РАЗРАБОТКА МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРИМЕСЕЙ В СУБСТАНЦИИ ГЛУТАТИОНА ВОССТАНОВЛЕННОГО


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Глутатион (γ-L-глутамил-L-цистеинилглицин) является важнейшим низкомолекулярным внутриклеточным тиольным трипептидом, состоящим из трёх аминокислот – глицина, цистеина и кислоты глутаминовой. Поскольку в отечественной фармакопее отсутствует нормативная документация на глутатион, разработка фармакопейной статьи на указанную субстанцию является актуальной проблемой.Цель. Разработка методик определения посторонних специфических примесей в глутатионе.Материалы и методы. В качестве объектов исследования использованы субстанция – глутатион восстановленный (CAS №70-18-8, EC №2007254, Applichem, Германия), содержащий примеси и стандартный образец глутатиона восстановленного – Sigma Aldrich (Япония). Анализ проводился с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращённо-фазном варианте и тонкослойной хроматографии. Хроматографирование с помощью ОФ ВЭЖХ проводили после предварительной дериватизации глутатиона и его специфических примесей дансилхлоридом. Поскольку специфические примеси в глутатионе представляют собой дипептиды и аминокислоты, следовательно, они также как и сам глутатион способны вступать в реакцию с дансилхлоридом с образованием дансильных производных, которые далее можно определить в ходе хроматографического разделения.Результаты. В результате хроматографирования методом ОФ ВЭЖХ дериватизированного дансилхлоридом глутатиона установлено, что данная реакция позволяет обнаружить примеси в нём. Дериваты глутатиона хорошо разделяются при хроматографировании методом ОФ ВЭЖХ и имеют отличающиеся максимумы поглощения. Дериват глутатиона имел максимум поглощения при λmax = 284 нм. Дериваты, принадлежащие специфическим примесям глутатиона, поглощают при λmax = 288 нм и λmax = 296 нм. Данные полученные с помощью ОФ ВЭЖХ были подтверждены методом ТСХ в системе изо-пропанол – вода 2:1. Обнаружено три компонента, один из которых соответствует глутатиону, два остальных – примеси.Заключение. Разработаны методики определения примесей в субстанции глутатиона с помощью методов ОФ ВЭЖХ с предварительной дериватизацией дансилхлоридом и ТСХ с детекцией нингидрином. Сравнительный анализ полученных данных позволяют утверждать, что метод ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией является более достоверным, поскольку более чувствителен к примесям, к тому же даёт возможность изучить УФ-профили примесных компонентов, чем метод ТСХ. Поэтому для обнаружения примесей в субстанции глутатиона более предпочтительно использовать ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией. Результаты настоящего исследования можно рекомендовать для включения в нормативную документацию на субстанцию глутатиона в раздел «Примеси».

