Изучение фармакологической активности новых агонистов гетерорецептора EPOR/CD131 у животных с эндотелиоспецифичной экспрессией мутантного гена Polg

Полный текст

Список сокращений: ПЦР – полимеразная цепная реакция; pHBSP – pyroglutamate helix B surface peptide / пироглутаматный поверхностный пептид спирали B; HBSP – helix B surface peptide / поверхностный пептид спирали B; iNOS – индубельная NO-синтаза; Polg – polymerase gamma / полимераза гамма; ICAM-1 – Inter-Cellular Adhesion Molecule 1 / межклеточная молекула адгезии – 1; VCAM-1 – Vascular cell adhesion molecule 1 / молекула адгезии клеточного эндотелия 1; ЭПО – эритропоэтин; EpoR – рецептор эритропоэтина; мРНК – ма́тричная рибонуклеи́новая кислота; HUVEC – Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells / культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека; AKT1 – RAC-alpha serine/threonine-protein kinase / RAC-альфа-серин/треонин-протеинкиназа; eNOS/NOS3 – эндотелиальная синтаза оксида азота; NO – оксид азота; АХ – ацетилхолин; PI3K – phosphoinositide 3-kinase / Фосфоинозитид-3-киназы; НП – нитропруссид натрия

 

ВВЕДЕНИЕ

Эритропоэтин (ЭПО) – один из гормонов, вырабатываемых почками, первоначально идентифицированный в качестве критически важного регулятора процесса кроветворения. Рекомбинатный эритропоэтин широко используется при лечении анемии, связанной с хроническим заболеванием почек, сердечной недостаточностью и раком [1]. В организме человека эритропоэтин стимулирует производство около 200 миллиардов эритроцитов ежедневно. ЭПО, после выработки в почках, секретируется в кровоток и его мишенью являются эритроидные клетки-предшественники, расположенные в костном мозге [2, 3]. ЭПО действует путем связывания со своим специфическим рецептором на поверхности клеток-предшественников эритроцитов. Нокаут ЭПО (EPO -/-) или рецептора ЭПО (EpoR -/-) у мышей приводит к гибели эмбриона вследствие развития тяжелой анемии [4, 5].

За последнее десятилетие было выявлено множество не гемопоэтических эффектов эритропоэтина, включая его антиатеросклеротическое действие [6, 7]. При реализации негемопоэтических эффектов локально продуцируемый гипогликозилированный эритропоэтина действует паракринно-аутокринным путем и передает сигналы через взаимодействие с тканезащитным гетеродимерным рецептором эритропоэтина EpoR/CD131 [8, 9]. Доступность рекомбинантного эритропоэтина повлияла на появление работ, посвященных изучению негемопоэтической активности ЭПО, включая протективное действие на эндотелиоциты и нервные клетки. Сообщения о наличии рецепторов ЭПО (EpoR), экспрессии мРНК EpoR и/или белка EpoR за пределами органов эритропоэза предполагают возможность рецепторного негемопоэтического действия эритропоэтина [3]. Как сообщается в публикациях, эндотелиоциты из клеточной культуры HUVEC стали первыми клетками негемопоэтического ряда, которые экспрессируют рецепторы эритропоэтина, связывают эритропоэтин и показывают пролиферативный ответ на введение эритропоэтина in vitro [8, 10]. Было обнаружено, что ЭПО защищает культуры эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга крыс от повреждения, вызванного аноксией, путем активации AKT1, поддержания потенциала митохондриальной мембраны, а также предотвращения процессов апоптоза, индуцированного оксидативным стрессом [12]. Важной функцией эндотелиальных клеток является экспрессия эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS/NOS3), которая участвует в синтезе оксида азота (NO) для регуляции сосудистого гомеостаза. С использованием клеточной культуры эндотелиоцитов было обнаружено, что сочетание пониженного содержания кислорода и добавления к клеточной культуре эритропоэтина увеличивает экспрессию мРНК и белка EpoR, увеличивает экспрессию eNOS и тем самым стимулирует продукцию оксида азота [13]. На экспериментальных моделях у трансгенных мышей, с высоким гематокритом, показано что артериальная гипертензия не развивается из-за значимого повышенного уровня eNOS и NO в сосудистой ткани и в кровотоке [14].

Сегодня очевидно, что протромботические побочные эффекты рекомбинантного эритропоэтина препятствуют его клиническому применению у пациентов, не страдающих анемией [15]. Для предотвращения тромботических осложнений, связанных с терапией ЭПО сегодня получены производные эритропоэтина, не обладающие гемопоэтической активностью, но обладающие тканепротективным действием. 11-аминокислотный пептид, имитирующий пространственную структуру цепи B эритропоэтина (HBSP) является одним из таких производных ЭПО, который проявляет не гемопоэтическую активность, сравнимую с рекомбинатным эритропоэтином [16–19].

Для поиска новых соединений, обладающих атеропротективным и эндотелиопротективным действием мы изменили аминокислотную последовательность HBSP путем поиска групп родственных пептидов исходного соединения с помощью программы BLAST. В результате получено 3 соединения, имитирующих а-спираль B эритропоэтина: EP-11-1 (UEHLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS), EP-11-3 (UEQLERALNTS).

ЦЕЛЬ. Изучение антиатеросклеротической и эндотелиопротективной активности соединений EP-11-1, EP-11-2, EP-11-3.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные и диета

В исследование было включено 96 самцов мышей с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE на фоне C57Bl/6J, полученных из ФГБУН «Институт биологии гена» РАН. При работе соблюдались требования Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 24.06.1998 г., правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и ГОСТ Р 53434-2009), директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС), правил Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г.) и Правил лaбoрaтoрнoй прaктики, принятых в Российcкoй Фeдeрaции (прикaз MЗ РФ № 708 oт 29.08.2010 г.). Эксперименты были одобрены локальным этическим комитетом Белгородского государственного национального исследовательского университета, г. Белгород, протокол № 19/23 от 04.02.2020. Генотип Polg^mut/mut/Cdh5-CRE ассоциирован эндотелиоспецифичной экспрессией мутантного гена Polg, кодирующего фермент полимераза гамма с мутацией D257A, приводящей к отсутствию 3’экзонуклеазной активности и накоплению мутаций при репликации генома митохондрий. Экспрессия мутантного белка приводит к развитию митохондриальной дисфункции c формированием нарушений процессов, протекающих в сосудистом эндотелии. За 2 недели до начала эксперимента животных помещали на западную диету с содержанием холестерина – 2% [20].

Моделирование балонного повреждения сосудистой стенки

Операцию выполняли на подогреваемом столике под препаративным микроскопом с применением наркоза (золазепам 2,5 мг/100 г (Virbac, Франция) + ксилазин 2 мг/100 г (Биогель, Россия); введение проводили внутрибрюшинно) животным через хирургический доступ в медиальной области бедра выделяли общую бедренную артерию наносили балонное повреждение эндотелия как это было описано ранее. Для облегчения послеоперационного болевого синдрома в течение 3-х дней с момента операции животные получали метамизол натрия с питьевой водой ad libitum в концентрации 50 мг метамизола натрия (Фармстандарт-Уфавита, Россия) на 100 мл воды [20–22].

Дизайн исследования и введение препаратов

Перечень исследуемых пептидов, их лабораторные шифры и аминокислотные последовательности представлены в таблице 1.

 

Таблица 1 – Аминокислотная последовательность исследуемых соединений

Лабораторный шифр	Аминокислотная последовательность
pHBSP	QEQLERALNSS
EP-11-1	UEHLERALNSS
EP-11-2	UEQLERALNCS
EP-11-3	UEQLERALNTS

 

Животные с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE были разделены на 6 равных групп:

1) Интактные;

2) Контроль – животные с моделированием баллонной травмы и получающие западную диету;

3) pHBSP – животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид pHBSP в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня течение 28-ми дней (суммарная доза 180 мкг/кг);

4) EP-11-1 – животные, с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид EP-11-1 в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 28-ми дней (суммарная доза 180 мкг/кг);

5) EP-11-2 – животные, с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид EP-11-2 в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 28-ми дней (суммарная доза 180 мкг/кг);

6) EP-11-3 – животные с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE, которым, начиная с 1-го дня, водили пептид EP-11-3 в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 28-ми дней (суммарная доза 180 мкг/кг).

