Изучение антимикробной активности новых хиназолин-4(3н)-онов по отношению к Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae

Полный текст

Список сокращений: PBP – пенициллин-связывающий белок; MRSA – метициллин – резистентный Staphylococcus aureus; PBP2a – пенициллин-связывающий белок 2a; АТФ – аденозинтрифосфат, МПК – минимальная подавляющая концентрация; ДМСО – диметилсульфоксид; ДМФА – диметилформамид; МПБ – мясопептонный бульон; МПА – мясопептонный агар; АК – атипичные колонии; ТК – типичные колонии; ЯМР – ядерный магнитный резонанс; ТСХ – тонкослойная хроматография; НК – нуклеиновая кислота; FnBPs – фибронектин-связывающие белки

 

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время мультирезистентность патогенных бактерий к используемым в медицинской практике противомикробным средствам составляет серьезную проблему здравоохранения [1-6]. Как правило, формирование резистентности происходит в процессе антибиотикотерапии, особенно в отделениях с более интенсивным использованием препаратов данной группы. Клиническими исследованиями установлено доминирование антибиотикоустойчивых штаммов в структуре нозокоминальных инфекций. Таким образом, возникает необходимость поиска новых антибактериальных веществ, характеризующихся высокой эффективностью, низкой токсичностью и нечувствительных к подавляющему их активность действию патогенов [7–9].

Доказано, что наибольшей резистентностью к антибиотикам, среди грамположительных микроорганизмов, обладают золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) и пневмококк (Streptococcus pneumoniae), являющиеся наиболее часто встречающимися и выражающими различные факторы вирулентности, возбудителями широкого спектра заболеваний у людей и животных [2, 10–14].

Возникновение устойчивости Staphylococcus aureus к β-лактамным антибиотикам, как и к другим антимикробным средствам, вследствие мутации и отбора, а также за счет приобретения нового генетического материала от других устойчивых организмов в ходе процессов трансформации, трансдукции и конъюгации, предполагающей изменение адгезивных свойств поверхности клетки, ограничивает их применение в медицине. Известно, что функционирование АТФ-зависимых эффлюксных насосов, которые являются белками-переносчиками, выталкивающими противомикробные агенты из клетки, способствует формированию резистентности Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae к фторхинолонам и лекарственным веществам группы тетрациклинов [15–18].

Хиназолин-4(3Н)-он и его производные, которые относятся к конденсированным гетероциклическим азотсодержащим соединениям, известны как перспективный класс веществ, проявляющих антибактериальную, противогрибковую, противотуберкулезную, противовирусную активность [3]. Описана ее зависимость от природы и количества заместителей хиназолинонового ядра. Установлено, что соединения данной группы оказывают фармакологический эффект в отношении Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli [3, 5, 19].

Доказано, что производные хинолина, составляющего основу структуры хиназолинонов, ингибируют синтез ДНК, способствуя расщеплению бактериальной ДНК-гиразы и топоизомеразы типа IV, вследствие чего происходит гибель бактериальной клетки [20–24]. Описана способность соединений хиназолинонового ряда, подобно β-лактамным антибиотикам, применяемым для предотвращения патогенных процессов в организме, вызванных Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae, участвовать в необратимом ацилировании серина активного центра транспептидазы – пенициллин-связывающего белка (PBP), катализирующего образование пептидогликана (муреина), важнейшего компонента клеточной стенки бактерий. В результате образования стабильного лактам-ацил-ферментного комплекса происходит ингибирование транспептидазной и карбоксипептидазной активности фермента, приводящее к гибели патогена.

Установлена уникальная способность хиназолинонов, реализуемая в синергизме с пиперациллином и тазобактамом, образовывать связи с аллостерическим сайтом пенициллин-связывающего белка 2a (PBP2a) метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA) и коагулазонегативных стафилококков, который не может ингибироваться β-лактамами [15, 25–27]. Доказана возможность совместного использования производных хиназолина с хлорамфениколом для увеличения его внутриклеточной концентрации в патогенных штаммах, использующих для сопротивления действию антимикробных лекарственных средств эффлюксные насосные системы [28, 29]. Вероятно, при их прохождении хиназолинон, имея меньшую полярность, в большей степени связывается с эффлюксным насосом, легче подвергается оттоку и облегчает проникновение антибиотика в микробную клетку с неизменной концентрацией [16–18, 20, 21, 30].

Уникальность структуры новых производных хиназолин-4(3Н)-она, возможность использования совместно с другими противомикробными средствами с целью повышения их фармакологического эффекта и предотвращения возникновения устойчивости к ним, создает необходимость всестороннего изучения их активности.

ЦЕЛЬ. Изучение антимикробной активности in vitro производных хиназолин-4(3Н)-она по отношению к Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae, а также оценка влияния структурных изменений на биологическую активность анализируемых веществ, липофильность их молекулы для прогнозирования возможности вызывать устойчивость по механизму активного оттока.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования

Объектами исследования были новые производные хиназолин-4(3Н)-она.

Химическое строение новых хиназолиноновых соединений может быть описано общей формулой, представленной на рисунке 1. Выход и физико-химические свойства новых веществ представлены в таблице 1.

 

Рисунок 1 – Общая формула производных хиназолин-4(3Н)-она

 

Таблица 1 – Химическое строение новых производных хинзолин-4(3Н)-она

Соединение	R1	R2	R3	Выход, %	Т. пл., оС
VMA-10-10	H	H	4-диметиламинофенил	67	261–264
VMA-10-18	Н	Н	4-метоксифенил	61	228–229
VMA-10-21	Н	Н	4-фенилпиперазин-1-ил	73	222–224
VMA-13-05	Н	Н	β-нафтил	56	199–201
VMA-17-01	H	H	фениламино	83	156–158
VMA-17-04	Н	СН3	фениламино	72	222–224
VMA-13-17	Br	H	NHC(NH)NH2	89	242–244

 

Синтез новых производных хинзолин-4(3Н)-она

Синтез новых производных был осуществлен по классической схеме алкилирования нуклеиновых оснований алкилгалогенидами в безводном диметилформамиде (ДМФА) в присутствии избытка калия карбоната. Спектры ЯМР¹Н регистрировали на спектрометре «BrukerAvance 400» (400 МГц) в ДМСО-d₆, внутренний стандарт – тетраметилсилан. Интерпретацию спектров осуществляли с помощью лицензионной программы ACD/HNMR PredictorPro 3.0 фирмы Advanced Chemistry Development (Канада). Температуры плавления измерены в стеклянных капиллярах на приборе Mel-Temp 3.0 (Laboratory Devices Inc., США). Чистоту и индивидуальность соединений контролировали методом ТСХ.

N-[4-(Диметиламино)фенил]-2-[4-оксо-3(4H)- хиназолинил]ацетамид (Лабораторный шифр: VMA-10-10).

Смесь 2,0 г (13,7 ммоль) хиназолин-4(3Н)-она, 4,0 г (28,9 ммоль) безводного карбоната калия и 50 мл ДМФА перемешивают при температуре 100–105°С в течение 30 мин, добавляют 3,2 г (15,1 ммоль) 2-хлор-N-[4-(диметиламино)фенил]ацетамида и перемешивают при той же температуре в течение 1 ч. Охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. Фильтрат выдерживают при температуре 0–5°С в течение суток. Выделившийся осадок отфильтровывают, промывают холодным ДМФА, водой и сушат на воздухе. Перекристаллизовывают из ДМФА и получают 2,95 г соединения VMA-10-10, выход 67%, Т. пл. 261–264°С. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.: 2,78 с (6Н, СН₃). 4,76 с (2Н, СН₂); 6,63 д (8 Гц, 2Н, фенил); 7,34 д (8 Гц, 2Н, фенил); 7,51 т (7 Гц, 1Н, Н⁶); 7,66 д (8 Гц, 1Н, Н⁸); 7,78 т (7 Гц, 1Н, Н⁷); 8,09 д (8 Гц, 1Н, Н⁵); 8,29 с (1Н, Н²); 10,08 с (1Н, NH).

Остальные соединения получают аналогично.

N-(4-Метоксифенил)-2-[4-оксо-3(4H)-хиназолинил]ацетамид (Лабораторный шифр: VMA-10-18). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.: 3,72 с (3Н, ОСН₃); 4,85 с (2Н, СН₂); 7,51 д (8 Гц, 2Н, фенил); 6,90 д (8 Гц, 2Н, фенил); 7,57 т (7 Гц, 1Н, Н⁶); 7,73 д (8 Гц, 1Н, Н⁸); 7,86 т (7 Гц, 1Н, Н⁷); 8,16 д (8 Гц, 1Н, Н⁵); 8,37 с (1Н, Н²); 10,31 с (1Н, NH).

3-[2-Оксо-2-(4-фенилпиперазин-1-ил)этил]хиназолин-4(3H)-он (Лабораторный шифр: VMA-10-21). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.:3,14-3,32 м (4Н, пиперазин); 3,62–3,78 м (4Н, пиперазин); 5,01 с (2Н, СН₂); 6,96–7,01 м (2Н, фенил); 7,23–7,29 м (3Н, фенил); 7,55 т (7,5 Гц, 1Н, Н⁶); 7,71 д (8 Гц, 1Н, Н⁸); 7,86 т (7,5 Гц, 1Н, Н⁷); 8,17 д (8 Гц, 1Н, Н⁵); 8,26 с (1Н, Н²).

N-(2-Нафтил)-2-[4-оксо-3(4H)-хиназолинил]ацетамид (Лабораторный шифр: VMA-13-05). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.: 5,81 с (2Н, СН₂); 7,55-8,89 м (11Н, Н⁵, Н⁶, Н⁷, Н⁸, нафтил); 8,42 с (1Н, Н²).

N-Фенил-2-[4-оксо-3(4H)-хиназолинил]ацетамид (Лабораторный шифр: VMA-17-01). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.: 5,67 с (2H, CH₂); 7,54-7,77 м (5Н, Н⁶, Н⁸, фенил); 7,87 т (1Н, 8 Гц, Н⁷); 8,07–8,19 м (3Н, Н⁵, фенил); 8,39 с (1Н, Н²).

N-Фенил-2-[4-оксо-3(4H)-хиназолинил]пропанамид (Лабораторный шифр: VMA-17-04). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.: 1,53 д (3Н, 7 Гц, СН₃) 5,49 кв (1H, 7 Гц, CH); 7,56-7,80 м (5Н, Н⁶, Н⁸, фенил); 7,85 т (1Н, 8 Гц, Н⁷); 8,06–8,19 м (3Н, Н⁵, фенил); 8,40 с (1Н, Н²).

N-[6-Бромхиназолин-3(4Н)-ил]ацетилгуанидин (Лабораторный шифр: VMA-13-17). Спектр ЯМР ¹Н, δ, м. д.: 4,37 с (2Н, СН₂); 7,47 уш. с (4Н, NH); 7,60 д (1Н, 8 Гц, Н⁸); 7,90 д (1Н, 8 Гц, Н⁷); 8,17 с (1Н, Н²); 8,28 с (1Н, Н⁵).

Тестовые культуры

Первичный микробиологический скрининг антимикробной активности синтезированных соединений с целью выявления соединения-лидера проводили с использованием культур Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных пациентов, предоставленных клинико-диагностической лабораторией, Городская клиническая больница № 3 им. С.М. Кирова, г. Астрахань. Исследования одобрены Этическим комитетом ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России (протокол № 6 от 27.11.2018 г.).

Методы исследования

Анализ веществ, с присвоенными им шифрами: VMA-10-10, VMA-10-18, VMA-10-21, VMA-13-05, VMA-17-01, VMA-17-04, VMA-13-17 проводили in vitro методом серийных разведений в соответствии с требованиями международного стандарта ISO 20776-1:2006¹ и Национального Стандарта ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010², идентичного международному.

Определение чувствительности микроорганизмов к производным хиназолинона проводили макрометодом (пробирочным) в среде мясопептонного бульона (МПБ), приготовленного в соответствии с ГОСТ 20729-75.

