Изучение антиатеросклеротической и эндотелиопротективной активности пептидных агонистов гетерорецептора EPOR/CD131

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Атеросклероз – хроническое заболевание стенок сосудов, характеризующееся асептическим воспалением, нарушением перфузии органов и тканей, склонностью к тромбообразованию и прогрессирующей с возрастом дисфункцией сосудистой стенки. В 1912 г. на заседании Общества русских врачей в Санкт-Петербурге крупный российский ученый Н.Н. Аничков, именем которого в настоящее время названа премия за самые выдающиеся исследования в области атеросклероза, совместно с С.С. Халатовым представил первые результаты своих революционных исследований, касающихся выявлению связи между алиментарными факторами, уровнем холестерина крови и атеросклерозом. Со времен этих работ, атеросклероз рассматривается, в первую очередь, как заболевание, вызванное накоплением в сосудистой стенке холестерина [1]. Эта концепция до сих пор является ключевой для снижения кардиоваскулярного риска. Тем не менее, сейчас общепризнано, что дислипидемия является единственной причиной атеросклероза только при семейных гиперхолестеринемиях. В других случаях атеросклероз – это результат совокупного действия ряда патогенетических факторов, среди которых выделяют эндотелиальную дисфункции [2], гемодинамическую перегрузку [3–5], миграцию гладкомышечных клеток [6], хроническое стерильное воспаление сосудов и ряд других процессов.

Отдельное место в патобиологии атеросклероза отводится нарушению работы митохондрий [7]. Митохондрии являются главным генератором активных форм кислорода (АФК) в клетке. Например, известно, что, проходя по окислительно-восстановительному градиенту электронно-транспортной цепи, 1–3% электронов преждевременно реагируют с кислородом в комплексах I и III с образованием супероксида и других типов АФК [8]. При разных патологических состояниях, включая гипоксию и воспаление, их количество может увеличиваться. Кроме того, митохондрии выполняют в сосудистых клетках не только метаболическую, но также важную регуляторную и сигнальную роль [8].

Немаловажно также, что дисфункция митохондрий в других клетках, включая нейроны и кардиомиоциты приводит к снижению их резистентности к ишемии, что выражается в увеличении летальных исходов на фоне мозгового инсульта, окклюзии коронарных артерий, инфаркте почек и других органов. В связи с обозначенными сведениями, патогенетический каскад, объединяющий митохондриальную дисфункцию и атеросклероз, становится актуальной мишенью для фармакологического воздействия.

В качестве перспективного терапевтического подхода для воздействия на митохондриальное звено при поражении сосудистой стенки, могут быть рассмотрены агонисты гетеродимерного рецептора эритропоэтина EPOR/CD131. Первым препаратом из данной группы был 11-аминокислотный пептид pHBSP (pyroglutamate helix B surface peptide), открытый в 2008 г. научной группой под руководством Майкла Брайнса [9]. Прежде мы продемонстрировали, что данный пептид оказывает выраженное эндотелиопротективное действие при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс [10, 11]. Однако в этом исследовании нами также был выявлен побочный эффект в виде протромботического действия. В этой связи мы попробовали модернизировать данную молекулу путем добавления трипептидных мотивов, обладающих антиагрегантным действием. В результате было получено два принципиально новых соединения, сочетающих в себе цитопротективный [12] и антиагрегантный (собственные неопубликованные данные) эффекты. Здесь мы сообщаем о результатах изучения антиатеросклеротической активности этих соединений.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ – оценка антиатеросклеротических и эндотелиопротективных свойств коротких пептидных производных эритропоэтина.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и диета

В качестве основной тест-системы были использованы мыши C57Bl/6J. Животные были переданы в дар ЦКП Института биологии гена РАН и содержались в центре доклинических исследований НИИ Фармакологии живых систем. После прохождения 14-дневного карантинного режима мыши были стратифицированы по массе и рассажены в отдельные конвенциональные клетки в соответствии с принадлежностью к экспериментальной группе. До и во время выполнения исследования животные содержались в помещениях с искусственным освещением (режим 12 ч./12 ч.) при температуре 21–23 °С, влажности 38–50% и имели свободный доступ к корму и воде. Номер заключения независимого этического комитета 06-09/02-1 от 16.12.2019 г.