Доза и путь введения изучаемых пептидов выбраны с учетом экспериментальных данных, полученных нами ранее при исследовании фармакологической активности пула соединений, производных pHBSP, полученных путем добавления трипептидных мотивов RGD, KGD и PGP к исходному пептиду [20].

Измерение площади атеросклеротической бляшки

Макроскопическое изучение атеросклеротических бляшек аорты было выполнено с использованием материала от 4-х животных из каждой группы. Для этого на 28-й день после моделирования баллонной травмы животных эвтаназировали передозировкой наркоза (золетил 10 мг/100 г внутрибрюшинно) и аккуратно извлекали брюшную аорту от бифуркации до участка на уровне диафрагмы. Затем препараты продольно рассекали, расправляли на пенопластовой подложке, промывали 50%-ным раствором спирта этилового и погружали в раствор Oil Red O на 15 минут. После этого препараты промывали дистиллированной водой и делали цифровые фотоснимки. С применением программы imageJ на полученных снимках рассчитывали отношение площади атеросклеротической бляшки (окрашенной красным) к интактной ткани [20].

Количественная ПЦР

У остальных животных после эвтаназии ткань аорты в области нанесения баллонного повреждения забирали, гомогенизировали и инкубировали при 37°С в растворе «Extract RNA» в течении 10 минут. После лизирования образца в реагенте его подвергли хлороформной чистке, надосадочную пробу собирали и промывали изопропиловым спиртом и 70%-ным спиртом этиловым. Концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре IMPLEN NanoPhotometer® (IMPELEN, Германия) и доводили до концентрации 300 нг/мкл. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора MMLVRTSK021 в соответствии с протоколом фирмы-производителя (Evrogen, Россия). Исследование проводили в соответствии с ранее описанной нами методикой [20]. В таблице 2 представлены праймеры, используемые при проведении количественной ПЦР.

 

Таблица 2 – Праймеры, используемые для количественной ПЦР

Ген	F-праймер	R-праймер	Длина продукта	GenBank
Trp53 (p53)	CGACTACAGTTAGGGGGCAC	CCATGGCAGTCATCCAGTCT	95	NM_001127233.1
Bcl2	TCACCCCTGGTGGACAACAT	TTCCACAAAGGCATCCCAGC	102	NM_009741.5
Bax	CCCGAGCTGATCAGAACCAT	GAGGCCTTCCCAGCCAC	96	NM_007527.3
Vegfa (VEGF-A)	GGGCCTCCGAAACCATGAA	TGCAGCCTGGGACCACTTG	95	NM_001025250.3
Flt-1 (VEGFR-1)	CCCATCGGCAGACCAATACA	CGGTGCAGTTGAGGACAAGA	96	NM_001363135.1
HIF-1a	AGAACAACTTGAGCTGGCGT	TGGAGGTGAACTAGGCTCTGT	103	NM_001092957.1
NOS2 (INOS)	GCTCTAGTGAAGCAAAGCCCA	GGGATTCTGGAACATTCTGTGC	103	NM_001313921.1
ICAM-1	CTCCGGACTTTCGATCTTCCA	CCTTCCAGGGAGCAAAACAAC	98	NM_010493.3
VCAM-1	TACTGTTTGCAGTCTCTCAAGC	CGTAGTGCTGCAAGTGAGGG	101	NM_011693.3
Sele (E-селектин)	GGGAAGAAGACTGTCCTAGCC	AGGGGAGCTGGCTTCCTAAG	96	XM_006496715.3
Gapdh	GGGTCCCAGCTTAGGTTCATC	CCCAATACGGCCAAATCCGT	100	NM_001289726.1

 

Изучение влияния препаратов колец аорты на сосудистый эндотелий

Для проведения эксперимента были сформированы следующие экспериментальные группы (n=8 животных в группе):

1) Интактная группа – мыши с диким генотипом C57BL/6;

2) Контрольная группа Мыши с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE;

3) pHBSP – Polg^mut/mut/Cdh5-CRE + pHBSP 20 мкг/кг;

4) EP-11-1 – Polg^mut/mut/Cdh5-CRE + EP-11-1 20 мкг/кг;

5) EP-11-2 -Polg^mut/mut/Cdh5-CRE + EP-11-2 20 мкг/кг;

6) EP-11-3 -Polg^mut/mut/Cdh5-CRE + EP-11-3 20 мкг/кг.