Об авторах

К. А. Алексеева

ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России

Email: 740890@bsu.edu.ru

Д. И. Писарев

ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России

Email: pisarev@bsu.edu.ru

А. Ю. Малютина

ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России

Email: malyutina_a@bsu.edu.ru

Н. Н. Бойко

ФГАОУ ВО НИУ «Белгородский государственный университет» Минобрнауки России

Email: boykoniknik@gmail.com

Список литературы

  1. Deponte M. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. – 2013. – Т. 1830, №5. – С. 3217–3266. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2012.09.018.
  2. Kojer K., Bien M., Gangel H., Morgan B., Dick T.P., Riemer J., Glutathione redox potential in the mitochondrial intermembrane space is linked to the cytosol and impacts the Mia40 redox state // The EMBO Journal. – 2012. – Т. 31, №14. – С. 3169–3182. doi: 10.1038/emboj.2012.165.
  3. Mieyal J.J., Gallogly M.M., Qanungo S., Sabens E.A., Shelton M.D., Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein S-glutathionylation // Antioxid Redox Signal. – 2008. – Т. 10, №11. – С. 1941–1988. DOI: https://doi.org/10.1089/ars.2008.2089.
  4. Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowsey I.R. Glutathione transferases // Annu Rev Pharmacol Toxicol. – 2005. – Т. 45. – С. 51–88. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.pharmtox.45.120403.095857.
  5. Yu B.P., Chung H.Y. Adaptive mechanisms to oxidative stress during aging // Mech Ageing Dev. –2006. – Т. 127, №5. – С. 436–443. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mad.2006.01.023.
  6. Forman H.J., Zhang H., Rinna A. Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis // Mol Aspects Med. – 2009. – Т. 30, №1–2. – С. 1–12. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mam.2008.08.006.
  7. Boyland E., Chasseaud L.F. The role of glutathione and glutathione S-transferases in mercapturic acid biosynthesis // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. – 1969. – Т. 32. – С. 173–219.
  8. Zimmermann A.K., Loucks F.A., Schroeder E.K., Bouchard R.J., Tyler K.L., Linseman D.A. Glutathione binding to the Bcl-2 homology-3 domain groove: a molecular basis for BCL-2 antioxidant function at mitochondria // J Biol Chem.. – 2007. – Т. 282, №40. – С. 29296–29304. doi: 10.1074/jbc.M702853200.
  9. Woodbridge J.E. Princeton N.J. Патент США: US3864085A. Glutathione reagent and test method. Дата: 31.10.1973.
  10. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch Biochem Biophys. – 1959. – Т. 82, №1. – С. 70–77. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6.
  11. Agrawal S.B., Agrawal M., Lee E.H., Kramert G.F., Pillai P. Changes in polyamine and glutathione contents of a green algae, Chlorogonium elongatum (Dang) France exposed to mercury // Environ. Exp. Botany. – 1992. – Т. 32, №2. – C. 145–151. DOI: https://doi.org/10.1016/0098-8472(92)90039-5.
  12. Hissin P.J., Hilf R. A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues // Anal Biochem. – 1976. – Т. 74, №1. – С. 214–226. DOI: https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90326-2.
  13. Sutariya V., Wehrung D., Geldenhuys W.J. Development and validation of a novel RP-HPLC method for the analysis of reduced glutathione // J. Chromatogr. Sci. – 2012. – Т. 50, №3. – С. 271–276. DOI: https://doi.org/10.1093/chromsci/bmr055.
  14. Di Pietra A.M., Gotti R., Bonazzi D., Andrisano V., Cavrini V. HPLC determination of glutathione and L-cysteine in pharmaceuticals after derivatization with ethacrynic acid // J Pharm Biomed Anal. – 1994. – Т. 12, №1. – С. 91–98. DOI: https://doi.org/10.1016/0731-7085(94)80015-4.
  15. Giustarini D., Dalle-Donne I., Milzani A., Fanti P., Rossi R. Analysis of GSH and GSSG after derivatization with N-ethylmaleimide // Nat Protoc. – 2013. – Т. 8, №9. – С. 1660–1669. doi: 10.1038/nprot.2013.095.
  16. Iwasaki Y., Saito Y., Nakano Y., Mochizuki K., Sakata O., Ito R., Saito K., Nakazawa H. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples // J Chromatogr. B Analyt Technol Biomed LifeSci. – 2009. – Т. 877, №28. – С. 309–3317. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2009.07.001
  17. Lee S.G., Yim J., Lim Y., Kim J.H. Validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to measure oxidized and reduced forms of glutathione in whole blood and verification in a mouse model as an indicator of oxidative stress // J. Chromatogr. B. – 2016. – Т. 1019. – С. 45–50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.10.041.
  18. Gawlik M., Krzyżanowska W., Gawlik M.B., Filip M. Optimization of determination of reduced and oxidized glutathione in rat striatum by HPLC method with fluorescence detection and pre-column derivatization // Acta Chromatographica. – 2014. – Т. 26, №2. – С. 335–345. DOI: https://doi.org/10.1556/AChrom.26.2014.2.10.
  19. Bald E., Głowacki R. Analysis of saliva for glutathione and metabolically related thiols by liquid chromatography with ultraviolet detection // Amino Acids. – 2005. – Т. 28, №4. – С. 431–433. doi: 10.1007/s00726-005-0195-8.
  20. Safavi A., Maleki N., Farjami E., Mahyari F.A. Simultaneous Electrochemical Determination of Glutathione and Glutathione Disulfide at a Nanoscale Copper Hydroxide Composite Carbon Ionic Liquid Electrode // Anal Chem. – 2009. – Т. 81, №18. – С. 7538–7543. doi: 10.1021/ac900501j.
  21. Raoof J.B., Ojani R., Karimi-Maleh H. Electrocatalytic oxidation of glutathione at carbon paste electrode modified with 2,7-bis (ferrocenyl ethyl) fluoren-9-one: application as a voltammetric sensor // J Appl Electrochem. – 2009. – Т. 39, №8. – С. 1169–1175. DOI: https://doi.org/10.1007/s10800-009-9781-x
  22. British Pharmacopoeia. Т.1. Her Majetys stationary office. – Лондон, 2005. – C. 924–926.
  23. European Pharmacopoeia – European Directorate for Quality of Medicines and Health care. Strasbourg, France, 2004. – С. 2727.
  24. Japanese Pharmacopoeia. 17th edition. English version. The Ministry of health, labour and welfare. 2062 с.
  25. Алексеева К.А., Писарев Д.И., Новиков О.О., Малютина А.Ю. Разработка методики предколоночной дериватизации глутатиона восстановленного 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианатом для определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Фармация и фармакология. – 2018. – Т. 6, №3. – С. 229–240. doi: 10.19163/2307-9266-2018-6-3-229-240.
  26. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии; АН ЛатвССР, Ин-т органич. синтеза. – Рига: Зинатне, 1988. – 390 с.
  27. Шаршунова М. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. В 2-х ч. / М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец. пер. со словац. – М.: Мир, 1980.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Алексеева К.А., Писарев Д.И., Малютина А.Ю., Бойко Н.Н., 2018

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС 77 - 67428 от 13.10.2016. 

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах