Особенности стратегии контроля качества препаратов на основе жизнеспособных клеток кожи

Полный текст

Список сокращений: ЭК – эквивалент кожи (полнослойный); ЭЭ – эпидермальный эквивалент; ДЭ – дермальный эквивалент; МСК – мезенхимальные стволовые клетки; FDA – Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США); PMDA – Агентство по фармацевтической продукции и медицинским приборам (Япония); МБК – мастер банк клеток; РБК – рабочий банк клеток; ПЦР – полимеразная цепная реакция; VEGF – фактор роста эндотелия сосудов.

ВВЕДЕНИЕ

Эквиваленты кожи (ЭК) – тканеинженерные аналоги кожи, являющиеся трехмерными конструкциями на основе культивируемых in vitro клеток кожи и различных синтетических или органических носителей (скаффолдов, матриц, матриксов), применяемых в медицине для временной или постоянной замены поврежденных эпидермальных, дермальных или полнослойных участков кожи [1–3]. С этой же целью возможно применение культивируемых клеток кожи, например, фибробластов или кератиноцитов, без создания на их основе трехмерной структуры с использованием носителя в виде суспензии клеток [4].

Применение ЭК и клеток кожи без носителя направлено на восстановление структуры и функций кожи, прежде всего, барьерной (защита организма от инфицирования патогенами из окружающей среды и предотвращение потери воды и минеральных солей организмом через раневую поверхность). Также отдельно важно отметить ускорение процессов заживления и уменьшении болевого синдрома при ожогах, острых и хронических ранах, рубцах, диабетических язв, невусов, нарушения структуры кожи в результате генетических и других заболеваний [5–9].

Ключевым этапом в разработке и производстве ЭК является выделение определенных типов клеток из кожи донора с последующим культивированием этих клеток in vitro с целью получения необходимого для терапевтического эффекта количества клеточного материала. Все ЭК, разрешенные к клиническому использованию в мире на данный момент, содержат только два типа клеток (по отдельности, либо совместно): кератиноциты и фибробласты. Использование кератиноцитов, способных к образованию слоя ороговевшего эпителия, лежит в основе создания эпидермальных графтов (эпидермальный тканеинженерный эквивалент, ЭЭ), а использование фибробластов в совокупности с органическими или синтетическими носителями позволяет создать аналог дермы – дермальный графт (дермальный тканеинженерный эквивалент, ДЭ), что увеличивает вероятность последующего успешного приживления с 15 до 45–75% [10]. Существуют препараты, получившие разрешение на клиническое применение в разных странах мира, сочетающие в себе как ЭЭ, так и ДЭ, и являющиеся композитными двуслойными ЭК (полнослойные ЭК) [11]. Полнослойные эквиваленты кожи являются альтернативой кожных трансплантатов, получаемых как из здоровых участков кожи самих пациентов (аутотрансплантатов), так и от здоровых доноров (аллотрансплантатов).

Проводились разработки по улучшению функциональности тканеинженерных конструкций и достижения большей схожести со здоровой кожей человека посредством использования и других типов клеток: эндотелиальных, клеток Лангерганса, меланоцитов [12–14]. Труднодоступность и сложности культивирования кератиноцитов и фибробластов привели к попыткам применения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) различного происхождения, обладающих высоким пролиферативным потенциалом и возможностью к дифференцировке, отдельно или в сочетании с носителем [15]. Однако все эти исследования находятся на стадии разработки или клинических испытаний: в данный момент в мире нет зарегистрированных ЭК, основанных на использовании этих типов клеток.

Среди препаратов, содержащих клетки кожи и получивших разрешение на клиническое применение, существуют продукты, созданные на основе клеток как аутологичного (чаще ЭЭ), так и аллогенного происхождения (чаще ДЭ и полнослойные ЭК) [16]. При этом продукт может являться суспензией клеток и наноситься на раневую поверхность методом распыления (в виде спрея), либо в виде тканеинженерного графта покрывать рану в результате аппликации [4]. В ряде препаратов применяется внутрикожное введение клеток с помощью иглы и шприца. Для создания графта ЭК клетки помещают на носитель (матрицы, скаффолды, матриксы), в качестве которого чаще всего используют коллаген животного происхождения (бычий, свиной, мышиный) и синтетические носители (силикон, гиалуроновую кислоту и другие). Это позволяет получить многослойную структуру с хорошо выраженными барьерной функцией, биомеханической устойчивостью, стратификацией кератиноцитов, образованием межклеточных взаимодействий, синтезом базальной мембраны и важных компонентов внеклеточного матрикса [17, 18].