Приготовление рабочего раствора

Рабочий раствор готовили, растворяя навеску испытуемого вещества массой 4 мг в 0,5 мл диметилсульфоксидом (ДМСО), с последующим добавлением к нему 4,5 мл физиологического раствора. Выбор растворителя осуществлялся в соответствии с Методическими рекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»³, а также с учетом растворимости исследуемых соединений, с предварительной оценкой воздействия ДМСО на используемые штаммы микроорганизмов [33]. Было установлено, что исследуемые соединения нерастворимы вводе, малорастворимы в 40 и 90% спирте этиловом и хорошо растворимы в ДМСО. Из полученного исходного раствора получали серию растворов с убывающей в геометрической прогрессии концентрацией: 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0,25 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали раствор цефтриаксона (ОАО «Синтез», г. Курган, P N000750/01) с эквивалентной рабочему раствору концентрацией. Рабочие растворы вносили в пробирки по 1 мл.

Приготовление инокулята

Приготовление инокулята вели в соответствии с требованиями, предъявляемыми к методу прямого суспендирования морфологически схожих колоний, собранных при помощи стерильной бактериологической петли, в стерильном изотоническом растворе.

Методика

Суспензии Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae, разведенные в жидкой питательной среде до 10⁶ КОЕ/мл, вносили по 1 мл в пробирки с растворами исследуемых веществ.

Посевы в пробирках, закрытых стерильными ватно-марлевыми пробками, инкубировали в течение суток при температуре +37°С. По истечении срока инкубации проводили их визуальную оценку в проходящем свете. В контрольных пробирках, в которых выращивали нативную культуру без добавления референтного препарата или исследуемых соединений, отмечалось полное помутнение питательной среды, свидетельствующее об интенсивном росте культуры.

Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) исследуемого вещества предполагало установление наименьшей концентрации субстанции, при которой отсутствовал бактериальный рост, о чем свидетельствовало отсутствие помутнения раствора, которое фиксировали визуально.

Оценка роста микроорганизмов

Оценку жизнеспособности бактерий проводили по величине наименьшей концентрации исследуемого вещества, предотвращающей видимый рост бактерии, или иными словами минимальной ингибирующей концентрации. Выполняли посев 0,05 мл осадка, полученного центрифугированием содержимого каждой пробирки серии при 1500 об/мин, в течение 10 мин и отделении супернатанта, на мясопептонный агар (МПА), помещенный в чашки Петри. Питательную среду готовили растворением сухого агара с последующим автоклавированием. После инокуляции чашки Петри помещали в термостат. Спустя 24 ч после инкубации посева при температуре +37°С проводили анализ характерного роста [33].

Определение антимикробной активности испытуемых веществ предполагало шестикратное воспроизведение выбранной методики анализа [31–32]. За бактерицидный эффект, проявляемый веществом, принимали отсутствие роста культуры, тогда как угнетение роста культуры, ее прерывистый рост, образование единичных колоний свидетельствовало о бактериостатическом эффекте.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакетов программ: Microsoft Office Excel 2007 («Microsoft», США), BIOSTAT 2008 Professional 5.1.3.1. («Analyst-Soft» Inc., США). При обработке полученных результатов использовали параметрический метод с определением t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Различия в группах сравнения оценивали при постоянно выбранном уровне значимости p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Анализ антимикробной активности веществ с шифрами: VMA-10-10, VMA-10-18, VMA-10-21, VMA-13-05, VMA-17-01, VMA-17-04, VMA-13-17 показал, что ее проявление зависит от кратности разведения и вида патогенного микроорганизма.

Полученные экспериментальные данные обобщены в таблицах 2–5.

 

Таблица 2 – Показатели визуальной оценки активности соединений в отношении роста Staphylococcus aureus (среда МПБ)

Серии (соединения, препараты)	Концентрация, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1	0,5	0,25
ДМСО	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
Цефтриаксон	–	–	–	–	–	+	++	+++	+++	+++
VMA-10-10	++	++	++	++	++	++	+++	+++	+++	+++
VMA-10-18	+	+	+	+	+++	+++	+++	+++	++++	++++
VMA-10-21	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
VMA-13-05	–	–	–	++	++	++	+++	+++	+++	+++
VMA-17-01	–	–	–	++	++	+++	+++	+++	+++	+++
VMA-17-04	–	–	–	–	++	++	++++	++++	++++	++++
VMA-13-17	+	+	++	++	++	++	+++	+++	+++	+++

Примечание: «–» – полная прозрачность среды; «+-» – неполная прозрачность среды; «+» – слабый рост; «++» – умеренный рост; «+++» – интенсивный рост

 

Анализ характера роста Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae в мясопептонном бульоне и на мясопептонном агаре с ДМСО показал умеренный рост микроорганизмов в концентрации 128 и 64 мкг/мл, а также интенсивный рост в диапазоне концентраций от 32 до 0,25 мкг/мл.