В исследование было включено 16 самцов дикого типа и 52 самца (25–30 г) с генотипом Polg-D257A/Cdh5-CRE на фоне C57Bl/6J. Генотип ассоциирован с эндотелиоспецифичным нокдауном гена Polg, кодирующего фермент полимераза гамма. Нарушения в работе данного фермента приводят к развитию митохондриальной дисфункции [13, 14]. Данная линия была создана в ЦКП «Геномное редактирование» ИБГ РАН для изучения эффектов оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции. Линия характеризуется наличием мутантной формы гена Polg под контролем CAG промотора и стоп-кассеты, фланкированной LoxP-сайтами (неопубликованные данные), принципиальное устройство конструкции описано в статье [15]. После скрещивания с мышами Cdh5-CRE происходит эндотелиоспецифичное удаление стоп-кассеты и гиперэкспрессия мутантной формы Polg в эндотелии.

За 2 недели до операции животных помещали на западную диету с 2% содержанием холестерина.

При работе соблюдались требования Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 24.06.1998 г., правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и ГОСТ Р 53434-2009), директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС), правил Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) и Правил лaбoрaтoрнoй прaктики, принятых в Российcкoй Фeдeрaции (прикaз MЗ РФ № 708 oт 29.08.2010 г.).

Хирургические процедуры

Операцию выполняли на подогревочном столике под препаративным микроскопом. Под наркозом золазепам (Virbac, Россия) 2,5 мг/100 г + ксилазин (Биогель, Беларусь) 2 мг/100 г внутрибрюшинно животным после выполнения срединной лапаротомии выделяли аорту на уровне между бифуркацией и отхождением почечных артерий.

На обнаженный сосуд накладывали две клипсы, надсекали между ними артериальную стенку и вводили начальный участок баллонного катетера (рис. 1). Затем снимали проксимальную клипсу и продвигали катетер в краниальном направлении на 10 мм.

 

Рисунок 1 – Схематическое изображение и размеры баллонного катетера

 

После этого на 40 секунд нагнетали в баллон катетера воду, раздувая его до диаметра 1,5 мм при давлении 10 бар. Наконец, катетер извлекали, на разрез в аорте накладывали три шва, рану ушивали. После операции животных помещали в индивидуальные клетки с простерилизованным бумажным подстилом и наблюдали за ними до пробуждения.

Для облегчения послеоперационного болевого синдрома в течение 3 дней с момента операции животные получали Метамизол натрия (Фармстандарт-Лексредства (Россия) с питьевой водой ad libitum в концентрации 50 мг вещества на 100 мл воды [16, 17].

Дизайн эксперимента и введение препаратов

Животные с генотипом Polg-^D257A Cdh5-CRE были разделены 5 равных групп:

1) Интактные – животные без моделирования патологии и без введения препаратов (n=12);

2) Контроль – животные с моделированием патологии (баллонная травма + западная диета с повышенным содержанием холестерина), которым, начиная с 1-го дня, вводили воду для инъекций подкожно в объеме 0,1 мл/10 г (n=12);

3) P-αB – животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид P-αB (ООО «Фармапарк») подкожно в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 27 дней (суммарная доза 180 мкг/кг, n=12);

4) P-αB1 – животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид P-aB1 (ООО «Фармапарк») подкожно в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 27 дней (суммарная доза 180 мкг/кг, n=12);

5) P-αB3 – животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня вводили пептид P-aB3 (ООО «Фармапарк») подкожно в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня течение 27 дней (суммарная доза 180 мкг/кг, n=12) (табл. 1).