Все ЭК могут быть использованы в качестве временных биологически активных повязок, выполняющих барьерную функцию, однако ряд продуктов, в основном содержащих биоразлагаемые носители, могут быть использованы в качестве постоянной замены поврежденного участка кожи.

При производстве и осуществлении процедуры регистрации ЭК встает вопрос об адекватной и всеобъемлющей оценке их качества, которая осложняется композитным составом этих препаратов, включающих как компонент из жизнеспособных клеток, так, зачастую, и неклеточный компонент – носитель.

ЦЕЛЬ. Изучение международного опыта обеспечения качества препаратов на основе клеток кожи для выявления особенностей стратегии их контроля качества при разработке, производстве, а также при экспертной оценке качества в рамках процедуры государственной регистрации в Российской Федерации. Выявление особенностей стратегии контроля качества препаратов, содержащих клетки кожи, является актуальной задачей в сфере государственного регулирования и фармакологического надзора.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Основой исследования по анализу особенностей стратегии контроля качества препаратов на основе жизнеспособных клеток кожи послужили материалы, представленные в экспертных отчетах регуляторных органов США (Food and Drug Administration – FDA) и Японии (Pharmaceuticals and Medical Devices Agency – PMDA) для следующих препаратов, получивших разрешения на клиническое использование Fda.gov и Pmda.go.jp: Apligraf и GINTUIT (Organogenesis, Inc., США)¹; LAVIV (Fibrocell Technologies, Inc., США)²; STRATAGRAFT (Sratatech Corporation, США)³; Epicel (Genzyme Biosurgery, США)⁴; Invitrx (Ortec International, Inc., США)⁵; JACE (Japan Tissue Engineering Co., Ltd., Япония)⁶.

Информация по другим препаратам, применяемым в странах Евросоюза (ЕС), Республике Корея, Российской Федерации (РФ) и других странах мира, была получена с официальных сайтов производителей, а также из обзорных и научных работ по исследованию структуры и свойств тканеинженерных аналогов кожи.

Для проведения исследования были использованы следующие электронные ресурсы: PubMed, Scopus, Google Scholar, eLibrary, Ema.europa.eu., Fda.gov, Pmda.go.jp. Запросы проводились по комбинациям ключевых слов: «skin substitutes», «scaffolds for skin repair and regeneration», «skin tissue engineering», «skin cells products quality control», «skin cells products quality attributes», а также по торговым названиям препаратов, разрешенных к медицинскому применению. Поиск осуществляли за период с октября 2021 года по апрель 2022 года.

В работе были использованы логические методы системного анализа и моделирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время (по состоянию на апрель 2022 г.) были выданы разрешения на клиническое применение более, чем для двух десятков препаратов, содержащих жизнеспособные клетки кожи человека, в странах ЕС, США, Австралии, Японии, Республике Корее и РФ (для некоторых продуктов срок действия разрешения истек и не был продлен).

В таблице 1 представлены препараты на основе клеток кожи человека, используемые для восстановления кожного покрова (ЭЭ, ДЭ, полнослойные ЭК и препараты на основе клеток кожи без носителя), получившие разрешение на клиническое применение в разных странах мира, информация о которых представлена на официальных сайтах производителей и в экспертных отчетах регуляторных органов (см. раздел «Материалы и методы»).

 

Таблица 1 – Примеры препаратов на основе клеток кожи человека, получившие разрешение на клиническое применение в мире

