Создание клона эмбриональных стволовых клеток мышей с кондиционным нокаутом гуманизированного гена Snca

Полный текст

Список сокращений: НЗ – нейродегенеративные заболевания; огРНК – одиночная гидовая рибонуклеиновая кислота; РНП – рибонуклеопротеины; ПЦР – полимеразная цепная реакция; NAC – неамилоидный компонент; БП – болезнь Паркинсона.

ВВЕДЕНИЕ

Гетерогенная группа патологий, объединенная понятием нейродегенеративные заболевания (НЗ), продолжает приобретать все большую медицинскую и социальную значимость. Ввиду увеличения средней продолжительности жизни, бремя НЗ, классически ассоциированных с пожилым возрастом, становится одной из наиболее актуальных медико-биологических проблем [1]. При этом, несмотря на высокие темпы развития нейробиологии, многие аспекты патогенеза НЗ остаются раскрытыми лишь фрагментарно. Одним из подобных аспектов является роль α-синуклеина в основных процессах, связанных с дегенеративной гибелью нейронов.

В качестве основного компонента белковых агрегатов был обнаружен α-синуклеин при целом ряде НЗ, которые объединены в группу синуклеинопатии, включая болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, расстройство поведения во сне с быстрыми движениями глаз и истинную вегетативную недостаточность [2].

Альфа-синуклеин является продуктом гена Snca, расположенного на хромосоме 4 в положении q22.1 [3], и представляет собой небольшой белок (140 аминокислот), экспрессируемый преимущественно в нейронах, а также в некоторых опухолевых клетках [4]. Его структура представлена тремя основными доменами: N-концевой домен (1–60), содержащий консервативный мотив из нескольких повторяющихся последовательностей аминокислот (консенсусная последовательность XKTKEGVXXXX); центральный домен (61–95), известный как неамилоидный компонент (NAC), который обладает высокой гидрофобностью и участвует в агрегации α-синуклеина при образовании β-складчатой структуры; С-концевой домен (96–140), обогащенный отрицательно заряженными остатками и пролином, обеспечивающим гибкость полипептида [5].

Несмотря на то, что физиологическая функция α-синуклеина остается малоизученной, его локализация в пресинаптических окончаниях [6], связь с резервным пулом синаптических пузырьков [7] и наблюдаемые недостатки синаптической передачи в ответ на нокдаун или сверхэкспрессию гена предполагают, что α-синуклеин играет роль в регуляции высвобождения нейротрансмиттеров, а также в нейропластичности [8].

Возможная роль α-синуклеина в регуляции синаптического гомеостаза связана не только с его непосредственным взаимодействием с синаптическими везикулами: взаимодействует с синаптическими белками, контролирующими экзоцитоз везикул, такими как фосфолипаза D и семейство малых гуанозинтрифосфотаз Rab [9]. Накопленные данные свидетельствуют о том, что α-синуклеин может действовать как шаперон, контролировать деградацию и влиять на сборку, поддержание и распределение пресинаптического белкового комплекса SNARE, который участвует в высвобождении нейротрансмиттеров, в том числе дофамина [10]. В совокупности эти наблюдения указывают на то, что α-синуклеин играет важную роль в перемещении и экзоцитозе везикул [8].

В данной работе мы описываем процедуру создания клона эмбриональных стволовых клеток мышей с CRISPR/Cas9-опосредованной гуманизацией гена Snca с фланкированным LoxP-сайтами первым экзоном.

ЦЕЛЬ. Создание генетически-модифицированного клона стволовых клеток мышей с кондиционным нокаутом гуманизированного α-синуклеина, который может быть использован для реинъекции в мышиные бластоцисты, а также для фундаментальных и прикладных in vitro исследований в области патофизиологии и нейрофармакологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Этическая экспертиза исследования

Эксперименты выполнены в НИИ фармакологии живых систем НИУ «БелГУ» с соблюдением этических стандартов, регламентируемых руководством ARRIVE. Экспериментальные исследования были одобрены биоэтической комиссией Белгородского государственного национального исследовательского университета (протокол № 08/21 от 08.02.2021).