 

Таблица 1 – Аминокислотная последовательность исследуемых соединений

Лабораторный шифр	Аминокислотная последовательность
P-αB	____QEQLERALNSS
P-αB1	RGDQEQLERALNSS
P-αB3	KGDQEQLERALNSS

 

Измерение площади атеросклеротической бляшки

Четверым животным из каждой группы было выполнено макроскопическое изучение атеросклеротических бляшек аорты. Вкратце, на 28-й день после моделирования баллонной травмы животных эвтаназировали передозировкой наркоза (золазепам 10 мг/100 г внутрибрюшинно) и аккуратно извлекали брюшную аорту от бифуркации до участка на уровне диафрагмы.

Затем препараты продольно рассекали, расправляли на пенопластовой подложке, промывали 50% раствором этанола и погружали в раствор Oil Red O на 15 минут. После этого препараты промывали дистиллированной водой и делали цифровые фотоснимки. На полученных снимках с использованием программы imageJ рассчитывали отношение площади атеросклеротической бляшки (окрашенной красным) к интактной ткани.

Количественная ПЦР

У остальных животных после эвтаназии ткань аорты в области нанесения баллонного повреждения забирали, гомогенизировали и 10 минут инкубировали при 37 °С в растворе «Extract RNA». После лизирования образца в реагенте его подвергли хлороформной чистке, надосадочную пробу собирали и промывали изопропиловым спиртом и 70%-ным этиловым спиртом. Концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре IMPLENNanoPhotometer® и доводили до концентрации 300 нг/мкл.

Обратную транскрипцию проводили с использованием набора MMLVRTSK021 в соответствии с протоколом фирмы-производителя (Evrogen). Смесь аккуратно перемешивали и в течение 2 минут прогревали при 70 °C для расплавления вторичных структур РНК и последующего отжига праймера OligoDT. После переносили образцы в лед. Всю реакционную смесь инкубировали 60 мин при 40 °C в термоциклере T100™ThermalCycler (Bio-Rad).

Для остановки реакции прогревали смесь при 70 °C в течение 10 минут. Полученную кДНК разводили до концентрации 1 нг/мкл. Уровень экспрессии гена оценивали относительно значений референсного гена Gapdh. Расчет экспрессии в конкретной точке производился по формуле: Экспрессия гена = [(Ct(Gapdh)/Ct(Ген интереса)] (таб. 2).

 

Таблица 2 – Праймеры, используемые для количественной ПЦР

Ген	F-праймер	R-праймер	Длина продукта (п.н.)	GenBank
Trp53 (p53)	CGACTACAGTTAGGGGGCAC	CCATGGCAGTCATCCAGTCT	95	NM_001127233.1
Bcl2	TCACCCCTGGTGGACAACAT	TTCCACAAAGGCATCCCAGC	102	NM_009741.5
Bax	CCCGAGCTGATCAGAACCAT	GAGGCCTTCCCAGCCAC	96	NM_007527.3
Pon2	CTTCCACACTGCCACCTGAT	TCCTGGGAATTTTAGACCCACA	105	NM_000305.3
Sod2	GGCTGGCTTGGCTTCAATAAG	AGCGGAATAAGGCCTGTTGTT	95	NM_013671.3
Vegfa (VEGF-A)	GGGCCTCCGAAACCATGAA	TGCAGCCTGGGACCACTTG	95	NM_001025250.3
Flt-1 (VEGF)	CCCATCGGCAGACCAATACA	CGGTGCAGTTGAGGACAAGA	96	NM_001363135.1
Nos2 (iNOS)	GCTCTAGTGAAGCAAAGCCCA	GGGATTCTGGAACATTCTGTGC	103	NM_001313921.1
Icam1	CTCCGGACTTTCGATCTTCCA	CCTTCCAGGGAGCAAAACAAC	98	NM_010493.3
Vcam1	TACTGTTTGCAGTCTCTCAAGC	CGTAGTGCTGCAAGTGAGGG	101	NM_011693.3
Sele (E-selectin)	GGGAAGAAGACTGTCCTAGCC	AGGGGAGCTGGCTTCCTAAG	96	XM_006496715.3
Hif1a	AGAACAACTTGAGCTGGCGT	TGGAGGTGAACTAGGCTCTGT	103	NM_001092957.1
Casp1 (Каспаза-١)	TGTATTCACGCCCTGTTGGA	CCCTCAGGATCTTGTCAGCC	100	NM_009807.2
Casp3 (Каспаза-٣)	GCTTGGAACGGTACGCTAAG	CTTGCTCCCATGTATGGTCTT	105	NM_001284409.1
Il6	GACTGGGGATGTCTGTAGCTC	TGGATGGAAGTCTCTTGCAG	103	NM_001314054.1
Tnfa (TNFa)	ACTGAACTTCGGGGTGATCG	ACTTGGTGGTTTGTGAGTGTG	105	NM_001278601.1
Gapdh	GGGTCCCAGCTTAGGTTCATC	CCCAATACGGCCAAATCCGT	100	NM_001289726.1

 

In vitro изучение цитопротективной активности

У 6-ти интактных мышей (4 животных генотипом Polg-^D257A/Cdh5-CRE и 4 животных дикого типа) после эвтаназии в стерильных условиях выделяли нижнюю полую вену и промывали раствором DPBS (Thermo FS) до полного удаления крови. Затем вену надсекали для обнажения внутренней поверхности и помещали в 0,2% раствор коллагеназы в DPBS с добавлением 0,9 mM CaCl₂, 0,493 mM MgCl₂, 5,56 mM глюкозы, 0,327 mM пирувата натрия, пенициллина и стрептомицина (Lonza), подвергая интиму ферментативной диссоциации. Для увеличения эффективности отделения эндотелиоцитов внутренний слой отскабливали стерильным пинцетом. Раствор коллагеназы, содержащий клетки, собирали в пробирку 5 мл, полученные эндотелиальные клетки культивировали в среде DMEM-F12 (Lonza) с добавлением 20 mМ буфера HEPES (Lonza), 5 ЕД/мл гепарина, 200 мкг/мл ECGF (Sigma-Aldrich), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Thermoscientific,) при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂ [18].

Жизнеспособность клеток измеряли количественным колориметрическим анализом МТТ, который обеспечивает чувствительные измерения метаболических статусов клеток, в частности митохондриального статуса, которые могут отражать ранние окислительно-восстановительные изменения.

Вкратце, экспоненциально растущие клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 4 × 104 клеток на лунку. Затем клетки обрабатывали исследуемыми пептидами P-αB, P-αB1, P-αB3 (ООО «Фармапарк») в 3-х концентрациях – 5, 30, 50 мкг/мл в течение 2 часов. После предварительной обработки в культуральную среду добавляли H₂О₂ до конечной концентрации в конечной концентрации 200 мкМ в течение 24 часов. Клетки отрицательного контроля обрабатывали только H₂0₂, а клетки положительного контроля не обрабатывали ничем. После инкубации в течение 24 часов в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента набора для анализа МТТ и клетки инкубировали в течение дополнительного часа. Поглощение каждого продукта реакции измеряли с помощью микропланшет-ридера на длине волны 450 нм. Результаты выражены в процентах от поглощения МТТ контрольных клеток, который был принят за 100% (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Первичный монослой эндотелиальных клеток мыши (ув. ×40)

 

Статистическая обработка

Полученные данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка. Данные с нормальным распределением сравнивали между собой с применением One-way ANOVA с пост-хок анализом по HSD Тьюки. Данные с ненормальным распределением сравнивали с применением теста Крускала-Уоллеса и пост-хок анализом по методу Данна.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Макроскопическая оценка бляшки

При макроскопическом анализе было обнаружено, что к 28-му дню после моделирования баллонной травмы во всех препаратах аорты, окрашенных краской Oil Red O визуализировались липидные отложения, характерные для атеросклероза.

