РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К СТАНДАРТИЗАЦИИ ЦВЕТКОВ БЕССМЕРТНИКА ПЕСЧАНОГО (HELICHRYSUM ARENARIUM (L.) MOENCH) В РАСТИТЕЛЬНЫХ СМЕСЯХ

Полный текст

В последние годы в мировой фитотерапии наблюдается тенденция к более широкому использованию многокомпонентных лекарственных средств растительного происхождения (МЛСРП). Существующие в настоящее время методики анализа вышеупомянутых фитопрепаратов в большинстве своем не отвечают современным фармакопейным требованиям, они не являются специфическими, не дают возможности проведения идентификации и определения количественного содержания отдельных компонентов смеси. Одно из перспективных направлений дальнейшего совершенствования процедуры стандартизации многокомпонентных фитопрепаратов - использование так называемых «маркерных соединений», или маркеров - веществ, присутствие которых характерно только для определенного лекарственного сырья. Внедрение методик качественного и количественного анализа, основанных на использовании маркеров, имеет не только большое практическое значение, но и существенную научную целесообразность. При этом следует отметить отличие терминов «хемотаксономический маркер» и «маркер для стандартизации растительных смесей». Выбор маркера для анализа определенного компонента в растительной смеси определяется исключительно составом данной смеси. И поэтому один и тот же компонент может быть стандартизирован в растительных смесях, отличающихся по своему составу, по наличию различных биологически активных веществ [2]. Одним из наиболее распространенных компонентов МЛСРП является бессмертник песчаный [6, 7]. Это лекарственное сырье стандартизируется согласно ГФ XI по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на изосалипурпозид [1, 3, 4], который наряду с салипурпозидом, является мажоритарным представителем фракции флавоноидов в растении [3, 4]. Исходя из вышесказанного, целесообразным было бы рассмотреть возможность использования именно данных веществ в качестве маркеров цветков бессмертника песчаного. Однако, исходя из того, что изосалипурпозид и салипурпозид являются гликозидами флавоноидов, существуют определенные проблемы при использовании их в качестве маркера данного сырья, поскольку современные сорбенты, применяемые в жидкостной хроматографии, в большинстве своем лишь ограниченно приспособлены к разделению гликозидов флавоноидов. Исходя из этого, считалось целесообразным предложить для стандартизации цветков бессмертника песчаного в растительных смесях альтернативный маркер - флавоновый агликон апигенин, который в значительной концентрации присутствует в данном растительном сырье и обладает широким спектром биологической активности [5, 8-12]. Цель исследования - разработать методологию использования флавоноида апигенина в качестве маркера цветков бессмертника песчаного при анализе растительных смесей. Материалы и методы Объектами исследования были следующие лекарственные средства и растительные смеси: цветки бессмертника песчаного в пачках по 50 г (производитель ЗАО «Лектравы», г. Житомир, Украина (серии: 101111, 111211, 30212, 40212); цветки бессмертника песчаного в пачках по 20 г (производитель ЗАО ФФ «Виола», г. Запорожье, Украина (серия 231110)); модельная смесь с содержанием цветков бессмертника песчаного: цветков бессмертника песчаного - 1 г, плодов боярышника колючего - 1 г, корней алтея лекарственного - 1 г, корней солодки голой - 1 г, корней цикория - 1 г, корней одуванчика лекарственного - 1 г, соплодий хмеля - 1 г, травы пустырника - 1 г, листьев и цветков боярышника колючего - 1 г, травы зверобоя - 1 г, семян льна - 1 г; модельная смесь без содержания бессмертника песчаного: плодов боярышника колючего - 1 г, корней алтея лекарственного -1 г, корней солодки голой - 1 г, корней цикория - 1 г, корней одуванчика лекарственного - 1 г, соплодий хмеля - 1 г, травы пустырника - 1 г, листьев и цветков боярышника колючего - 1 г, травы зверобоя - 1 г, семян льна - 1 г. Экстракция биологически активных веществ (БАВ) в исследуемых объектах проводилась с использованием 50% этилового спирта. Выбор данного экстрагента обусловлен его универсальностью, так как мы предполагали возможность использования разработанной нами методики для определения других компонентов исследуемой модельной смеси по содержанию веществ-маркеров с отличной от апегинина гидрофобностью. Экстракцию БАВ в исследуемых объектах проводили следующим образом: 1 г (точная навеска) измельченного моносырья или 5 г (точная навеска) растительной смеси вносили в коническую колбу, оборудованную обратным холодильником, добавляли 50 мл 50 % спирта этилового и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 45 минут. После этого экстракт охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через фильтр «красная лента» в мерную колбу объемом 100 мл. Экстракцию проводили еще раз и доводили объем колбы до 100 мл 50 % спиртом этиловым. К 5 мл полученного раствора добавляли такое количество воды, чтобы концентрация спирта этилового составляла 15%, и пропускали полученный образец через предварительно активированный (метанол 5 мл) и промытый 10 мл воды патрон для твердофазной экстракции "Superclean LС-18 SPE Tubes 2 ml" производства фирмы Supelco (США). Патрон промывали 10 мл 15 % спирта этилового. Пробу из патрона вымывали 10 мл спирта метилового. Полученный аналит концентрировали посредством испарения до объема 5 мл и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Хроматографическое изучение исследуемых экстрактов и растворов сравнения апигенина проводили на хроматографе Shimadzu ser. 20, оборудованном диодно-матричным детектором в следующих условиях: колонка Phenomenex Luna C18 (2), размером 250 мм