Получение клона клеток с фланкированным первым экзоном гена Snca

Клон мышиных эмбриональных стволовых клеток, несущих одинаково ориентированные LoxP-сайты, фланкирующие первый кодирующий экзон гена Snca (Клон 126), был получен в предыдущих исследованиях лаборатории и был использован для получения мышей с кондиционным нокаутом этого гена. Полученная линия мышей и доказательства истощения α-синуклеина, кодируемого Snca геном, в нервной системе после индукции LoxP/Cre рекомбинации описаны в опубликованных статьях [11–13]. Клон был использован для дальнейшего геномного редактирования с целью получения стволовых клеток с гуманизированным геном Snca.

Поверхности всех пластиковых чашек Петри, флаконов и планшетов, использованных для культивирования мышиных эмбриональных стволовых клеток, были предварительно покрыты слоем желатина: 0,1% раствор желатина (Merk, Германия) наслаивали на рабочую поверхность пластика и отсасывали через 15–30 мин инкубации при комнатной температуре. Непосредственно после этого поверхность покрывали слоем культуральной среды.

Хранившиеся в жидком азоте клетки клона с фланкированным первым экзоном α-синуклеина были разморожены, промыты средой ESGRO Complete Basal Medium (Sigma-Aldrich, США), ресуспендированы в 4 мл среды с GSK3 ингибитором ESGRO Complete Plus Clonal Grade Medium (Sigma-Aldrich, США) и высеяны на пластиковые чашки Петри диаметром 6 см (Nunc, Дания). Через 16 ч инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО₂, меняли среду на свежую ESGRO Complete Plus Clonal Grade Medium, предварительно промыв чашки ESGRO Complete Basal Medium, а через 48 ч подсчитывали концентрацию клеток в камере Горяева и высевали 200 000 клеток на каждую из подготовленных пластиковых чашек Петри, используя ESGRO Complete Accutase (Merk, Германия).

Подготовка клеток к нуклеофекции

Через 48 ч после пересева обрабатывали клетки раствором Accutase, как описано выше, отбирали 2 аликвоты по 200 000 клеток, центрифугировали, тщательно удаляли супернатант и ресуспендировали каждый осадок в 20 мкл Complete P3 буфера, приготовленного непосредственно перед употреблением, смешивая 34,2 мкл Nucleofector TM Solution и 7,6 мкл P3 Primary Cell 4D-Nucleofector® X kit S (Lonza, Швейцария).

Для введения направленных разрывов в редактируемые области гена Snca были использованы рекомбинантный белок Cas9, одиночная гидовая рибонуклеиновая кислота (огРНК), а также одноцепочечные ДНК олигонуклеотиды для гомологической рекомбинации, несущие нуклеотидные замены, соответствующие последовательности Snca гена человека.

Формировали рибонуклеопротеиновые (РНП) комплексы, смешивая 1 мкл 100 µМ раствора sgRNA4, 1 мкл 100 µМ раствора огРНК5 и 1 мкл 10 мг/мл раствора Cas9. Инкубировали 10 мин при 20°С, добавляли 0,4 мкл свежеприготовленной смеси растворов донорной ДНК (ssODN4 и ssODN5) с концентрацией 250 µМ для каждого из олигонуклеотидов и немедленно добавляли 20 мкл клеток ресуспендированных в Complete P3 буфере как описано выше.

Стратегия CRISPR/Cas9-ассистированной гомологической рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши для создания полностью гуманизированного гена Snca, экспрессирующего вариант α-синуклеина человека с повышенной склонностью к агрегации, ассоциированной с развитием наследственной формы болезни Паркинсона показана на рисунках 1 и 5.

Доставка РНП комплексов в клетки с помощью нуклеофекции

Клеточную суспензию переносили в Nucleocuvette TM (Lonza, Швейцария) и проводили нуклеофекцию в приборе 4D-Nucleofector TM (Amaxa, Украина), используя программу CA-120. По окончании переносили клетки в 5 мл ESGRO Complete Plus Clonal Grade Medium, ресуспендировали для получения моноклеточной суспензии, подсчитывали концентрацию выживших клеток в камере Горяева и высевали по 200, 400, 600, 800 и 1000 клеток на каждую из пяти подготовленных чашек Петри диаметром 10 см в 10 мл той же среды предварительно отобрав аликвоту для выделения геномной ДНК.