В то же время степень повреждения очень сильно варьировала внутри групп, что затруднило интерпретацию полученных результатов. В итоге мы не обнаружили достоверных различий между контрольной группой и группами с применением тестируемых препаратов, хотя некая тенденция к снижению площади наблюдалась в группе с применением P-αB1 (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Площадь липидных отложений

Примечание: + – среднее арифметическое.

 

Количественная ПЦР

С использованием молекулярно-биологического анализа тканей бляшки было обнаружено, что изучаемые пептиды выраженно снижают экспрессию проапоптических факторов Bax, каспазы 1 и каспазы-3, а также незначительно увеличивают экспрессию антиапоптического фактора Bcl-2. Как видно из тепловой карты на рисунке 2 наибольший эффект продемонстрировал препарат P-αB1 (рис. 4А).

Для интегральной оценки проапоптической направленности тканей мы рассчитали соотношение экспрессии Bax к Bcl-2. Средний расчетный показатель Bax/Bcl-2 составил 0,67 в группе интактных животных, 1,81 в контрольной группе, 1,19 в группе с применением P-αB, 0,96 в группе с применением P-αB1 и 1,09 в группе с применением P-αB3 (рис. 4Б).

 

Рисунок 4 – Влияние исследуемых препаратов на относительную экспрессию маркеров апоптоза

Примечание: А) Из рисунка видно, что на фоне моделирования баллонного повреждения выраженно возрастает экспрессия маркеров программируемой клеточной гибели p53 и Bax и падает экспрессия антиапоптического маркера Bcl-2. Исследуемые препараты практически во всех случаях возвращают экспрессию p53, Bax и Bcl к уровню значений в интактной группе; B) Рисунок Б отражает соотношение Bax/Bcl-2. Соотношение характеризует проапоптическую направленность клетки, чем оно выше, тем более выражена активация каскадов программируемой клеточной гибели. Из рисунка видно, что пептид P-αB1 статистически значимо снижает соотношение Bax/Bcl-2.

+ – среднее арифметическое; статистическую значимость межгрупповых отличий выявляли с применением теста Краскела-Уоллиса и пост-хок анализа по методу Данна.

 

Наряду с антиапоптическим действием, изучаемые препараты снизили повышенную на фоне травмы экспрессию генов воспалительных маркеров iNOS и молекул межклеточной адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина. Наиболее выраженный эффект был получен в группе с применением соединения P-αB1 (рис. 5).

 

Рисунок 5 – Уровень экспрессии генов iNOS, ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина

 

Кроме того, исследуемые препараты снизили экспрессию факторов, связанных с ангиогенезом VEGF-A, VEGFR, а также HIF-1a (рис. 6).

 

Рисунок 6 – Уровень экспрессии VEGF-A, VEGFR, и HIF-1a

 

Наконец, нами было обнаружено, что на фоне моделирования атеросклероза у мышей Polg-^D257A/Cdh5-CRE происходит увеличение экспрессии генов антиоксидантных ферментов PON2, SOD2. При этом по сравнению с контролем на фоне применения тестируемых пептидов экспрессия генов антиоксидантной системы была снижена. Также, как и при оценке влияния пептидов на провоспалительные и проангиогенные гены, наиболее выраженный эффект был получен в группе с применением соединения P-αB1 (рис. 7).

 

Рисунок 7 – Уровень экспрессии генов PON2, SOD2

 

Изучение цитопротекторной активности in vitro

При проведении МТТ-теста на первичных культурах эндотелиоцитов было обнаружено, что даже без добавления H₂О₂ эндотелиоциты, экспрессирующие Polg-^D257A, характеризуются более низкой интенсивностью сигнала по сравнению с диким типом. При инкубации с H₂O₂ большая часть эндотелиоцитов Polg-^D257A теряла интенсивность сигнала почти в пять раз с 80,60 (95% CI 77,29–84,94) до 15,79 (95% CI 11,97–25,42) (рис. 8).