Исследуемые соединения – инновационные пептиды с лабораторными шифрами EP-11-1, EP-11-2, EP-11-3 вводили внутрибрюшинно, в течение 7 дней в обозначенных дозах. На 8-й день от начала эксперимента животных наркотизировали с помощью внутрибрюшинного введения хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Далее у анестезированных мышей была открыта грудная клетка для изъятия грудной аорты. Грудная аорта была помещена в модифицированный ледяной раствор Кребса Ханселейта (118 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ Na₂PO₄, 0,5 мМ MgCl₂, 1,12 мМ CaCl₂, 25 мМ NaHCO₃ 0,03 мМ ЭДТА) pH 7,4 с 11 мМ глюкозы. Аорту осторожно отделяли от окружающей жировой и соединительной ткани и разрезали на короткие поперечные сегменты размером 2 мм. Кольца аорты суспендировали в ванне для органов (Biopac Bas System Station, Biopac systems, США), содержащей 10 мл раствора KH, поддерживаемого при температуре 37°C, и барботировали 95% O₂ и 5% CO₂ между двумя параллельными крючками из нержавеющей стали. Изометрическое натяжение во время экспериментов измерялось и регистрировалось с помощью программно-аппаратного комплекса Biopac System, США. Регистрация и обработка данных производилась с помощью программного обеспечения Biopac Icq 4.2. Каждое кольцо аорты постепенно растягивали до исходного натяжения 0,8 г и давали уравновеситься в стандартной ванне для органов объемом 10 мл в течение 60 минут перед экспериментом. После уравновешивания кольца сначала контрактурили с помощью 60 мМ KCl, чтобы вызвать их сократительную реакцию и достигнуть воспроизводимый максимальный сократительный ответ, затем их трижды промывали раствором Кребса Ханселейта, чтобы восстановить напряжение до базального уровня. Ответ сокращения колец аорты на субмаксимальную концентрацию фенилэфрина (1 мкмоль/л) индуцировали через 30 мин после восстановления базального уровня. На плато сокращения, вызванного эпинефрином, проводили пробы на эндотелийзависимую и эндотелинезависимую вазодилатацию. В качестве агента, вызывающего эндотелийзависимую вазодилатацию, в ванну с аортой кумулятивно добавляли ацетилхолин (АХ) (10^-9-10^-4 M), в качестве агента, вызывающего эндотелийнезависимую вазодилатацию – нитропруссида натрия (НП) (10^-9–10^-5 M). Чувствительность определяли как процент релаксации от исходного значения, полученного на плато введения эпинефрина.

Статистическая обработка

Статистическая обработка выполнена с использованием программы Statistica 10.0. Полученные данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий – с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела-Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Макроскопическая оценка бляшки

В соответствии с дизайном эксперимента проведена макроскопическая оценка бляшки, сформированной после балонной травмы у животных с диким генотипом (интактная группа) и у животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE (контрольная группа). Установлено, что в контрольной группе животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE во всех препаратах, окрашенных Oil Red O визуализировались липидные отложения, характерные для атеросклероза, что выразилось в увеличении размера бляшки в контрольной группе более чем в 11 раз. При проведении обработки данных, полученных при оценке размера бляшки у животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE на фоне применения изучаемых пептидов мы не обнаружили статистически значимого изменения размера бляшки (рис. 1).

 

Рисунок 1 – Размер атеросклеротической бляшки в группах животных с диким генотипом и с генотипом Polgmut/mut/Cdh5-CRE на фоне применения изучаемых пептидов

Примечание: знаком «+» на графике показано среднее арифметическое для каждой экспериментальной группы

 