При визуальном контроле посевов Staphylococcus aureus на мясопептонном бульоне признаки роста в пробирках с цефтриаксоном просматривались при низких концентрациях препарата – 2–0,5 мкг/мл. Умеренный рост культуры отмечали в присутствии соединения VMA-10-10 в диапазоне концентраций 128–4 мкг/мл, а в случае VMA-17-01 – 16–8 мкг/мл. Интенсивное развитие клеток, сопровождающееся сильным помутнением питательной среды, образованием хлопьев и обильного осадка, наблюдали в пробирках при концентрациях соединения VMA-10-21 – 128–0,25 мкг/мл.

Значительный рост культуры также зафиксирован в пробирках с веществами VMA-17-04 с концентрацией 4–0,25 мкг/мл и VMА-13-17 при его содержании 2–0,25 мкг в 1 мл раствора.

В таблице 3 представлены результаты посевов Staphylococcus aureus на плотную питательную среду – мясопептонный агар.

 

Таблица 3 – Показатели визуальной оценки активности субстанций в отношении роста Staphylococcus aureus (среда – МПА)

Серии (соединения, препараты)	n	Концентрация, мкг/мл
		128	64	32	16	8	4	2	1	0,5	0,25
ДМСО	6	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
Цефтриаксон	6	–	–	+АК	+АК	+АК	+АК	+++АК	+++АК	+++АК	+++АК
VMA-10-10	6	+++АК	+++АК	+++АК	+++АК	+++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК
VMA-10-18	6	+АК	+АК	+АК	+АК	+++АК	+++ТК	+++ТК	+++ТК	++++ТК	++++ТК
VMA-10-21	6	++АК	+++ТК	+++ТК	+++ТК	++++ТК	++++ТК	++++ТК	++++ТК	++++ТК	++++ТК
VMA-13-05	6	–	–	+АК	+++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК
VMA-17-01	6	–	–	–	++ АК	++ АК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК
VMA-17-04	6	–	–	–	-	++ АК	++АК	++++ АК	++++ АК	++++ АК	++++АК
VMA-13-17	6	+ АК	+ АК	++ АК	++ АК	++ АК	++ АК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК

Примечание: «–» – отсутствие колоний; «+» – единичные колонии; «++» – ≤ 50%, «+++» – ≤ 75%; «++++» – ≤ 100% заселения площади чашки Петри; АК – атипичные колонии; ТК – типичные колонии

 

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что в присутствии контроля, цефтриаксона в концентрациях 128-64 мкг/мл, полностью подавляется рост культуры, тогда как при его содержании 32-4 мкг в 1 мл раствора отмечается рост единичных колоний патогена.

Фиксируется интенсивный рост на мясопептонном агаре Staphylococcus aureus при использовании соединений VMA-10-10 в концентрациях 128–0,25 мкг/мл и VMA-10-21 – при 64–0,25 мкг/мл. В диапазонах концентраций 128–16 мкг/мл вещества VMA-17-04, 128-64 мкг/мл – VMA 13-05, 128–32 мкг/мл – VMA-17-01 роста колоний не наблюдалось. Результаты указывают на способность данных соединений подавлять развитие Staphylococcus aureus и, как следствие, проявлять ярко выраженную противомикробную активность в отношении патогена.

В таблице 4 представлены результаты посевов Streptococcus pneumoniae на жидкую питательную среду (мясопептонный бульон).