 

Рисунок 8 – Влияние H2O2 и тестируемых пептидов на выживаемость эндотелиоцитов с генотипом Polg-^D257A

Примечание: † – относительно интактных эндотелиоцитов дикого типа; * – p < 0,0001 при сравнении с группой, получавшей только H₂О₂; # – p=0,0783 при сравнении с группой с добавлением P-αB 30 мкг/мл

 

Исследуемые препараты дозозависимо увеличивали выживаемость клеток в условиях оксидативного стресса, вызванного добавлением H₂O₂. При этом как видно из рисунка модифицированные пептиды (P-αB1 и P-αB3) оказывали более выраженный эффект по сравнению с базовым соединением (PαB) при добавлении в эквивалентных дозах.

ОБСУЖДЕНИЕ

Пептидные агонисты гетерорецептора EPOR/CD131 являются активаторами связанных с эритропоэтином каскадов цитопротекции. Соединения P-αB1 и P-αB3 наряду с первичными антиапоптическими свойствами обладают также антиагрегантной активностью, которая достигается за счет внесения трипептидных мотивов KGD и RGD. В данном исследовании в качестве экспериментальной модели для изучения антиатеросклеротической активности P-αB1 и P-αB3 мы использовали трансгенных мышей с митохондриальной дисфункцией на фоне тканеспецифичного нокдауна гена Polg, кодирующего полимеразу гамма.

Полимераза гамма – это фермент, который играет ключевую роль в репликации митохондриальной ДНК. Этот фермент демонстрирует высокую точность работы и, в то же время, обладает собственной 3’->5› экзонуклеазной активностью, благодаря которой возможно исправление ошибок полимеризации. Включение «неправильных» нуклеотидов без последующего исправления приводит к накоплению митохондриальных мутаций и дисфункции митохондрий [19]. В результате происходит увеличение выработки активных радикалов и повреждение клетки. Гомозиготные животные с системным нокаутом Polg не выживают, поэтому в нашей работе мы использовали эндотелиоспецифичный нокдаун гена [20]. Данная модель отражает одно из ключевых звеньев в патогенезе атеросклероза – оксидативный стресс на фоне митохондриальной дисфункции. Тем не менее, в любой животной модели атеросклероза, индивидуальные различия в сроках и степени формирования бляшек настолько велики, что для тестирования препаратов нужны очень большие группы животных [21–23]. В этой связи мы решили стандартизировать процесс атерогенеза путем индукции атеросклероза баллонной травмой и западной диетой.

В используемой нами модели атеросклероз связан с травматическим воздействием на сосуд на фоне повреждения эндотелиоцитов вследствие дисфункции митохондрий. Для подтверждения эффектов, наблюдаемых in vivo, мы также провели in vitro изучение эффективности выбранных пептидов на первичной культуре эндотелиоцитов Polg-^D257A. Для усиления оксидативного стресса мы инкубировали клетки в присутствии 200 мкМ H₂О₂.

Изучаемые пептиды продемонстрировали выраженный эндотелиопротективный эффект на модели оксидативного стресса in vitro. Также было обнаружено, что препараты оказывают выраженное редуцирующее влияние на экспрессию проапоптических маркеров. Подобные результаты согласуются с представлением о базовом механизме действия производных эритропоэтина. При активации цитопротекторного гетерорецептора EPOR/CD131 происходит Jak/STAT-опосредованная передача сигнала в ядро, приводящая к сигналингу «выживания» путем снижения экспрессии проапоптических генов [24, 25]. Аналогичные эффекты стимуляции эритропоэтиновых рецепторов прежде уже были показаны при моделировании атеросклероза [26].