Название препарата	Производитель и страна регистрации	Клеточный компонент препарата	Вид носителя	Происхождение клеток	Заболевания, для лечения которых предназначен
ЭПИДЕРМАЛЬНЫЕ ЭКВИВАЛЕНТЫ И ПРЕПАРАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ КЕРАТИНОЦИТЫ
Epicel (культивированный эпидермальный аутотрансплантат)	Genzyme Biosurgery, США	Слой кератиноцитов (толщиной ٢–8 клеток), культивированных в присутствии неделящихся фибробластов мыши (фидерный слой)	–	Аутологичное	Глубокие ожоги (более ٣٠٪ поверхности тела)
JACE (пласт аутологичных эпидермальных клеток человека)	Japan Tissue Engineering Co., Ltd. (J-TEC), Япония	Слой кератиноцитов толщиной в несколько клеток, культивированных в присутствии облученных клеток ٣T3-J2, полученных из эмбриона мыши (фидерный слой)	–	Аутологичное	Обширные (более ٣٠ ٪ поверхности тела) ожоги II–III степени
КeraHeal	Biosolution Co., Ltd., Республика Корея	Суспензия культивированных кератиноцитов	–	Аутологичное	Глубокие ожоги II ст. (более ٣٠ ٪ поверхности тела) и III ст. (более ١٠ ٪ поверхности тела)
КeraHeal-Allo	Biosolution Co., Ltd., Республика Корея	Суспензия кератиноцитов	Термочувствительный гидрогель	Аллогенное	Глубокие ожоги II ст.
Holoderm	Tego Science, Inc., Республика Корея	Культивированные предшественники кератиноцитов с образованием эпидермального лоскута	–	Аутологичное	Ожоги III ст. (более ٥٠ ٪ поверхности тела)
Kaloderm	Tego Science, Inc., Республика Корея	Культивированные кератиноциты с образованием эпидермального лоскута	–	Аллогенное	Глубокие ожоги II ст.; Диабетическая язва стопы
EpiDex	Modex Therapeutiques, Швейцария	Культивированные кератиноциты	н/д	Аутологичное	н/д
EPIBASE	Laboratoires Genevrier, Франция	Культивированные до конфлюентного монослоя кератиноциты	–	Аутологичное	н/д
MySkin	CellTran Ltd., Великобритания	Культивированные до субконфлюентного монослоя кератиноциты	Силиконовая матрица с поверхностным покрытием	Аутологичное	Невропатические, пролежневые, диабетические язвы стопы; Ожоги
Laserskin (Vivoderm)	Fidia Advanced Biopolymers, Италия	Культивированные до конфлюентного монослоя кератиноциты	Микроперфорированная мембрана из гиалуроновой кислоты	Аутологичное	Диабетические и венозные язвы нижних конечностей; Неглубокие ожоги; Витилиго
Bioseed-S	BioTissue Technologies GmbH, Германия	Культивированные до субконфлюентного монослоя кератиноциты	Матрикс на фибриновом герметике	Аутологичное	Резистентные к терапии хронические венозные язвы нижних конечностей
CellSpray	Clinical Cell Culture (C3), Австралия	Некультивированные / культивированные до субконфлюентного монослоя кератиноциты	–	Аутологичное	н/д
Пласт кератиноцитов многослойный	Институт цитологии РАН, Россия	Культивированные кератиноциты	н/д	н/д	Ожоги разной степени тяжести, в том числе критические и сверхкритические; Язвы разной этиологии; Раны в результате травм; Свищи, пролежни
ДЕРМАЛЬНЫЕ ЭКВИВАЛЕНТЫ И ПРЕПАРАТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ФИБРОБЛАСТЫ
LAVIV (Azficel-T)	Fibrocell Technologies, Inc., США	Культивированные фибробласты	–	Аутологичное	Средне-глубокие и глубокие морщины носогубных складок
TransCyte (DermagraftTC)	Advanced BioHealing, Inc., США	Культивированные неонатальные фибробласты	Подложка из силиконовой пленки, нейлоновой сетки из коллагена свиней	Аллогенное	Поверхностные и глубокие ожоги; Хронические язвы нижних конечностей, в том числе диабетические и венозные; Пролежни
Dermagraft	Shire Regenerative Medicine, Inc., США	Культивированные неонатальные фибробласты	Биорезорбируемый коллаген на губке из полиглактина или полиглактина-٩١٠	Аллогенное	Хронические диабетические язвы нижних конечностей, затрагивающие дерму, но не достигшие сухожилий, мышц и костей; Хронические и инфицированные раны
СureSkin Inj.	S.Biomedics Co., Ltd., Республика Корея	Культивированные фибробласты	–	Аутологичное	Послеугревые депрессивные рубцы
Rosmir	Tego Science, Inc., Республика Корея	Культивированные фибробласты	–	Аутологичное	Уменьшение носо-слезной борозды
Hyalograft 3D	Fidia Advanced Biopolymers, Италия	Культивированные фибробласты	Микроперфорированная мембрана из гиалуроновой кислоты	Аутологичное	Диабетические и венозные язвы нижних конечностей; Неглубокие ожоги; Витилиго
Клеточная технология SPRG-терапия	Институт стволовых клеток человека, Россия	Культивированные фибробласты	–	Аутологичное или аллогенное	Коррекция возрастных изменений кожи; Рецессия и дефицит слизистой оболочки в области зубов и зубных имплантатов
Эквивалент дермальный	Институт цитологии РАН, Россия	Культивированные фибробласты	Коллагеновый гель	Аллогенное	Ожоги разной степени тяжести, в том числе критические и сверхкритические; Язвы разной этиологии; Раны в результате травм; Свищи, пролежни
ПОЛНОСЛОЙНЫЕ ЭКВИВАЛЕНТЫ КОЖИ
Apligraf	Organogenesis, Inc., США	Слои из культивированных кератиноцитов и фибробластов	Матрикс из бычьего коллагена и белков внеклеточного матрикса	Аллогенное	Раны мягких тканей полости рта
GINTUIT (Аллогенные культивированные кератиноциты и фибробласты бычьего коллагена)	Organogenesis, Inc., США	Слои из культивированных кератиноцитов и фибробластов	Бычий коллаген I типа	Аллогенное	Дефекты и поражения слизистой оболочки десны
STRATAGRAFT (Аллогенные культивированные кератиноциты и дермальные фибробласты мышиного коллагена)	Sratatech Corporation, США	Стратифицированный эпителиальный слой, содержащий дифференцированные кератиноциты, нанесенные на дермоподобную структуру, образованную фибробластами	Мышиный коллаген I типа	Аллогенное	Термические ожоги при неповрежденных дермальных элементах (глубокие ожоги IIIA cт.)
Invitrx (композитная кожа)	Ortec International, Inc., США	Слои из культивированных кератиноцитов и фибробластов	Губка из бычьего коллагена I типа с тонким гелеобразным слоем бычьего коллагена	Аллогенное	Дистрофический буллезный эпидермолиз (после операции по реконструкции руки)
OrCel	Ortec International, Inc., США	Слои из культивированных кератиноцитов и фибробластов	Губка из бычьего коллагена I типа	Аллогенное	Дистрофический буллезный эпидермолиз (после операции по реконструкции руки); Ожоги и раны
PolyActive	HC Implants BV, Нидерланды	Культивированные кератиноциты и фибробласты	Синтетическая матрица из производных терефталата	Аутологичное	Неглубокие раны

Примечание: Препараты Laserskin и Hyalograft 3D могут применяться совместно. Такой комплексный препарата имеет торговое название TissueTech Autograft System. SPRG – Service for Personal Regeneration of Gum.

 

Следует отметить, что не все продукты на основе клеток кожи первоначально были зарегистрированы как лекарственные препараты. Ряд продуктов, например, Epicel (Genzyme Biosurgery) и Invetrx (Ortec International) получили в FDA разрешение на клиническое применение как медицинские изделия (Humanitarion Device Examption, HDE), но затем были переквалифицированы как биологические продукты на основе тканей «Tissue & Tissue Products», регулируемые в FDA подразделением по оценке и исследованию биологических препаратов (Center for Biologics Evaluation and Research – CBER). В РФ в настоящее время отсутствует опыт государственной регистрации препаратов, содержащих жизнеспособные клетки кожи человека, как биомедицинских клеточных продуктов в рамках действующего в настоящее время на территории РФ Федерального закона от 23 июня 2016 г. № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах», или как высокотехнологических лекарственных препаратов в рамках Решения Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 78 «О Правилах регистрации и экспертизы лекарственных средств для медицинского применения». Ранее три тканеинженерных продукта (клеточная технология SPRG-терапия Института стволовых клеток человека, эквивалент дермальный и пласт кератиноцитов многослойный Института цитологии РАН) [6] получили разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения (Росздравнадзора) на клиническое применение в медицинской практике как клеточные технологии для персонализированного лечения кожи⁷. На данный момент сроки действия разрешений на применение клеточных технологий и регистрационные удостоверения на изделия медицинского назначения истекли, или их коммерческое использование приостановлено вследствие изменившейся законодательной базы РФ в сфере разработки и регистрации препаратов на основе жизнеспособных клеток человека.