Клетки доращивали до появления отдельно лежащих колоний, происходящих из одной клетки, разделяли аккутазой в лунке 96-луночного планшета, инкубировали 3 мин при комнатной температуре, добавляли 0,2 мл ESGRO Complete Plus Clonal Grade Medium, ресуспендировали и растили клетки до достижения 30–50-процентного монослоя. На этом этапе пересевали клетки в ячейки 4-луночных чашек в триплетах. Последнюю из трёх параллельных чашек использовали для выделения геномной ДНК.

Выделение геномной ДНК и анализ редактирования экзонов гена Snca

Клетки лизировали непосредственно на поверхности лунок после удаления среды и выделяли ДНК с использованием кита Wizard Mammalian Cell DNA Extraction (Promega, США) согласно инструкции производителя. ДНК использовали для ПЦР амплификации фрагментов ДНК, содержащих последовательности экзонов гена Snca мыши, с помощью GenPak PCR Core набора (Isogen, Россия), согласно инструкции производителя.

Оценка наличия гомологичной рекомбинации с донорной ДНК проводили с помощью аллель-специфичной ПЦР и рестрикционного анализа. Реакционную смесь инкубировали с рестрикционными эндонуклеазами специфичными к мутантной последовательности и электрофоретически разделяли для оценки наличия гомологической рекомбинации с донорной ДНК. Продукты реакции анализировали в 1,5% агарозном геле.

 

Таблица 1 – Компоненты смеси, трансфицированные в клон 126 эмбриональных стволовых клеток, для гуманизации мышиного гена Snca

Компонент	Последовательность	Вид молекулы
sgRNA4 (Alt® CRISPR-Cas9 sgRNA для гуманизации экзона IV гена Snca)	5’- mG*mU*mC*CUUCUUGACAAAGCCAGGUUUUAG AGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U -3’	РНК
sgRNA5 (Alt® CRISPR-Cas9 sgRNA для гуманизации экзона V гена Snca)	5’- mG*mG*mG*UGAGGAGGGGUACCCACGUUUUAGAGCUArGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U -3’	РНК
ssODN4 (Alt-RTM HDR Donor одноцепочечный олигонуклеотид для гуманизации экзона IV гена Snca)	5’- /Alt-R-HDR1/G*T*T ATT ACT GAG CAT AAA ACA GGC AGC CAT ACC TTG CCC AAC TGG TCC TTC TTG ACA AAG CCA GTT GCA GCA GCT ATG CTC CCA GCT CCC TCC ACT GTC TTC TGA GCG ACA GCT GTC* A*C/Alt-R-HDR2/ -3’	ДНК
ssODN5 (Alt-RTM HDR Donor одноцепочечный олигонуклеотид для гуманизации экзона V гена Snca)	5’- /Alt-R-HDR1/A*A*A ACA CTC TCT TAT TGT GCT TTC TCT TCC CTC TCT GTA GAA TGA GGA GGG GGC CCC ACA AGA AGG AAT CCT GGA AGA CAT GCC TGT GGA TCC TGA CAA TGA GGC TTA TGA AAT GCC TTC AGA GGT AAA TGC CTG TA*T* A/Alt-R-HDR2/ -3’	ДНК
Нуклеаза Cas9	–	Белок

 

Список праймеров, использованных для ПЦР анализа гомологической рекомбинации в Snca локусе клеток клона 124 эмбриональных стволовых клеток мыши:

mexIV-for: 5’-GTCTCTGTCACACCATCATC-3’

mexIV-rev: 5’-AGTGTGCATCATGTGCATGC-3’

exIV-rev-mism: 5’-CAGTaGCAGCAGCTATgc-3’

mexVfor-out: 5’-CCAGTGGTTTGGTACACTTAG-3’

mexVfor-ins: 5’-CTGATAACACTTCGTGCAGC-3’

mexVrev-ins: 5’-TAGTGGCAGGGTTTTGATGG-3’

mexVrev-out: 5’-CTATGCCAACCATAATGTGAG-3’

exV-rev-mism: 5’-tTGTGGGgcCCCCTCCTCAtt-3’