Кроме того, нами было получено, что экспрессия генов антиоксидантной системы PON2 и SOD2 снизилась у леченых животных по сравнению с контролем. Мы связываем наблюдаемый эффект с тем, что в сосудах животных контрольной группы развивается сильный оксидативный и токсический стресс, который стимулирует увеличение экспрессии генов антиоксидантной системы. В то же время на фоне лечения, патологические явления в клетках были редуцированы, и стимулирующая активность в отношении генов PON2 и SOD2 также снизилась.

Также мы установили, что пептидные агонисты EPOR/CD131 обладают выраженной противовоспалительной активностью, снижая экспрессию провоспалительных цитокинов и молекул межклеточной адгезии. Воспаление является активным фактором развития атеросклероза и способствует дестабилизации атеросклеротических бляшек [27]. Особую роль в регулировании воспалительных каскадов и инфильтрации сосудов иммунными клетками играют молекулы VCAM-1 ICAM-1 IL-1b TNF-a [28–30]. В целом противовоспалительный эффект эритропоэтина и его производных являются широко изученным феноменом [31, 32]. Поэтому полученные нами данные укладываются в общее представление о фармакодинамике агонистов EPOR/CD131.

Отдельно мы решили оценить влияние исследуемых пептидов на экспрессию генов, кодирующих ангиогенные факторы. Ангиогенные факторы играют важную роль в прогрессировании атеросклероза и известно, что эритропоэтин способен стимулировать ангиогенез [33]. В зонах атеросклероза местные специфические условия (относительная аноксия, воспаление, окислительный стресс) увеличивают экспрессию классических и неклассических ангиогенных факторов, которые способствуют разрастанию ранее существовавших vasa vasorum [34]. Неоваскуляризация увеличивает местный поток питательных веществ и O₂ и, таким образом, может способствовать прогрессированию и ремоделированию бляшек [35]. Полученные нами результаты продемонстрировали, что в отличие от эритропоэтина, пептидные агонисты EPOR/CD131 демонстрируют антиангиогенное влияние, по крайней мере в отношении атеросклеротической бляшки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Прежде нами была сформулирована и подтверждена гипотеза, что при добавлении трипептидных мотивов KGD и RGD, цитопротекторные пептидные производные эритропоэтина могут приобретать антиагрегантные свойства. В ходе данного исследования мы продемонстрировали, что два инновационных пептида и базовое соединение PαB (pHBSP) защищают эндотелиоциты in vitro, а также снижают проапоптическую, провоспалительную и ангиогенную активацию клеток сосудистой стенки в модели атеросклероза в сочетании с митохондриальной дисфункцией. Подобная фармакологическая активность изучаемых препаратов представляется очень перспективной в совокупности со сведениями о наличии у них антиагрегантной активности. Таким образом наблюдаемые эффекты дополняют сведения кардиоваскулярной активности инновационных пептидов P-αB1 и P-αB3, а также новые перспективы в разработке пептидов, сочетающих в себе атеропротекивные и антиагрегантные свойства.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполняется при поддержке Минобрнауки России. Соглашение о субсидии № 05.605.21.0191 (уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60519X0191).