Количественная ПЦР

В дополнение к макроскопической оценке бляшки мы провели молекулярно-биологический анализ ткани атеросклеротической бляшки после балонного повреждения сосуда во всех экспериментальных группах. На рисунке 2 показано, что у животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE на фоне моделирования балонного повреждения существенно возрастает экспрессия маркеров программируемой клеточной гибели p53 и Bax и снижается экспрессия антиапоптического маркера Bcl-2. Как видно из тепловой карты, представленной на рисунке 2А, пептиды EP-11-1 и EP-11-2 статистически значимо в сравнении с контрольной группой животных (р<0,05), снижают экспрессию проапоптических факторов p53 и Bax, а также увеличивают экспрессию антиапоптического фактора Bcl-2 (р<0,05). Наиболее эффективным в отношении изменения экспрессии факторов апоптоза оказалось соединение с лабораторным шифром ЕР-11-1 – значения экспресссии генов p53, Bax и Bcl-2 не отличались от таковых показателей в контрольной группе (рис. 2А).

 

Рисунок 2 – Влияние исследуемых препаратов на относительную экспрессию маркеров апоптоза (2А) и соотношение Bax/Bcl-2 (2Б)

Примечание: знаком + на графике показано среднее арифметическое для каждой экспериментальной группы

 

На рисунке 2Б показано соотношение Bax/Bcl-2, характеризующее интегральную проапоптическую направленность клетки, чем оно выше, тем более выражена активация каскадов программируемой клеточной гибели. Из рисунка видно, что у животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE соотношение Bax/Bcl-2 статистически значимо повышается, а введение соединения с лабораторным шифром ЕР-11-1 и исходного пептида pHBSP статистически значимо снижают соотношение Bax/Bcl-2 (рис. 2Б)

При изучении экспрессии группы воспалительных маркеров показано, что в контрольной группе животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE статистически значимо повышается экспрессия iNOS, ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина (рис. 3). Изучаемые соединения с лабораторными шифрами EP-11-1, EP-11-2 и EP-11-3, более эффективно, чем исходный пептид pHBSP, снизили повышенную на фоне баллонной травмы экспрессию генов воспалительных маркеров iNOS, молекул межклеточной адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина. Наиболее выраженный эффект был получен в группе с применением соединения ЕР-11-1 (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Влияние исследуемых соединений на относительную экспрессию маркеров воспаления

 

Кроме того, исследуемые соединения с лабораторными шифрами ЕР-11-1, ЕР-11-2, ЕР-11-3 эффективнее, чем исходный пептид pHBSP, снизили экспрессию факторов, связанных с ангиогенезом (рис. 4). Наиболее эффективным в данном тесте, как и в большинстве ранее проанализированных данных, оказалось соединение с лабораторным шифром ЕР-11-1 (рис. 4).

 

Рисунок 4 – Влияние исследуемых соединений на относительную экспрессию факторов, связанных с ангиогенезом

 

Оценка функционирования сосудистого эндотелия на препаратах изолированных колец аорты

Изучение влияния исследуемых соединений и исходного пептида pHBSP на функционирование сосудистого эндотелия проведено на изолированных сегментах грудной аорты мышей с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE, получавших диету с высоким содержанием жиров. Эндотелиальную функцию оценивали путем проведения эндотелийзависимой вазодилатации в ответ на ацетилхолин (АХ). Как показано на рисунке 5 эндотелийзависимая вазодилатация, индуцированная ацетилхолином, была значительно снижена у мышей с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE по сравнению с интактными мышами дикого типа.

Важно отметить, что нарушение эндотелийзависимой вазодилатации, вызванной АХ у мышей с эндотелийспецифической гиперэкспрессией мутантного гена Polg, было восстановлено введением пептида с лабораторным шифром ЕР-11-1 и степень релаксации кольца аорты в данной группе статистически значимо отличалась от данного показателя в контрольной группе животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE при введении ацетихолина в концентрациях 10^-6М, 10^-5М и 10^-4М (рис. 5). Введение исходного пептида pHBSP также привело к увеличению расслабления сосуда в ответ на введение ацетилхолина в концентрациях 10^-5М и 10^-4М. Введение пептидов с лабораторными шифрами другого соединения-лидера ЕР-11-2 и ЕР-11-3 статистически значимо не влияло на степень ответа сегмента сосуда на ацетилхолин (рис. 5).