В настоящее время в открытом доступе имеются лишь экспертные отчеты по продуктам, зарегистрированным FDA и PMDA, зачастую содержащие неполную информацию, касающуюся проведения оценки качества при внутрипроизводственном контроле и контроле при выпуске препарата. Основываясь на имеющихся данных, можно обозначить представленные далее особенности стратегии контроля качества ЭК и препаратов на основе жизнеспособных клеток кожи, а также выявить основные проблемы, связанные с их производством.

Входной контроль сырья и материалов

Использование сырья человеческого и животного происхождения (сыворотки для культивирования клеток, экстракта бычьего гипофиза, коллаген для матрикса) связано с такой проблемой безопасности использования продукта, как риск микробиологического и вирусного загрязнения, а в случае с материалами, полученными от крупного рогатого скота, дополнительно возникает риск передачи трансмиссивной губчатой энцефалопатии. С целью снижения этих рисков материалы и реагенты животного происхождения подвергаются тестированию на стерильность (присутствие бактерий, грибов, микоплазмы), наличие вирусной контаминации и бактериальных эндотоксинов. Весь материал от крупного рогатого скота должен быть получен из стран, где случаи заболеваемости трансмиссивной губчатой энцефалопатии не были зарегистрированы [22].

В случае производства большинства препаратов осуществляется тестирование доноров клеток на наличие возбудителей инфекционных заболеваний. Однако, для препарата с аутологичным применением Epicel (Genzyme Biosurgery) доноры клеточного материала такому тестированию не подвергаются, что приводит к риску возможного инфицирования персонала, работающего с биоматериалом и продуктом. Это требует соблюдения особых мер предосторожности на производстве⁸.

Кроме того, материал, используемый для создания носителей клеток и образования трехмерной структуры продукта должен тестироваться на физико-химические свойства.

Создание банков клеток

Еще одна особенность производства препаратов на основе клеток человека, предназначенных для аллогенного использования – необходимость создания банков клеток.

Для производства ЭЭ, ДЭ и полнослойных ЭК для аллогенного применения используются кератиноциты и фибробласты человека, полученные из биопсийного материала здоровых доноров, культивированные с целью наработки необходимого для терапевтического эффекта клеточного материала. Получение необходимого количества клеток, которое возможно использовать для одного или даже нескольких пациентов, из небольшого донорского участка кожи было бы затруднительно без создания производственных банков клеток: мастер банка (МБК) и рабочего банка клеток (РБК). Как правило, количество пассажей между МБК и РБК небольшое⁹. Банки клеток должны быть аттестованы и банкируемые клеточные линии охарактеризованы по таким показателям качества, как стерильность, отсутствие микоплазменной контаминации и занесенных вирусных агентов, цитогенетическая стабильность, туморогенность, чистота, активность и подлинность, пролиферативная активность и жизнеспособность. Особенности тестирования клеточных линий по некоторым показателям качества, приведенные в экспертных отчетах регуляторных органов, выдавших разрешение на клиническое использование препаратов (раздел «Материалы и методы»), приведены в таблице 2.

 

Таблица 2 – Некоторые особенности аттестации производственных банков кератиноцитов и фибробластов

Показатель	Подход к тестированию	Методы анализа
Вирусная безопасность	In vitro и in vivo тестирование на вирусы (в том числе, ретровирусы), специфичные для человека, свиней, крупного рогатого скота	Трансмиссивная электронная микроскопия; Обратная транскрипция
Стерильность, микоплазменная контаминация	Выявление всех видов микробиологических контаминантов: бактерий и грибов	Микробиологические методы; ПЦР
Туморогенность	In vitro исследования стабильности генома клеток; In vivo образование опухолей	Кариотипирование; Изоферментный анализ; Тесты на старение культуры клеток; Тесты на образование опухолей
Подлинность	Экспрессия инволюкрина кератиноцитами; Биосинтез коллагена фибробластами	Изоферментный анализ; Иммунохимические методы; ПЦР
Активность	Жизнеспособность; Параметры роста культуры клеток	Подсчет клеток с помощью автоматического счетчика или с помощью гемоцитометра; Проточная цитометрия; Морфологический анализ
Сопоставимость (с ранее охарактеризованными клетками)	In vitro тесты, в том числе подтверждение клеточной чистоты, степень и интенсивность чрескожной абсорбции, анализ цитокинового профиля и количественный анализ VEGF; In vivo исследования на иммунодефицитных животных уровня экспрессии инволюкрина, приживления, интеграция, морфология и деформация графта, уменьшение раневой поверхности посредством раневой контракции	Гистология; Иммунохимические методы; MTT-тест

Примечание: ПЦР – полимеразная цепная реакция; VEGF – фактор роста эндотелия сосудов; MTT – колориметрический метод с использованием соли тетразолия.

