именно ограничение требующих кислорода процессов окисления жирных кислот с переводом клетки на интенсивный углеводный обмен и шунтирующий эффект этилметилгидроксипиридина сукцината, можно предположить увеличение устойчивости клеток к кислородному дефициту на разных сопряженных метаболических уровнях. Так, фрагмент триметилгидразиния, за счет повышения транспорта углеводов в клетку и ограничения гликолиза, опосредованного ингибицией фосфофруктокиназы, может увеличивать эффективность степени воздействия этилметилгидроксипиридина сукцината на электронотрапспортные процессы, модулируя тем самым оптимальную продукцию АТФ в условиях ишемии, достаточную для поддержания нормального функционирования клетки [22].

В сложившихся условиях ишемии тканей модуляция синтеза АТФ может иметь важное значение для выживания клетки. Известно, что в условиях ишемического инсульта снижение концентрации внутриклеточного пула АТФ до критического уровня опосредует активацию каспазо-зависимых реакций апоптоза, ведущих к гибели клетки и усилению реакций нейровоспаления [23, 24]. Также при манифестации болезни Альцгеймера – одного из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний – повышение образования АТФ за счет активации субстрат-зависимого дыхания, а именно переключение биоэнергетических процессов с одного используемого субстрата на другой, может препятствовать спонтанной самоагрегации тау-белка, подавляя тем самым основной патогенетический каскад болезни Альцгеймера (в данном случае АТФ выступает как естественный гидротроп, стабилизирующий белковые молекулы) [25].

Значительное усиление сукцинат зависимого дыхания под влиянием комплекса (триметилгидразиния пропионат+ этилметилгидроксипиридина сукцинат) в условиях блокады активности митохондриального комплекса I ротеноном, сопряженное с АФК-ингибирующей активностью, вероятно, позволит добиться определенных терапевтических преимуществ при болезни Паркинсона. Установлено, что одним из патогенетических триггеров данного заболевания является дисфункция митохондриального комплекса I с последующим усилением утечки электронов из митохондриальной дыхательной цепи и развитием окислительного повреждения нейронов черной субстанции [26]. В данных условиях применение рассматриваемого комплекса компонентов позволит достичь эффекта «метаболического обхода» комплекса I, что позволит уменьшить ретроградный ток и утечку электронов, снизив образование AФК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По совокупности полученных результатов, можно предполагать, что лекарственный препарат Брейнмакс® приводит к стабилизации митохондриальной функции, рационализации работы клетки в условиях стресса, нормализации энергообмена в клетке даже в условиях гипоксии и устранению нежелательных эффектов ишемически-гипоксического повреждения тканей. Причем для комплекса активных компонентов, обладающих синергетическим взаимодействием, эти эффекты более выражены, чем для их применения по отдельности. Спектр биохимических реакций, происходящих в клетке под действием янтарнокислого комплекса с триметилгидразинием, и соответствующие фармакологические эффекты могут являться предметом дальнейших, более детализированных исследований на соответствующих экспериментальных моделях патологических процессов.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование проводилось при поддержке компании ООО «ПРОМОМЕД РУС». Спонсор не оказывал влияния на выбор материала для публикации, анализ и интерпретацию данных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

М.В. Журавлева – анализ результатов, редактирование текста; М.В. Грановская – интерпретация результатов; К.Я. Заславская – разработка концепции исследования, редактирование текста; Ю.Г. Казаишвили – статистическая обработка результатов, написание текста; В.С. Щербакова – написание текста, подбор литературных источников; А.А. Андреев-Андриевский – организация и проведение исследования, интерпретация результатов; Д.И. Поздняков – анализ результатов, написание текста; М.Ю. Высоких – разработка дизайна и написание программы исследования.

 

¹ World Health Organization. The top 10 causes of death. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death

Об авторах

Марина Владимировна Журавлева

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет)

Email: mvzhuravleva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9198-8661

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет); заместитель начальника научного отдела клинической фармакологии Института исследований и разработок ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России

Россия, 127051, г. Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2; 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2

Марина Викторовна Грановская

Институт системной биологии, Университетский колледж Дублина

Email: mgranovsk@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6867-5376

адьюнкт профессора Института системной биологии Университетского колледжа Дублина

Ирландия, D04 V1W8, Белфилд, Дублин, 4

Кира Яковлевна Заславская

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва»

Email: kiryonok@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7348-9412

ассистент кафедры биологической и фармацевтической химии с курсом организации и управления фармацией Медицинский институт ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева»

Россия, 430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, д. 68

Юрий Георгиевич Казаишвили

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тверской государственный медицинский университет Минздрава России

Email: ykaza@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-0826-4177

кандидат биологических наук, ассистент кафедры фармакологии ФГБОУ ВО Тверского ГМУ Минздрава России

Россия, 170100, г. Тверь, ул. Советская, д. 4

Виктория Сергеевна Щербакова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тверской государственный медицинский университет Минздрава России

Email: Victoria_kaptar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7251-8744

кандидат биологических наук, ассистент кафедры фармакологии ФГБОУ ВО Тверского ГМУ Минздрава России

Россия, 170100, г. Тверь, ул. Советская, д. 4

Александр Александрович Андреев-Андриевский

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации Институт медико-биологических проблем Российской академии наук

Email: aaa@mitotech.ru
ORCID iD: 0000-0002-1173-8153

руководитель отдела исследований на животных

Россия, 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76А

Дмитрий Игоревич Поздняков

Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: pozdniackow.dmitry@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5595-8182

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии ПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России

Россия, 357532, г. Пятигорск, пр-т Калинина, д. 11

Михаил Юрьевич Высоких

Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского» Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: mikhail.vyssokikh@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4047-6201

кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярных механизмов старения, НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

Россия, 119992, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40

Список литературы

Дополнительные файлы