 

Рисунок 5 – Результаты проведения пробы с эндотелийзависимой вазодилатацией в ответ на ацетилхолин на изолированном кольце грудной аорты животных с генотипом Polgmut/mut/Cdh5-CRE

Примечание: # – при р<0,05 в сравнении с контрольной группой животных (Polg-CRE)

 

В тоже время, при анализе результатов эндотелийнезависимой вазодилатации в ответ на нитропруссид натрия статистически значимых различий между экспериментальными группами не обнаружено (рис. 6).

 

Рисунок 6 – Результаты проведения пробы с эндотелийнезависимой вазодилатацией в ответ на нитропруссид натрия на изолированном кольце грудной аорты животных с генотипом Polgmut/mut/Cdh5-CRE

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Биологические эффекты рекомбинантного эритропоэтина широки и многогранны, и большое внимание исследователей привлекают его негематопоэтические эффекты, в частности нас заинтересовало атеропротективное и эндотелиопротективное действие. В исследованиях in vivo показано, что эритропоэтин уменьшает проявления ишемии и реперфузионного повреждения кардиомиоцитов, что частично объясняется увеличением выработки оксида азота и острым ответом на повышение гематокрита. В этом же исследовании сообщается, что эритропоэтин опосредованная активация eNOS связана с передачей сигналов PI3K, а связанное с ЭПО снижение проявлений ишемии кардиомиоцитов не наблюдается у мышей с генотипом eNOS -/- [23]. Предполагается, что эритропоэтин индуцированная продукция оксида азота эндотелиоцитами опосредуется, в первую очередь индукцией и активацией eNOS, особенно при пониженном содержании кислорода [24, 25]. Кроме того, у мышей с эктопической трансгенной экспрессией ЭПО обнаружена повышенная активность eNOS и повышенный уровень NO в плазме, что предотвращает сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония и тромбоэмболия, а ингибирование NO-синтазы приводит к сердечно-сосудистой патологии и смерти [3].

Ввиду известного ограничения применения рекомбинантного эритропоэтина в эритростимулирующих дозах, проблема поиска новых производных эритропоэтина, обладающих его тканезащитными свойствами, но не стимулирующих кроветворение, является актуальной в современной медицине и фармакологии. Пептиды, являющиеся агонистами гетерорецептора EpoR/CD131 запускают каскады цитопротекции, ассоциированные эритропоэтином, но не оказывают эритростимулирующее действие. В ранее проведенных исследованиях продемонстрировано, что пептид, имитирующий пространственную структуру цепи B эритропоэтина pHBSP оказывает выраженное эндотелиопротективное действие при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс [26, 27]. Однако, в этом исследовании нами также было показано протромботическое действие HBSP. С учетом вышесказанного, очевидна необходимость дальнейших модификаций данной молекулы. На наш взгляд, модификация HBSP для улучшения его фармакокинетических и фармакодинамических параметров может стать дальнейшим многообещающим развитием фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний на основе короткоцепочечных пептидов [28].

Поиск таких соединений может быть решен несколькими способами, включая присоединение аминокислотных мотивов с антикоагулянтными свойствами к аминокислотной последовательности или путем поиска групп родственных пептидов исходного соединения с помощью программы BLAST. На первом этапе исследования мы попробовали модернизировать исходную молекулу HBSP путем добавления трипептидных мотивов RGD, KGD и PGP, обладающих антиагрегантным действием. В результате были получены принципиально новые соединения, сочетающие в себе цитопротективный [29] и антиагрегантный эффекты [30]. Также нами показано, что используемые пептиды на основе эритропоэтина способны улучшать функциональное состояние сосудистой стенки на фоне атеросклеротического поражения и оказывают угнетающее влияние на патобиологические процессы, связанные с митохондриальной дисфункцией. Кроме того, исследуемые пептиды обладают выраженным эндотелиопротективным действием на фоне моделирования оксидативного стресса in vitro [20].

В данном исследовании мы изучили фармакологическую активность 3 пептидов, имитирующих а-спираль B эритропоэтина: EP-11-1 (UEHLERALNSS), EP-11-2 (UEQLERALNCS), EP-11-3 (UEQLERALNTS), полученных путем поиска групп родственных пептидов к молекуле pHBSP с помощью программы BLAST.