 

Риск использования фидерного слоя из клеток животных

Для культивирования клеток кожи человека при производстве ряда препаратов, например, Epicel (Genzyme Biosurgery), STRATAGRAFT (Sratatech Corporation) и JACE (Japan Tissue Engineering Co.) используется фидерный слой клеток мыши, которые могут в остаточном количестве присутствовать в готовом продукте. FDA причисляет данные продукты к ксенотрансплантатам и несмотря на возможность использования фидерных клеток только из аттестованных банков клеток и признание низким риска передачи возбудителей инфекционных заболеваний через эти клетки, рекомендует реципиентам препаратов отказаться от донорства крови, плазмы, тканей, яйцеклеток, грудного молока и других биоматериалов.

Внутрипроизводственный контроль

Основной характеристикой производства препаратов, содержащих жизнеспособные клетки человека, является проведение всех процессов в асептических условиях. Отсутствие возможности стерилизации получаемого готового препарата приводит к необходимости контроля продукта на стерильность и отсутствие микоплазмы в качестве внутрипроизводственного контроля.

Особенности строения^10,11 препаратов на основе клеток кожи, представляющих собой многослойную структуру на носителе, приводят к необходимости отслеживания морфологии продукта с помощью визуальной оценки и гистологического исследования, физических свойств после стадии промывки графта, пролиферативной активности кератиноцитов и подсчета жизнеспособных клеток [23, 24]. Предоставление отчета о морфологии клеток в виде фотографий, контроля образования многослойной структуры в культуре клеток и характеристику других типов клеток (кроме фибробластов), присутствующих в культуре клеток, консультационный комитет FDA потребовал и для препарата Laviv, содержащего фибробласты кожи без носителя.

Результаты тестирования по вышеизложенным показателям качества, наряду с некоторыми другими, например, «бионагрузкой», могут входить в спецификацию на готовый продукт, но быть получены в процессе производства. Это связано с небольшим сроком годности готового продукта (без криозаморозки) [25], не позволяющим проводить долгосрочные тесты при выпуске препарата. Так срок годности Apligraf и Gintuit (Organogenesis, Inc.) после размораживания составляет 15 суток, а срок годности STRATAGRAFT (Sratatech Corporation) – и вовсе 4 ч.

Тестирование готового препарата при выпуске

Все зарегистрированные на настоящий момент в мире препараты, содержащие жизнеспособные клетки кожи человека, получены в результате непрерывного процесса производства, и, следовательно, имеют только одну конечную спецификацию на готовый продукт. В зависимости от строения препарата, наличия многослойной структуры или носителя спецификации могут различаться по набору показателей качества, по которым происходит тестирование продукта при выпуске. Такое тестирование может частично производиться на стадии до заморозки готового препарата, а частично на стадии после фасовки на размороженных образцах, как указано в экспертном отчете на препарат LAVIV (Fibrocell Technologies, Inc.).

В общем виде спецификация на готовый продукт, содержащий жизнеспособные клетки кожи человека, включает следующие показатели качества:

– Визуальная оценка внешнего вида продукта

(описание);

– Жизнеспособность и общее число клеток;

– Стерильность;

– Микоплазма;

– Бактериальные эндотоксины;

– Подлинность (для фибробластов

и кератиноцитов);

– Чистота;

– Активность (эффективность);

– Целостность системы упаковки.

В показателе качества «Описание» должны быть отражены такие параметры как цветность, прозрачность препарата, внешний вид ЭЭ или ДЭ (если применимо): наличие неровностей на поверхности конструкции, сморщивания, деформации, изменения толщины слоев¹².