 

Рисунок 1 – Стратегия CRISPR/Cas9-ассистированной гомологической рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши для создания полностью гуманизированного гена Snca

Примечание: для некоторых праймеров и CRISPR-Cas9 crRNA показаны их позиции на приведённой цепи ДНК. Актуальные последовательности приведены в тексте.

 

Рисунок 2 – Анализ продуктов ПЦР амплификации ДНК проанализированных клонов после нуклеофекции клеток клона 126 эмбриональных стволовых клеток мыши РНП комплексами

Примечание: амплификация 176- нуклеотидного фрагмента при использовании праймеров mexVfor-out и exV-rev-mism свидетельствует об успешной гомологической рекомбинации и, как следствие, гуманизации экзона V в геноме клеток субклона 126-2-F4. В качестве положительного контроля использовали амплификацию с теми же праймерами матрицы синтетического фрагмента, соответствующего гуманизированному экзону V мыши с фланкирующими последовательностями.

 

Рисунок 3 – Анализ двух клонов, в которых при первичном скрининге была выявлена гомологическая рекомбинация в экзоне V гена Snca, с помощью обработки 269-нуклеотидного продукта ПЦР амплификации рестрикционной эндонуклеазой ApaI

Примечание: полное расщепление этого фрагмента на фрагменты размером 152 и 117 пар нуклеотидов свидетельствует о том, что клон 126-2-F4 является гомозиготным гуманизации экзона V (А), а только частичное расщепление в случае клона 126-3-B6 – о том, что в этом клоне была гуманизирована только одна из двух аллельных копий (В) гена Snca.

 

Рисунок 4 – Анализ гуманизaции экзона IV в геноме клеток клона 126-2-F4. ДНК материнского клона 126, клона 126-2-F4

Примечание: в качестве положительного контроля использовали амплификацию с теми же праймерами с матрицы синтетического фрагмента, соответствующего гуманизированному экзону IV мыши с фланкирующими последовательностями. Выявление 167-нуклеотидного фрагмента при анализе ДНК клона 126-2-F4 свидетельствует о том, что в геноме клеток этого клона был гуманизирован экзон IV гена Snca.

 

Рисунок 5 – Стратегия создания клона эмбриональных стволовых клеток мыши с кондиционным нокаутом гуманизированного гена Snca

Примечание: I – для создания клона эмбриональных стволовых клеток мыши с кондиционным нокаутом гуманизированного гена Snca были взяты клетки с фланкированным LoxP-сайтами первым экзоном Snca; II – путем трансфекции CRISPR/Cas9, гидовых РНК и фрагментов экзонов IV и V человеческого Snca для гомологичной репарации была произведена гуманизация мышиного гена Snca; III – после модификации методами аллель-специфичной ПЦР и рестрикционного анализа был проведен отбор клонов, несущих необходимую модификацию.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Первичный скрининг клонов на наличие гуманизированного экзона V

Для анализа на наличие 176-нуклеотидного продукта ПЦР амплификации при использовании праймеров mexVfor-out и exV-rev-mism после нуклеофекции, были отобраны 162 клона. Два 3’-концевых нуклеотида в exV-rev-mism соответствовали нуклеотидам, присутствующим в экзоне V генa Snca человека, в то время как в гене мыши в этих положениях находятся 2 других нуклеотида. Kроме указанных в 5’-концевой части этого праймера, имеются ещё 3 нуклеотида, характерные только для гена человека. Таким образом, продукт амплификации с этим праймером образуется только тогда, когда матрицей является ДНК человека или гуманизированная по этому гену ДНК мыши. Когда же матрицей является нативная ДНК мыши, никаких продуктов амплификации не образуется. Пример такого анализа продуктов ПЦР амплификации ДНК, выделенной из клеток 15 отобранных клонов, приведён на рисунке 2.

