MORPHOLOGICAL ANATOMICAL AND PHITOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF SOME ALGAE

Full Text

Актуальность проблемы создания лекарственных препаратов энтеросорбционного действия обусловлена сложной экологической обстановкой, вызванной широким применением атомной энергии, радиоактивных изотопов, тяжелых металлов в различных областях промышленности. Многие известные синтетические и природные антидоты, несмотря на эффективность энтеросорбционного действия по отношению к катионам тяжелых металлов, небезопасны для организма человека в связи со способностью выведения биогенных металлов [9]. К числу наиболее эффективных и безопасных антидотов относят кислые полисахариды, в том числе соли альгиновой кислоты, преимущественно накапливающиеся в бурых и красных водорослях [11]. Однако для внедрения альгинатов в фармацевтическую практику требуются систематические исследования, включая морфолого-анатомическое и фитохимическое изучение растительных источников, что обусловило цель работы. Объектами исследования явились слоевища бурых водорослей (Phaeophytae, Algae): ламинарии сахаристой (Laminaria saсcharina Lamour.) семейства ламинариевые (Laminariaceae), фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.) семейства фукусовые (Fucaceae) и красной водоросли (Rhodophyta): анфельции складчатой (Ahnfeltia plicata Huds.) семейства филлофоровые (Phyllophoraceae). Водоросли собраны в прибрежной полосе Северного бассейна с естественных зарослей на каменистых и скалистых грунтах в заливах Уро - губа и Палкина - губа (г. Мурманск) на глубинах около 0,5 м и 10 м от поверхности моря. Кроме того, заготавливали слоевища, собирая их из свежих штормовых выбросов на берегу. Собирали только крупные двулетние слоевища в период с мая по октябрь. Выбор указанных заливов обусловлен наличием в них чистых и разреженных зарослей с большой площадью плантаций (около 100 га) и эксплуатационным запасом (1-3,6 кг/м2) [8], что определило их перспективу для промышленной переработки. Анализ водорослей проводили путем установления подлинности и изучения доброкачественности сырья. Подлинность слоевищ водорослей определяли по морфолого-анатомическим признакам [5, 2]. Микроскопические препараты с поверхности, просветленные 5% раствором гидроксида натрия, а также поперечные и продольные срезы получали из фиксированных слоевищ водорослей стандартным способом [5]. Препараты окрашивали раствором Люголя [4]; для микрофотографий окрашивание проводили по методике Салазара [7]. Приготовленные препараты слоевищ рассматривали в хлоралгидрате в обычном свете при помощи интерференционно - поляризационного микроскопа «BIOLAM». Микрофотографирование объектов проводили на пленку «Kodak» с помощью фотонасадки МФН-11 и фотоаппарата «Зенит-122» с увеличением фотонасадки х1,6 и х2,5, объектива х10 и х20. Товароведческие показатели цельных водорослей определяли по ГФ XI [5]. Обнаружение действующих веществ в водорослях проводили по качественным (цветным и осадительным) реакциям: - йода - с крахмалом в присутствии сульфаминовой кислоты [5], - полисахаридов - со спиртом 95% [5], - восстанавливающих сахаров - с реактивом Фелинга [5], - альгиновых кислот - с карбазолом [14], - маннита - с сульфатом меди (II) в щелочной среде [2], - аминокислот - с нингидрином [3], - агара - по образованию студня при экстракции гидроксидом натрия [2]. Количественное содержание действующих веществ в водорослях после выделения фракций [10, 12] устанавливали методами: йода - йодиметрии [2, 5], полисахаридов - гравиметрии по массе полисахаридов, нерастворимых в спирте 95% [5], - альгиновых кислот - алкалиметрии [1, 2], - пентозанов - гравиметрии по массе фурфурфлороглюцида [7], - восстанавливающих сахаров - фотометрии по реакции взаимодействия с кислотой пикриновой (ФС 42-2462-87 «Ламинарид»), - клетчатки (альгулезы) - гравиметрии по Княгиничеву [7], - агара - гравиметрии по массе студня [2], - маннита - фотометрии по реакции взаимодействия с сульфатом меди (II) [2], - липидов - гравиметрии по Рушковскому [7], - минеральных элементов - полуколичественно эмиссионным спектрографическим анализом на спектрографе СТЭ-1, - азотистых веществ - по Къельдалю [3], - белков - по Къельдалю [3]. Результаты количественного анализа обрабатывали статистическими методами [5] с использованием параметрического критерия Стьюдента (при n=6) путем определения средней арифметической величины, ее стандартной ошибки и относительной погрешности анализа. Относительная погрешность количественных определений не превышает 5%. Исследуемые водоросли резко отличаются друг от друга следующими морфологическими признаками. Слоевища ламинарии сахаристой представляют собой плотные, кожистые морщинистые листовидные пластины длиной 20-50 см, шириной 5-40 см, без стволиков, края пластин волнистые. По обеим сторонам пластин имеются выпуклые и вогнутые вздутия или узкие гофрированные полосы. Слоевища имеют цвет от светло-оливкового до темно-оливкового, своеобразный запах, солоноватый вкус. Сухие пластины снаружи покрыты белым налетом солей. Слоевища фукуса пузырчатого сильно разветвлены, в основном дихотомически. Стволики короткие, цилиндрические, переходят в плоские, сильно разветвленные ветви. Верхние части ветвей пластинчатые, линейные, цельнокрайные, с выпуклой, хорошо заметной срединной продольной жилкой. По обеим сторонам жилки расположены парные воздушные пузырьки округлой или овальной формы. Слоевища фукуса имеют зеленовато-коричневый цвет, солоноватый вкус, без запаха. Слоевища анфельции складчатой имеют вид дихотомически неправильно разветвленных тонких шнуров. Слоевища очень жесткие, роговидной консистенции, коричневого цвета, слизистого вкуса, без запаха. Определены анатомо-диагностические признаки, позволяющие установить подлинность водорослей в измельченном состоянии. В строении ламинарии сахаристой нет ясной дифференциации на ткани. При микроскопическом рассмотрении пластины ламинарии с поверхности (рис. 1) видны многоугольные, мелкие, плотно соединенные, почти квадратные клетки с толстыми стенками, образующие наружный слой слоевища, устьица отсутствуют. Сквозь клетки просвечивают многочисленные округлые слизистые вместилища. Глубже видны более крупные, рыхло расположенные, бесцветные неровные клетки промежуточного слоя. Рисунок 1 - Поверхностный препарат слоевища ламинарии сахаристой На продольном срезе слоевища ламинарии (рис. 2) можно различить три обособленных комплекса клеток - эпидермальный слой, состоящий из окрашенных клеток, промежуточный слой из крупных бесцветных клеток и сердцевину. Рисунок 2 - Продольный срез слоевища ламинарии сахаристой Сердцевина образована неплотно расположенными клеточными нитями. Более короткие нити идут поперек слоевища от клеток промежуточного слоя. Длинные трубчатые нити вытянуты вдоль продольной оси слоевища; около поперечных перегородок местами они шаровидно-вздутые. Ни кристаллов, ни волосков нет. В эпидермальном слое и промежуточном слое (рис. 3) расположены слизистые каналы, образующие в слоевище сеть. Рисунок 3 - Поперечный срез слоевища ламинарии сахаристой При микроскопическом рассмотрении препарата с поверхности слоевищ фукуса пузырчатого (рис. 4) видны окрашенные толстостенные, округлой формы клетки поверхностного слоя. Рисунок 4 - Поверхностный препарат слоевища фукуса пузырчатого На поперечном срезе слоевища фукуса (рис. 5), как и у ламинарии, таллом дифференцирован на эпидермальный слой, промежуточный слой и сердцевину. Эпидермальный слой образован клетками с пигментами, промежуточный слой - бесцветными клетками. Трубчатые нити и слизистые каналы отсутствуют. Рисунок 5 - Поперечный срез слоевища фукуса пузырчатого Эпидермальный и промежуточный слои Сердцевина образована рыхло расположенными короткими клеточными нитями (рис. 6). Рисунок 6 - Поперечный срез слоевища фукуса пузырчатого. Сердцевина и промежуточный слой При микроскопическом рассмотрении препарата с поверхности слоевищ анфельции складчатой (рис. 7) видны нити плотного периферического слоя, которые имеют довольно толстые оболочки и погружены в студенистое вещество, играющее роль скрепляющего материала. Рисунок 7 - Поверхностный препарат слоевища анфельции складчатой Слоевище анфельции имеет паренхимный тип организации. На поперечном срезе таллома анфельции (рис. 8) можно выделить ассимилирующий эпидермальный слой и сердцевину. Рисунок 8 - Поперечный срез слоевища анфельции складчатой Эпидермальный слой образован мелкими, плотно соединенными клетками, расположенными в 10-12 вертикальных рядов. Внутренняя часть слоевища сложена из крупных бесцветных клеток. Таким образом, анатомическими признаками слоевищ, имеющими диагностическое значение, являются: длинные трубчатые нити и слизистые каналы у ламинарии (отличие от талломов фукуса), наличие дополнительного (третьего) комплекса клеток - промежуточного слоя - у ламинарии и фукуса (отличие от талломов анфельции). Эти признаки позволяют отличить друг от друга различные водоросли, если они находятся в измельченном состоянии. В связи с тем, что из исследуемых водорослей только ламинария сахаристая является лекарственным растением, для оценки доброкачественности других водорослей, как потенциальных источников полисахаридов, использованы фармакопейные нормы, разработанные для ламинарии [5] (табл. 1). Таблица 1 - Товароведческие показатели водорослей Товароведческие показатели Нормы [5] Ламинария Фукус Анфельция Влажность, % ≤ 15 9,7±0,4 13,7±0,6 12,3±0,6 Зола общая, % ≤ 40 19,0±1,5 15,1±1,2 17,1±1,5 Слоевища с пожелтевшими краями, % ≤ 10 7,2±0,3 5,8±0,3 4,5±0,2 Органические примеси Не допустимы - - - Минеральные примеси, % ≤ 0,5 0,2±0,01 0,1±0,01 0,3±0,01 Песок, % ≤ 0,2 0,1±0,01 0,1±0,01 0,4±0,03 Цельные слоевища толщиной менее 0,03 см, % ≤ 15 6,8±0,3 - - По нормам доброкачественности, установленным для слоевищ ламинарии, фукус и анфельция удовлетворяют требованиям ГФ ХI [5], кроме показателя «Песок» для слоевищ анфельции. Показатели качественного состава действующих веществ водорослей приведены в табл. 2. Таблица 2 - Качественный состав активных ингредиентов водорослей Вещества Ламинария Фукус Анфельция Йод + + + Медленное развитие окраски Полисахариды + + + Восстанавливающие сахара + + + Альгиновые кислоты + + + Маннит + + + Аминокислоты + + + Агар - - + Примечания: «+» - реакция положительная; «-» - реакция отрицательная. Таким образом, водоросли примерно идентичны по качественному составу, за исключением отсутствия агара в бурых водорослях и относительно низкого содержания йода в слоевищах фукуса и анфельции. Показатели количественного содержания действующих веществ в различных водорослях приведены в табл. 3. Таблица 3 - Количественные показатели действующих веществ водорослей Показатели и нормы [5] Ламинария Фукус Анфельция 1 2 3 4 Йод, % (≥ 0,1%) 0,36±0,02 0,08±0,01 0,20±0,01 Полисахариды, % (≥ 8%) 50,9±3,1 40,5±2,2 37,3±1,7 