Для исследования нами выбрана линия животных, с эндотелиоспецифичной экспрессией мутантного гена Polg. Полимераза гамма – фермент, который играет ключевую роль в репликации митохондриальной ДНК. Патология данного фермента приводит к включению «неправильных» нуклеотидов без последующего исправления что вызывает митохондриальную дисфункцию с последующим увеличением выработки активных радикалов и повреждением клетки. Гомозиготные животные с системной мутацией Polg не выживают, поэтому в нашей работе мы использовали эндотелиоспецифичную экспрессию индуцируемого трансгена [20].

В используемой нами модели атеросклероз связан с травматическим воздействием на сосуд на фоне повреждения эндотелиоцитов вследствие дисфункции митохондрий. Проведенное исследование атеропротективной активности показало, что изучаемые пептиды, как и исходный пептид pHBSP, статистически значимо не влияют на гистологическое строение и размер атеросклеротической бляшки на выбранной модели патологии. Максимальное уменьшение размера атеросклеротической бляшки, установленное в группе животных, получавших ЕР-11-1, которое, однако, не носило статистически значимого характера. Возможно, в дальнейшем следует изучить влияние полученных соединений лидеров на гистологическое строение и размер атеросклеротических бляшек на модели атерогенеза, не связанной с физическим повреждением эндотелия.

С использованием молекулярно-биологического анализа тканей сформированной атеросклеротической бляшки было обнаружено, что изучаемые пептиды EP-11-1 и EP-11-2 статистически значимо снижают экспрессию проапоптических факторов p53 и Bax, а также увеличивают экспрессию антиапоптического фактора Bcl-2. При расчете соотношения экспрессии Bax к Bcl-2 обнаружено что у животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE соотношение Bax/Bcl-2 статистически значимо повышается более чем в 3 раза, а введение соединения с лабораторным шифром ЕР-11-1 и исходного пептида pHBSP статистически значимо снижают соотношение Bax/Bcl-2 на 57,2 и 56,4% соответственно. Полученные данные согласуются с результатами других исследований, показывающих, что введение эритропоэтина в течение 10 недель заметно снижает соотношение белка Bax/Bcl-2 в аорте мышей с дефицитом аполипопротеина E, получавших диету с высоким содержанием жиров [31]. Наряду с антиапоптическим действием, изучаемые соединения с лабораторными шифрами EP-11-1, EP-11-2 и EP-11-3, более эффективно, чем исходный пептид pHBSP, снизили повышенную на фоне баллонной травмы экспрессию гена, кодирующего iNOS и снизили экспрессию генов и белков молекул межклеточной адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина. При этом максимальная эффективность обнаружена в группе животных, получавших пептид с лабораторным шифром ЕР-11-1. Противовоспалительное действие эритропоэтина и его дериватов широко известно и изучено [32] и наше исследование подтвердило сохранение этого вида активности у дериватов, имитирующих цепь B эритропоэтина.

При проведении исследования фармакологической активности пептидов на изолированных сегментах легочной аорты в группе животных с генотипом Polg^mut/mut/Cdh5-CRE обнаружено, что эндотелийзависимая вазодилатация, индуцированная ацетилхолином, была значительно снижена (70,8% при концентрации ацетихолина 10^-4 М) по сравнению с интактными мышами дикого типа (49,2% при концентрации ацетихолина 10^-4 М). Применение пептида ЕР-11-1 привело к восстановлению эндотелийзависимой вазодилатации, вызванной ацетилхолином в концентрациях 10^-6М, 10^-5М и 10^-4М у мышей с эндотелийспецифической гиперэкспрессией мутантного гена Polg. Введение исходного пептида pHBSP также привело к увеличению расслабления сосуда в ответ на введение ацетилхолина в концентрациях 10^-5М и 10^-4М. Введение пептидов с лабораторными шифрами другого соединения-лидера ЕР-11-2 и ЕР-11-3 статистически значимо не влияло на степень ответа сегмента сосуда на ацетилхолин. Обращает на себя внимание тот факт, что мы не обнаружили изменений в реакции эндотелийнезависимой вазодилатации ни в одной из экспериментальных групп. Указанный факт доказывает, что тканезащитный эффект изученных в настоящем исследовании пептидов включает нормализацию функции сосудистого эндотелия и обуславливает выраженную эндотелиопротективную активность соединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На первом этапе поиска новых производных эритропоэтина, обладающих тканезашитными свойствами без проявления гемопоэтической активности мы модернизировали исходный пептид HBSP путем добавления трипептидных мотивов RGD, KGD и PGP. Полученные соединения сочетали в себе цитопротективный и антиагрегантный эффекты, обладали эндотелиопротективной активностью и были способны защищать сосудистую стенку от атеросклеротического поражения. В настоящем исследовании мы проверили второй пул соединений – производных пептида HBSP с лабораторными шифрами EP-11-1 (UEHLERALNSS), EP-11-2. (UEQLERALNCS), EP-11-3 (UEQLERALNTS)., полученных путем поиска групп родственных пептидов к молекуле pHBSP с помощью программы BLAST. В исследовании, проведенном на мышиной модели эндотелиоспецифичной экспрессии мутантного гена Polg нами показано, что наиболее активное соединение с лабораторным шифром EP-11-1 обладает более выраженной, чем исходный пептид pHBSP, атеропротективной и эндотелиопротективной активностью.