Оценка стерильности в основном осуществляется с помощью стандартного микробиологического теста, с последующей окраской микробиологических препаратов по Грамму^13,14. Тест на микоплазму при выпускающем контроле препарата JACE (Japan Tissue Engineering Co., Ltd.) осуществлялся цитохимическим методом при помощи окрашивания ДНК флуоресцентным красителем (с использованием индикаторных линий клеток). Допускается, что результаты тестирования на стерильность и микоплазму могут быть получены уже после клинического применения препарата, вследствие превышения продолжительности проведения испытания над сроками годности некоторых препаратов¹⁵. Возможность клинического применения препарата без результатов оценки стерильности и контаминации микоплазмой приводит к требованию предоставления информации для врача с планом лечения пациента в случае инфицирования контаминирующими препарат агентами на вкладыше в упаковку готового продукта.

В экспертном отчете на препарат JACE (Japan Tissue Engineering Co., Ltd.) указывается необходимость контроля содержания остаточного количества бычьего сывороточного альбумина, определение остаточного числа фидерных клеток и физических свойств лоскута (возможно на стадии внутрипроизводственного контроля). Подобные тесты могут быть отнесены к показателю качества «чистота» и доказывать отсутствие в готовом продукте примесей, образующихся в результате технологического процесса.

Одним из самых сложных и спорных моментов в подборе адекватных методов анализа при оценке качества препаратов, используемых для заживления ран и повреждений кожи, является подтверждение их активности. Чаще всего механизм действия препаратов не продемонстрирован (не установлен) или не приведен в нормативной документации к продукту. В ряде экспертных отчетов к препаратам указывается возможность заживление ран за счет активации деления клеток реципиента при секреции клетками продукта биологически активных веществ (факторы роста тромбоцитов, фибробластов, эндотелия сосудов, эпидермальный фактор роста, цитокины, коллаген IV типа, тенасцин, фибронектин и другие). Подобный механизм действия отмечается для препаратов Apligraf, GINTUIT, STRATAGRAFT, KeraHeal-Allo, OrCel, TransCyte и Dermagraft. Способность фибробластов ускорять механизмы регенерации тканей за счет секреции ими биологически активных веществ считается доказанной [26, 27]. При этом такие продукты находятся на раневой поверхности временно, с постепенной элеминацией клеток и резорбцией неклеточного материала (если применимо). Для другой группы препаратов (KeraHeal, TissueTech Autograft System, СellSpray) показано уменьшение раневой поверхности вследствие пролиферации и дифференцировки клеток самого препарата с образованием структур кожи, необходимых для выполнения барьерной функции. Данные препараты используются в качестве постоянных аппликаций для закрытия раневой поверхности вследствие возможной пролиферации, миграции и дифференцировки клеток с образованием многослойного эпителия [28].

Выбор методов и подходов для оценки активности (являющейся мерой эффективности препарата при клиническом использовании) каждого препарата, содержащего клетки кожи человека происходит в индивидуальном порядке и согласуется производителями препарата с регуляторными органами стран, где будет осуществляться их клиническое применение. Например, вывод об эффективности LAVIV (Fibrocell Technologies, Inc.) был сделан на основе определения общего количества клеток в препарате, подтверждения подлинности фибробластов и анализа коллагена, секретируемого клетками. Для оценки эффективности GINTUIT (Organogenesis, Inc.) проводилось гистологическое исследование графта. Однако консультационный комитет признал данный подход только как доказательство структурной целостности продукта, и предложил дополнительно осуществить анализ секретируемых клетками цитокинов.

Кроме того, в спецификацию на готовый продукт могут быть добавлены при необходимости дополнительные показатели качества: pH, бионагрузка¹⁶, барьерные свойства графтов, которые подтверждают образование внешнего ороговевшего слоя эпителия и исследуются на основе гистологического анализа¹⁷. Подтверждение барьерной функции и исследования проницаемости графта проводят с помощью разных подходов, например, посредством определения толщины эпидермиса и исследования липидного профиля [29]. Формирование правильной базальной мембраны возможно подтверждением наличия коллагена IV типа в дермо-эпидермальном соединении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ввиду непрерывности технологического процесса производства, небольшого срока годности и невозможности проведения процедур стерилизации готового препарата, содержащего жизнеспособные клетки кожи человека, а также сложности комбинированных препаратов (применимо к графтам), заключающейся в присутствии в готовом продукте неклеточного компонента – носителя (скаффолдов, матриц, матриксов), зачастую, сложно отделимого от клеток, большое значение приобретает соблюдение ряда требований к технологическому процессу и учет особенностей стратегии контроля качества подобных препаратов. К таким требованиям относятся: создание программы квалификации сырья и исходных материалов, которая бы предусматривала риски их использования; контроль материалов животного происхождения; создание банков клеток кожи, используемых для производства аллогенного продукта; использование фидерных клеток только из аттестованных банков; проведение ряда исследований по показателям качества при внутрипроизводственном контроле с включением результатов этих исследований в спецификацию на готовый продукт. Контроль качества препаратов, содержащих клетки кожи, включает помимо стандартных тестов (описание, жизнеспособность, общее число клеток, стерильность, микоплазма, бактериальные эндотоксины, подлинность, чистота, активность), характерных для контроля качества любых препаратов, содержащих жизнеспособные клетки человека, дополнительно исследования физико-химических свойств носителя и/или целого графта (бионагрузка, барьерные свойства графта).