Как видно из рисунка 2, один из 15 клонов, проверенных на наличие 176-нуклеотидного продукта ПЦР амплификации, дал положительный результат, т.е. в ДНК клеток этого клона произошла гомологическая рекомбинация в экзоне V, что являлось свидетельством того, что в клоне, обозначенном 126-2-F4, в соответствие с его положением в лунке одного из начальных 96-луночных планшетов, этот экзон оказался гуманизированным.

Проверка на гомозиготность модификации в клоне 126-2-F4

ДНК клона 126-2-F4 и материнского клона 126 амплифицировали, используя праймера mexVfor-ins и mexVrev-ins, соответствующие последовательностям, фланкирующим экзон V мыши. Как и предполагалось, в обоих случаях выявлялся одинаковый продукт амплификации – 269-нуклеотидный фрагмент. Обработка реакционной смеси рестрикционной эндонуклеазой ApaI не приводила к расщеплению фрагмента амплифицированного с матрицы ДНК материнского клона 126, т.к. в геноме мыши в анализируемой области отсутствует сайт узнавания этим ферментом. Однако точечные замены, использованные при гуманизации экзона V, приводили к появлению такого сайта. Фрагмент, амплифицированный с матрицы ДНК клона 126-2-F4 разрезался рестрикционной эндонуклеазой ApaI на 152-нуклеотидный и 117-нуклеотидный фрагменты (Рис. 3А). Важно отметить, что при этом оригинальный 269-нуклеотидный фрагмент полностью исчезал, что свидетельствовало о том, что в геноме клеток клона 126-2-F4 гомологическая рекомбинация и, следовательно, гуманизация экзона V произошла в обоих аллелях гена Snca. Ещё в одном клоне 126-3-В9, отобранном в первичном скрининге, наблюдалось лишь частичное расщепление 269-нуклеотидного фрагмента рестрикционной эндонуклеазой ApaI (Рис. 3Б), что свидетельствовало о том, что в геноме этого клона гомологическая рекомбинация произошла только в одной аллельной копии гена или то, что этот клон произошёл не из одной, а из двух клеток, в геноме одной из которых не произошло редактирование последовательностей ДНК экзона V.

Проверка наличия гуманизированного экзона IV в геноме клеток клона 126-2-F4

ДНК клонов 126-2-F4, материнского клона 126 и двух негативных клонов из описанного выше скрининга амплифицировали, используя праймера mexIV-for и exIV-rev-mism. В качестве положительного контроля использовали амплификацию с теми же праймерами матрицы синтетического фрагмента, соответствующего гуманизированному экзону IV мыши с фланкирующими последовательностями. Результат анализа продуктов ПЦР амплификации приведён на рисунке 4.

Фрагмент ожидаемого размера (167 пар нуклеотидов) был выявлен только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК клеток клона 126-2-F4, что свидетельствовало о том, что в этом клоне произошла гомологическая рекомбинация и в экзоне IV гена Snca мыши. Проверка на гомозиготность модификации этого экзона проводилась по той же схеме, что использовалась для экзона V с применением праймера mexIV-for и mexIV-rev и обработку продуктов амплификации рестрикционной эндонуклеазой PvuII. Было выявлено, что 280-нуклеотидный фрагмент, продукт ПЦР амплификации ДНК клеток клона 126-2-F4, полностью разрезался этим ферментом на фрагменты размером 164 и 116 пар нуклеотидов (Рис. 4), что свидетельствует о том, что в геноме клеток клона 126-2-F4 гомологическая рекомбинация и, следовательно, гуманизация экзона IV произошла в обоих аллелях гена Snca. Как и ожидалось, при отсутствии сайта узнавания PvuII в исследуемом фрагменте генома мыши, 280-нуклеотидный продукт ПЦР амплификации ДНК клеток материнского клона 126 не расщеплялся этим ферментом. Частичное расщепление было отмечено для 280-нуклеотидного продукта ПЦР амплификации ДНК клеток клона 126-3-В9, что свидетельствует в пользу сделанного ранее предположения, что это клон произошёл не из одной, а из двух клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ

В связи с прогрессирующим старением популяции, заболеваемость и распространённость болезни Паркинсона (БП) значительно увеличились и будут продолжать расти – таким образом, это серьёзная медико-социальная проблема. Поиск эффективных терапевтических подходов требует использования оптимальных моделей развития патологического процесса при спорадической форме (~90% случаев) БП. Модели, используемые в настоящее время, не соответствуют этой задаче (не гуманизированы или некорректно гуманизированы, отсутствует возможность регуляции) и не могут быть использованы в экспериментальной нейрофармакологии.

Важнейшая роль α-синуклеина в дегенеративной гибели клеток была показана при целом спектре нейродегенеративных заболеваний. Более того, мутации (А53Т и А30Р) были одними из первых обнаруженных генетических коррелятов болезни [14, 15]. Эта находка интенсифицировала изучение молекулярных механизмов α-синуклеин-индуцированной нейропатологии. В настоящее время известно, что при патологических условиях α-синуклеин склонен к образованию структур, богатых β-складками, включая олигомеры, протофибриллы и нерастворимые фибриллы, которые в конечном итоге накапливаются, образуя тельца Леви. Хотя заболевание традиционно связывается с нерастворимыми формами агрегированного α-синуклеина, именно растворимые промежуточные олигомеры характеризуются нейротоксичными эффектами. Было обнаружено, что олигомеры опосредуют аберрантный кальциевый сигналинг, перекисное окисление липидов, оксидативный стресс, митохондриальную дисфункцию и гибель нейронов [16–18]. В in vivo исследованиях было продемонстрировано, что формы α-синуклеина, склонные к образованию олигомеров и ингибирующие образование фибрилл, приводят к гибели дофаминергических нейронов. Напротив, формы, образующие фибриллы, не приводят к потере этих нейронов [19].

В целом, молекулярные каскады, связанные с аберрантной функцией α-синуклеина, продолжают оставаться важнейшей темой изучения для современной нейробиологии [20, 21].

В этой связи, нами был предложен и реализован подход к получению генетически-модифицированных мышей, экспрессирующих патологический гуманизированный α-синуклеин. Для получения данной линии мы использовали стратегию создания генетически-модифицированных животных через CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование эмбриональных стволовых клеток. Полученный клон стволовых клеток может быть использован для реинъекции в бластоцисты, которые затем будут трансплантированы мышам реципиентам для вынашивания генетически-измененных эмбрионов.

Описанная в данной работе генетическая модель позволяет проводить исследования, направленные на прецизионную оценку роли патологического α-синуклеина у мышей.

Так, гуманизация экзонов IV и V позволит оценить фенотипические эффекты патогенного человеческого α-синуклеина на репрезентативной тест-системе. Кроме того, наличие LoxP-сайтов, фланкирующих первый экзон, позволяют осуществлять пространственный и временной контроль экспрессии гуманизированного Snca за счет возможности Cre-индуцированного нокаута гена. Данная особенность позволяет прецизионно изучать эффекты тканеспецифичного нарушения экспрессии белка, предоставляя информацию о его роли в конкретной популяции клеток [22–25]. Более того, возможность индуцирования нокаута во взрослом возрасте позволяет исключить эффект антенатальной адаптации к генетической модификации.

Cre-зависимая индукция нокаута подразумевает, что скрещивание линии, содержащей фланкированный LoxP-сайтами участок гена, с трансгенными животными экспрессирующими Cre-рекомбиназу, приводит к удалению данного участка и утрате функциональной активности гена [18]. На сегодняшний день репертуар Cre-мышей характеризуется огромным разнообразием и отличие между разными штаммами заключается в тканеспецифичности экспрессии рекомбиназы. Более того, существуют линии, в которых проникновение Cre-рекомбиназы в ядро и, соответственно, ее активность зависят от тамоксифена. У данного типа мышей, сайт-специфическая рекомбинация между двумя LoxP-сайтами происходит только после обработки тамоксифеном, что позволяет регулировать экспрессию гена во времени [19].

Параллельно с созданием генетически-модифицированного клона эмбриональных стволовых клеток нашим коллективом также реализуется подход с прямым редактированием мышиных бластоцит. Иными словами, смесь, содержащая ДНК матрицу для гомологичной рекомбинации, мРНК Cas9 и гидовые РНК была микроинъецирована в оплодотворенные яйцеклетки мышей линии CBA×C57Bl6J. После 24 ч инкубации выжившие эмбрионы были трансплантированы в яйцеводы самок-реципиентов, которые служили суррогатными матерями для мутантов. В настоящее время, подобным способом уже было получено первичное потомство мутантных мышей, которое проходит генетический анализ на наличие желаемых нуклеотидных замен.

Полученные результаты принципиально важны не только для понимания развития патологического процесса при альфа-синуклеинопатиях, но и, что ещё важнее, для разработки новых терапевтических подходов, которые позволят остановить распространение агрегационной патологии человеческого α-синуклеина по нервной системе, и валидации этих подходов в доклинических испытаниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования разработана стратегия CRISPR/Cas9-ассистированной гомологической рекомбинации в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши для создания полностью гуманизированного гена Snca, кодирующего α-синуклеин и выполнено редактирование генома клона эмбриональных стволовых клеток мыши с использованием CRISPR технологии.

Синтезированы РНК и ДНК олигонуклеотиды, необходимые для создания РНП комплексов, осуществляющих направленную гомологическую рекомбинацию в Snca локусе генома мыши.

Скрининг клонов, полученных в результате нуклеофекции клеток материнского клона 126 эмбриональных стволовых клеток мыши созданными РНП комплексами, позволил идентифицировать клон 126-2-F4, отвечающий первичным критериям успешной гуманизации обоих аллелей эндогенного гена Snca в геноме эмбриональных стволовых клеток мыши.

Таким образом, разработанный клон клеток может служить для создания линии генетически-модифицированных мышей, служащих тест-системой для патофизиологических и нейрофармакологических исследований, связанных с синуклеинопатиями. При этом до индукции Cre-зависимой рекомбинации данная линия является репрезентативной моделью для исследования биологической роли мутантного Snca. В то же время, после Cre-зависимая активация нокаута позволяет имитировать фармакологическое ингибирование α-синуклеина, что представляет особый интерес для прикладных исследований в нейрофармакологии.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование проведено при финансовой поддержке Министерства науки и образования Российской Федерации (Приложение № 9 к Соглашению о субсидии № 075-15-2021-1346 от 04.10.2021).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Е.А. Патраханов – выделение ДНК, ПЦР-анализ, рестрикционный анализ, написание статьи; В.М. Покровский – написание статьи, культивирование клеток и нуклеофекция; А.Ю. Карагодина – формализация списка литературы, подготовка графического материала; А.М. Краюшкина – формализация списка литературы, подготовка графического материала; Н.С. Жунусов – ПЦР-анализ, написание статьи; А.В. Дейкин – консультация по вопросам методологии исследования; М.В. Корокин – консультация по вопросам методологии исследования, дизайн эксперимента; М.В. Покровский – консультация по вопросам методологии исследования, дизайн эксперимента; Алтухова О.Б. – дизайн эксперимента, написание статьи.

Об авторах

Евгений Александрович Патраханов

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: pateval7@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8415-4562

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Владимир Михайлович Покровский

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: vmpokrovsky08@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3138-2075

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Анастасия Юрьевна Карагодина

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: karagodina75@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9440-5866

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Анастасия Михайловна Краюшкина

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: annkrayushkina98@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6830-3820

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Никита Сергеевич Жунусов

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: nzhunu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1969-3615

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Алексей Васильевич Дейкин

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: deykin@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9960-0863

кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Михаил Викторович Корокин

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: mkorokin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5402-0697

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Михаил Владимирович Покровский

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: mpokrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4478-1091

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии, руководитель НИИ Фармакологии живых систем

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Оксана Борисовна Алтухова

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: altuhova_o@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4674-8797

доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии медицинского института

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85

Список литературы

Дополнительные файлы