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

О.А. Пученкова – введение препаратов животным, забор органов для молекулярно-биологического и макроскопического изучения, написание статьи; С.В. Надеждин – выделение первичной культуры эндотелиоцитов, изучение цитопротективной активности производных эритропоэтина in vitro. Написание статьи; В.О. Солдатов – написание статьи, разработка дизайна исследования; М.А. Жученко – синтез пептида и анализ литературы; Д.С. Коршунова – выделение РНК, конвертация РНК в кДНК, анализ экспрессии таргетных генов; М.В. Кубекина – выделение РНК, конвертация РНК в кДНК, анализ экспрессии таргетных генов; Е.Н. Коршунов – хендлинг и уход за животными, подготовка экспериментальной группы животных; Л.В. Корокина – написание статьи, разработка дизайна исследования; А.Л. Куликов – провизорская служба, статистическая обработка и работа с графическим материалом; П.А. Голубинская – написание статьи, формализация списка литературы; В.М. Покровский –наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов; Е.А. Патраханов – наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов; П.Р. Лебедев – наблюдение и уход за животными, введение препаратов., некропсия животных; В.В. Гуреев – написание статьи, консультации по планированию, методологии и реализации эксперимента, моделирование баллонной травмы; Т.А. Денисюк – статистическая обработка, написание статьи, формализация списка литературы; В.С. Беляева – анализ графического изображения и измерение площади атеросклеротической бляшки, выделение первичной культуры эндотелиоцитов, изучение цитопротективной активности производных эритропоэтина in vitro; Е.А. Мовчан – выделение первичной культуры эндотелиоцитов, изучение цитопротективной активности производных эритропоэтина in vitro, пробоподготовка образцов аорты для графического анализа; Е.И. Лепетюха – выделение РНК, проведение количественной ПЦР; М.В. Покровский – создание идеи, планирование исследования, консультация по вопросам проведения отдельных этапов экспериментальных работ, обеспечение качества.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Олеся А. Пученкова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: lesya759@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7657-0937

студентка 6 курса Медицинского института

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Сергей В. Надеждин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: sergey_nadezhdin@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-6249-2464

кандидат биологических наук, научный сотрудник НИИ Фармакологии живых систем

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Владислав О. Солдатов

ФГБУН «Институт биологии гена РАН»

Email: pharmsoldatov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9706-0699

младший научный сотрудник

Россия, 119334, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5

Максим А. Жученко

НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика

Email: maksim.zhuchenko@pharmapark.ru

кандидат биологических наук, начальник сектора

Россия, 123098, г. Москва, пл. Академика Курчатова, 1

Диана С. Коршунова

ФГБУН «Институт биологии гена РАН»

Email: korshunova@genebiology.ru
ORCID iD: 0000-0002-0259-7045

младший научный сотрудник

Россия, 119334, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5

Марина В. Кубекина

ФГБУН «Институт биологии гена РАН»

Email: marykumy@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8834-1111

аспирант, младший научный сотрудник Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, 119334, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5

Евгений Н. Коршунов

ФГБУН «Институт биологии гена РАН»

Email: korshunov@genebiology.ru
ORCID iD: 0000-0001-8170-4656

заведующий виварием, младший научный сотрудник

Россия, 119334, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5

Лилия В. Корокина

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: korokina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5402-0697

кандидат медицинских наук, доцент, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Полина А. Голубинская

Клинико-диагностическая лаборатория, Бюджетное учреждение здравоохранения Воронежской области «Воронежская областная клиническая офтальмологическая больница» (БУЗ ВО «ВОКОБ»)

Email: polinapigeon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1765-9042

заведующая клинико-диагностической лабораторией

Россия, 394030, г. Воронеж, ул. Революции 1905 года, д. 22

Александр Л. Куликов

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: alex-3031@yandex.ru

научный сотрудник научный сотрудник НИИ Фармакологии живых систем

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Владимир В. Гуреев

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: produmen@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1433-1225

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Владимир М. Покровский

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: vmpokrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3138-2075

студент 5 курса Медицинского института

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Евгений А. Патраханов

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: pateval7@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8415-4562

студент 5 курса Медицинского института

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Петр Р. Лебедев

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: Artkeit@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9102-3360

студент 5 курса Медицинского института

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Татьяна А. Денисюк

ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет»

Email: denitatyana@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0974-4818

доктор медицинских наук, доцент кафедры фармакологии

Россия, 305041, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3

Вероника С. Беляева

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: nika.beliaeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2941-0241

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Евгения А. Мовчан

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: ms.movchan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6244-2563

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Елизавета И. Лепетюха

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: lisitsa007@bk.ru

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Михаил В. Покровский

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: mpokrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2761-6249

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии, руководитель НИИ Фармакологии живых систем

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Список литературы

Дополнительные файлы