х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм, температура колонки - 350С, длина волны детектирования - 330 нм, скорость потока подвижной фазы - 1 мл/мин, объем инжектирования - 5мкл; подвижная фаза: Таблица 1 - Условия хроматографирования Время хроматографирования (мин.) Элюент А, % Элюент Б, % 0-5 95 5 5-35 95 → 75 5 → 25 35-40 75 25 40-60 75 → 50 25 → 50 60-65 50 → 20 50 → 80 65-70 20 80 70-85 95 5 Элюент А: 0.1 % раствор трифторуксусной кислоты в воде; Элюент Б: 0.1 % раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. При выполнении работы использовали реактивы: ацетонитрил для градиентного хроматографирования (FLUKA, Германия);трифторуксусную кислоту (FLUKA, Германия); спирт этиловый ректифицированный фармакопейного качества; воду бидистиллированную. Результаты и их обсуждение На рисунке 1 представлены хроматограммы раствора сравнения апигенина (А) и экстракта цветков бессмертника песчаного (Б). Как можно видеть, время выхода пика апигенина в указанных выше условиях составляет около 33,3 минуты. Данный пик присутствует как на хроматограмме раствора сравнения апигенина, так и на хроматограмме экстракта цветков бессмертника песчаного. С использованием разработанной методики были проанализированы препараты бессмертника песчаного различных производителей: цветки бессмертника песчаного в пачках по 50 г (производитель: ЗАО «Лектравы», г. Житомир (серии: 101111, 111211, 30212, 40212) и цветки бессмертника песчаного в пачках по 20 г (производитель: ЗАО ФФ «Виола», г. Запорожье (серия 231110)). Содержание апигенина в разных сериях цветков бессмертника песчаного представлено в таблице 2. Согласно данным, представленным в таблице 2, во всех пробах был идентифицирован и количественно определен флавоноид апигенин, содержание которого в исследуемом сырье находится в пределах от 0,1453 ± 0,0068% до 0,1657 ± 0,0085% в пересчете на высушенное сырье. В данных условиях был проведен анализ растительного сырья, которое часто входит в состав многокомпонентных препаратов бессмертника песчаного, а именно плодов боярышника колючего, корней алтея. А Б В Г Рисунок 1 - Хроматограммы исследуемых растворов: А - раствора сравнения апигенина; Б - экстракта цветков бессмертника песчаного; В - экстракта модельной смеси с содержанием цветков бессмертника; Г - экстракта модельной смеси без содержания цветков бессмертника Таблица 2 - Содержание апигенина в исследуемых препаратах бессмертника песчаного № п/п Препарат Производитель, № серии Содержание апигенина (в %) в перерасчете на высушенное сырье 1 Цветки бессмертника песчаного в пачке по 50 г ЗАТ «Лектравы», серия 111211 0,1575±0,0073 2 Цветки бессмертника песчаного в пачке по 50 г ЗАТ «Лектравы», серия 101111 0,1570±0,081 3 Цветки бессмертника песчаного в пачке по 50 г ЗАТ «Лектравы», серия 30212 0,1657±0,0085 4 Цветки бессмертника песчаного в пачке по 50 г ЗАТ «Лектравы», серия 40212 0,1453±0,0068 5 Цветки бессмертника песчаного в пачке по 20 г ЗАТ ФФ «Виола», серия 081011 0,1608±0,0083 В доступной нам литературе данные о наличии апигенина в другом исследуемом нами сырье, кроме бессмертника песчаного, отсутствуют. С целью проверки возможности стандартизации цветков бессмертника песчаного в МЛСРП по наличию и содержанию флавоноида апигенина, была изучена возможность стандартизации цветков бессмертника песчаного в присутствии каждого из исследуемых растительных компонентов. Для подтверждения возможности стандартизации цветков бессмертника песчаного по наличию и содержанию флавоноида апигенина в присутствии указанного выше сырья были изготовлены модельные смеси с содержанием и без содержания цветков бессмертника песчаного. Указанные модельные смеси были проанализированы в условиях разработанной хроматографической методики. Хроматограммы раствора сравнения апигенина, экстракта цветков бессмертника песчаного и экстрактов указанных смесей представлены на рисунке 1. На хроматограммах раствора сравнения апигенина (А), экстракта цветков бессмертника песчаного (Б), растительной модельной смеси с содержанием бессмертника (В) присутствует пик апигенина, время выхода которого составляет 33,3 минуты. На хроматограмме растительной модельной смеси без содержания бессмертника песчаного (Г) данный пик отсутствует. Таким образом, показана возможность качественной и количественной стандартизации цветков бессмертника песчаного в растительных смесях, содержащих плоды боярышника колючего, корни алтея лекарственного, корни солодки голой, корни цикория, корни одуванчика лекарственного, соплодия хмеля, траву пустырника, листья и цветки боярышника колючего, траву зверобоя продырявленного и семена льна по наличию и количественному содержанием флавоноида апигенина. Количественное содержание апигенина в модельной смеси с содержанием бессмертника песчаного в условиях нашего эксперимента составило 0,01516±0,0004% в перерасчете на высушенное сырье. Выводы: 1. С использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии разработана методология стандартизации цветков бессмертника песчаного в растительных смесях. 2. Показана возможность проведения качественной и количественной стандартизации цветков бессмертника песчаного по содержанию флавоноида апигенина в присутствии биологически активных веществ плодов боярышника колючего, корней алтея лекарственного, корней солодки голой, корней цикория, корней одуванчика лекарственного, соплодий хмеля, травы пустырника, листьев и цветков боярышника колючего, травы зверобоя продырявленного и семян льна.

Об авторах

А. В Гудзенко

ГУ «Институт фармакологии и токсикологии НАМН Украины», г. Киев

Email: ganvi@yandex.ru

А. А Цуркан

ГУ «Институт фармакологии и токсикологии НАМН Украины», г. Киев

Список литературы

Дополнительные файлы