Альгиновые кислоты, % 29,9±1,5 21,5±1,2 5,2±0,4 Пентозаны, % 8,5±0,5 8,1±0,5 2,9±0,1 Восстанавливающие сахара, % 22,7±1,4 18,3±1,1 19,5±1,0 1 2 3 4 Клетчатка (альгулеза), % 4,9±0,3 6,4±0,4 3,4±0,2 Агар, % - - 25,6±1,3 Маннит, % 18,5±0,9 12,4±0,6 7,5±0,4 Азотистые вещества, % 2,0±0,1 1,8±0,2 1,6±0,1 Белки, % 12,5±0,8 11,3±0,6 10,0±0,6 Липиды, % 2,0±0,1 2,1±0,1 1,3±0,1 Макро- и микроэлементы, %: Натрий 3,3 2,5 2,1 Калий 3,1 2,4 2,1 Магний 0,9 0,8 0,5 Кальций 1,1 0,9 0,5 Стронций 0,07 0,05 0,03 Алюминий 0,2 0,2 0,3 Кремний 1,2 1,3 2,0 Фосфор 0,7 0,7 0,7 Свинец 0,0003 0,0002 0,0003 Медь 0,05 0,04 0,04 Серебро < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 Цинк 0,0004 0,0004 0,0004 Титан 0,2 0,2 0,2 Цирконий 0,03 0,03 0,03 Хром 0,0004 0,0002 0,0002 Марганец 0,8 0,8 0,3 Железо 1,1 1,0 2,9 Кобальт 0,0004 0,0003 0,0001 Никель 0,02 0,01 0,01 Лантаноиды и актиноиды < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 По приведенным данным можно сделать следующие заключения. Наибольшее содержание альгиновых кислот, маннита, йода, белков наблюдается в слоевищах ламинарии. Показатели минерального состава свидетельствуют об активном накоплении в водорослях натрия, калия, кальция, железа, магния, марганца. Порядок изменения концентраций макро- и микроэлементов в различных водорослях примерно идентичен: - в слоевищах ламинарии: Na>K>Si>Ca=Fe>Mg>Mn>P>Al=Тi>Sr>Cu>Zr>Ni>Co=Cr; - в слоевищах фукуса: Na>K>Si>Fe>Ca>Mg=Mn>P>Al=Ti>Sr>Cu>Zr>Ni>Co>Cr; - в слоевищах анфельции: Fe>Na=K>Si>P>Ca=Mg>Al=Mn>Ti>Cu>Sr=Zr>Ni>Cr>Co. Железо, марганец, интенсивно извлекаемые водорослями, играют определяющую роль в синтезе белков [13]. Достоверная связь при 99% уровне вероятности прослеживается между содержанием в водорослях белков (Сб, %) и марганца (СMn, %), для 95% уровня вероятности - между содержанием белков и железа (CFe, %); уравнения регрессии имеют вид: Сб = -0,042 · СMn + 7,312 (1) Сб = -3,853 · CFe + 8,460 (2) Накопление макро- и микроэлементов в высоких концентрациях в слоевищах водорослей, богатых полиуронидами, косвенно свидетельствует о выраженной связывающей способности полиуронидов. Активное накопление металлов в слоевищах водорослей на примере ламинарии обусловлено богатым минеральным составом морской воды [13] (табл. 4). Таблица 4 - Сравнительные данные минерального состава ламинарии и морской воды Ионы металлов Морская вода, мг % Ламинария, мг % Коэффициент накопления катионов металлов в ламинарии Натрий 8,7·102 (3,30,1)·103 3,8 Магний 89 (9,00,4)·102 10,1 Кальций 3,8 (1,10,04)·103 2,9·102 Марганец 3,0·10-2 (8,00,3)·102 2,7·104 Железо 0,3 (1,10,04)·103 3,7·103 Стронций 4,4 702,8 16 Медь 0,125 502,0 4,0·102 Кобальт 0,35 0,40,02 1,1 Приведенные данные позволяют сопоставить водоросли и морскую воду по содержанию макро- и микроэлементов: - ламинария: Na > Ca = Fe > Mg > Mn > Sr > Cu > Co; - морская вода: Na > Mg > Sr > Ca > Co > Fe > Cu > Mn. Жизненная необходимость ламинарии в ионах марганца, железа, меди, кальция обусловлена тем, что при содержании катионов указанных металлов в воде в меньших количествах, чем ионов натрия, магния, поглощение первых из воды происходит в 102-103 раз интенсивнее поглощения катионов натрия и магния. Заметные изменения в содержании активных компонентов в водорослях происходят в течение весенне-осеннего сезона. Так, максимальное содержание основных групп действующих веществ наблюдается в слоевищах ламинарии, собранных в период с сентября по октябрь (рис. 9). Рисунок 9 - Сезонные колебания содержания в ламинарии: 1 - альгиновых кислот; 2 - минеральных веществ; 3 - белков; 4 - маннита Накопление альгинатов в различных частях водорослей в зависимости от глубины их добычи на примере ламинарии (рис. 10) происходит в разной мере. Рисунок 10 - Содержание альгинатов в слоевищах ламинарии: I - пластины; II - стволики; 1 - штормовые водоросли; 2 - водоросли, добытые на глубине 0,5 м от поверхности моря; 3 - водоросли, добытые на глубине 10 м от поверхности моря В стволиках ламинарии по сравнению с пластинами концентрация альгинатов выше в пределах 6%. Резкие отличия в содержании альгинатов наблюдаются в слоевищах ламинарии в зависимости от глубины их добычи: слоевища, залегающие на глубине 10 м от поверхности моря, в 1,5-2 раза больше содержат альгинатов, чем талломы, произрастающие у поверхности моря; наиболее бедны альгинатами водоросли, выброшенные морем на берег. Эти различия связаны с тем, что глубинные воды более богаты биогенными веществами, чем поверхностные воды [6]. Кроме перечисленных факторов, качество водорослей зависит от режимов сушки и хранения. Более высокая концентрация полисахаридов (в пределах 7%) отмечается при сушке водорослей в естественных условиях по сравнению с искусственной сушкой, однако, в первом случае сырье характеризуется высоким содержанием гнилых и плесневелых слоевищ (17%). Наилучшая сохранность водорослей обеспечивается при упаковке в водонепроницаемые бумажные пакеты и хранении в сухом помещении; в этих условиях сырье с содержанием полисахаридов не менее 40% может храниться до 3 лет [5]. Выводы 1. Установлены основные морфологические признаки цельных слоевищ бурых водорослей (ламинарии сахаристой, фукуса пузырчатого) и красной водоросли (анфельции складчатой). 2. Выявлены диагностически значимые признаки измельченных слоевищ водорослей: длинные трубчатые нити и слизистые каналы у ламинарии, наличие промежуточного слоя у ламинарии и фукуса. 3. По товароведческим показателям, установленным для слоевищ ламинарии, фукус и анфельция удовлетворяют требованиям ГФ ХI, кроме слоевищ анфельции по содержанию песка. 4. Установлен идентичный качественный состав водорослей (полисахариды, альгиновые кислоты, восстанавливающие сахара, йод, маннит, аминокислоты), кроме наличия агара только в анфельции. 5. Определено количественное содержание действующих веществ в водорослях (полисахариды, альгиновые кислоты, восстанавливающие сахара, пентозаны, йод, клетчатка, маннит, белки, липиды, агар). В ламинарии, по сравнению с фукусом и анфельцией, отмечена более высокая концентрация: альгиновых кислот (в 1,4 и 5,75 раз), полисахаридов (в 1,3 и 1,4 раз), йода (в 4,5 и 1,8 раз), маннита (в 1,5 и 2,5 раз). Максимальное накопление активных веществ в ламинарии наблюдается в слоевищах, залегающих на глубине 10 м от поверхности моря, в период с сентября по октябрь. 6. Установлено активное накопление в водорослях натрия, калия, кальция, железа, магния, марганца, обусловленное соответствующим минеральным составом морской воды. Выведены математические уравнения регрессии между содержанием в водорослях белков и марганца (уровень вероятности 99%), белков и железа (уровень вероятности 95%). 7. Естественные условия сушки и хранение сырья без доступа влаги обеспечивают концентрацию полисахаридов не менее 40% в течение 3 лет.

About the authors

N. S Kaysheva

Pyatigorsk Medical-Pharmaceutical Institute - branch of the SGEI HPT VolgSMU of Ministry of Health of Russia

Email: caisheva2010@yandex.ru

M. N Arkhipova

Pyatigorsk Medical-Pharmaceutical Institute - branch of the SGEI HPT VolgSMU of Ministry of Health of Russia

A. S Kayshev

Interregional department of Russian Alcohol Control in the Northern Caucasus Federal District

References

Supplementary files