Результаты настоящего исследования, в совокупности с ранее полученными данными, характеризующими фармакологическую активность производных pHBSP, полученных путем добавления трипептидных мотивов RGD, KGD и PGP к исходной молекуле, доказывают эффективность и раскрывают перспективы дальнейшего использования рассматриваемых подходов к поиску новых пептидов – дериватов эритропоэтина, обладающих тканезащитными свойствами и не оказывающих гемопоэтического действия.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено при поддержке гранта Президента РФ MD-757.2020.7 и гранта РФФИ проект №19-34-90073.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

М.В. Корокин – создание идеи, планирование исследования, проведение исследования, статистическая обработка, написание статьи; М.В. Кубекина – подготовка экспериментальных животных, выделение РНК, конвертация РНК в кДНК, анализ экспрессии таргетных генов; А.В. Дейкин – выделение РНК, конвертация РНК в кДНК, анализ экспрессии таргетных генов; О.В. Анциферов – наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов, исследование фармакологической активности; В.М. Покровский – наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов, исследование фармакологической активности; Л.В. Корокина – статистическая обработка, разработка дизайна исследования; Н.Л. Карташкина – статистическая обработка, написание статьи, формализация списка литературы; Солдатова В.А. – наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов, исследование фармакологической активности; Е.А. Кузубова – наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов, исследование фармакологической активности; А.И. Радченко – наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов, исследование фармакологической активности; М.В. Покровский – планирование исследования, консультация по вопросам проведения отдельных этапов экспериментальных работ, обеспечение качества.

Об авторах

Михаил Викторович Корокин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: mkorokin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5402-0697

доктор медицинских наук, доцент, руководитель лаборатории НИИ Фармакологии живых систем

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Марина Владиславовна Кубекина

ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук

Email: kubekina@genebiology.ru
ORCID iD: 0000-0002-8834-1111

аспирант, младший научный сотрудник

Россия, 119334, Россия, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5

Алексей Васильевич Дейкин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»; ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук

Email: alexei@deikin.ru
ORCID iD: 0000-0001-9960-0863

кандидат биологических наук

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85; 119334, Россия, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5

Олег Владимирович Анциферов

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: antsiferov@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6439-2419

cтарший преподаватель кафедры факультетской терапии

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Владимир Михайлович Покровский

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: vmpokrovsky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3138-2075

студент 6 курса

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Лилия Викторовна Корокина

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: korokina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4115-1564

кандидат медицинских наук, доцент, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Наталия Левоновна Карташкина

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» (Сеченовский Университет)

Email: kartashkuna_n_l@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0003-4648-9027

кандидат медицинских наук, доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии,

Россия, 119991, Россия, г. Москва, ул. Трубецкая, 8/2

Валерия Андреевна Солдатова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: lorsoldatova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6637-1654

аспирант кафедры фармакологии

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Елена Валерьевна Кузубова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: 1015artek1015@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2425-5027

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Александра Игоревна Радченко

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: sandrinkaradchenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4554-2116

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Михаил Владимирович Покровский

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: pokrovskii@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1493-3376

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85

Список литературы

Дополнительные файлы