В связи со сложностью демонстрации активности препаратов, используемых для заживления ран, и не полной изученностью природы их действия, подходы и методы для определения этого показателя качества должны выбираться индивидуально для каждого продукта и отражать такие свойства клеточного компонента, как число, жизнеспособность и подлинность клеток, а также их пролиферативную и/или секреторную способность.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00052-23-00 на проведение прикладных научных исследований (государственный учет НИР № 121021800098-4).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

О.А. Рачинская – информационно-аналитический поиск по теме исследования, обработка данных, написание статьи; Е.В. Мельникова – определение цели и задачи исследования, корректировка текста; В.А. Меркулов – планирование концепции статьи, консультирование по нормативно-правовым актам, регулирующим обращение препаратов.

¹ Food and Drug Administration (FDA). Gintuit – Summary Basis for Regulatory Action, 2012. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://wayback.archive-it.org/7993/20170723023240/https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM297753.pdf

² Food and Drug Administration (FDA). LAVIV – Summary Basis for Regulatory Action, 2011. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://wayback.archive-it.org/7993/20170723023939/https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM262780.pdf

³ Food and Drug Administration (FDA). SRTATAGRAFT – Package Insert, 2021. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.fda.gov/media/150129/download

⁴ Food and Drug Administration (FDA). Epicel – Summary of safety and probable benefit, 1998. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.fda.gov/media/103308/download

⁵ Food and Drug Administration (FDA). Invitrx – Summary of safety and probable benefit, 1998. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf/H990013B.pdf

⁶ Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA). JACE – Review Report, 2007. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.pmda.go.jp/files/000223079.pdf

⁷ Федеральная служба Российской Федерации по надзору в сфере здравоохранения. Перечень медицинских технологий, разрешенных к применению в медицинской практике на 30 декабря 2011 г. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://roszdravnadzor.gov.ru/documents/12545

⁸ Food and Drug Administration (FDA). Epicel – Summary of safety and probable benefit, 1998.

⁹ Food and Drug Administration (FDA). Gintuit – Summary Basis for Regulatory Action, 2012.

¹⁰ Там же.

¹¹ Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA). JACE – Review Report, 2007.

¹² Food and Drug Administration (FDA). SRTATAGRAFT – Package Insert, 2021.

¹³ Food and Drug Administration (FDA). Epicel – Summary of safety and probable benefit, 1998.

¹⁴ Food and Drug Administration (FDA). LAVIV – Summary Basis for Regulatory Action, 2011.

¹⁵ Food and Drug Administration (FDA). Gintuit – Summary Basis for Regulatory Action, 2012.

¹⁶ Там же.

¹⁷ Food and Drug Administration (FDA). SRTATAGRAFT – Package Insert, 2021.

Об авторах

Ольга Анатольевна Рачинская

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: Rachinskaya@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0001-8377-9205

кандидат биологических наук, ведущий эксперт

Россия, 127051, г. Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2

Екатерина Валерьевна Мельникова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: MelnikovaEV@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0002-9585-3545

кандидат биологических наук, начальник лаборатории биомедицинских клеточных продуктов

Россия, 127051, г. Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2

Вадим Анатольевич Меркулов

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: Merculov@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0003-4891-973X

доктор медицинских наук, профессор, заместитель генерального директора

Россия, 127051, г. Москва, Петровский бульвар, д. 8, стр. 2

Список литературы

Дополнительные файлы