 

Таблица 4 – Показатели визуальной оценки активности соединений в отношении роста Streptococcus pneumoniae (среда МПБ)

Серии (соединения, препараты)	Концентрация, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1	0,5	0,25
ДМСО	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
Цефтриаксон	–	–	–	–	–	+	+	+	+	+
VMA-10-10	+ –	+ –	+ –	+	+	++	++	+++	+++	+++
VMA-10-18	+	+	+	+	+++	+++	+++	+++	++++
VMA-10-21	+	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
VMA-13-05	–	–	–	+	+ –	++	+++	+++	+++	+++
VMA-17-01	–	–	+ –	+ –	+	++	++	+++	+++	+++
VMA-17-04	–	–	+	+	+	+	++	++	+++	+++
VMA-13-17	+	+	+	+	+	+	+++	+++	+++	+++

Примечание: «–» – полная прозрачность среды; «+ –» – неполная прозрачность среды; «+» – слабый рост; «++» – умеренный рост; «+++» – интенсивный рост

 

При визуальном контроле посевов Streptococcus pneumonia на мясопептонный бульон признаки роста в пробирках с цефтриаксоном просматривались при концентрации 4–0,25 мкг/мл. Умеренный рост культуры отмечали в присутствии соединения VMA-10-21 в диапазоне концентраций 64–0,25 мкг/мл, веществаVMA-10-18 – при его содержании 8-0,25 мкг в 1мл. Более низкие значения установлены для производныхVMA-13-17, VMA-13-05 – 2–0,25 мкг/мл и VMA-10-10, VMA-17-01 – 1–0,25 мкг/мл.

Полная прозрачность среды наблюдалась в пробирках с хиназолиноновым производнымVMA-13-05 при концентрации 128–32 мкг/мл, соединениями VMA-17-01 и VMA-17-04 при содержании 128–64 мкг активного компонента в 1 мл. Полученные результаты указывают на ярко выраженную антипневмококковую активность веществ.

Из данных таблицы 5 следует, что культура Streptococcus pneumoniae дает обильный рост на МПА в присутствии соединений VMA-10-10, VMA-10-18 в концентрациях 4–0,25 мкг/мл, вещества VMA-13-05 – при 8–0,25 мкг/мл и производногоVMA-17-04 при концентрациях 2–0,25 мг/мл. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии чувствительности патогена к указанным веществам при данном разведении.

 

Таблица 5 – Показатели активности субстанций в отношении роста Streptococcus pneumoniae (среда МПА)

Серии (соединения, препараты)	n	Концентрация, мкг/мл
		128	64	32	16	8	4	2	1	0,5	0,25
ДМСО	6	++	++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++
Цефтриаксон	6	–	–	–	+АК	+АК	+АК	++АК	++АК	++АК	++АК
VMA-10-10	6	++АК	++АК	++АК	++АК	++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК
VMA-10-18	6	++ АК	++АК	++ АК	++ АК	+++АК	+++ТК	+++ТК	+++ТК	++++ТК	++++ТК
VMA-10-21	6	+АК	+ТК	++ТК	++ТК	+++ТК	+++ТК	+++ТК	+++ТК	++++ТК	++++ТК
VMA-13-05	6	–	–	–	–	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК	++++АК
VMA-13-17	6	+ АК	+ АК	++ АК	++ АК	++ АК	++ АК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК
VMA-17-04	6	–	–	+ АК	+АК	++ АК	++ АК	++++ ТК	++++ ТК	++++ ТК	++++ ТК
VMA-17-01	6	–	–	+АК	++ АК	++ АК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК	+++ ТК

Примечание: «–» – отсутствие колоний; «+» – единичные колонии; «++» – ≤ 50%, «+++» – ≤ 75%; «++++» – ≤ 100% заселения площади чашки Петри; АК – атипичные колонии; ТК – типичные колонии.

 

При содержании VMA-13-05 в концентрации 128–16 мкг/мл рост колоний патогенного штамма не наблюдается, что аналогично эффектам VMA-17-04 и VMA-17-01 в диапазоне концентрации 128–64 мкг/мл. Следовательно, вещества характеризуются высокой противомикробной активностью в отношении Streptococcus pneumoniae при таком содержании в растворе.

В таблице 6 показаны среднестатистические результаты оценки антибактериального действия наиболее активных субстанций в отношении штаммов Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae.

 

Таблица 6 – Среднестатистические результаты антибактериального действия наиболее активных субстанций в отношении штаммов Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae

Серии (соединения, препараты)	Концентрация, мкг/мл
	128	64	32	16	8	4	2	1	0,5	0,25
Цефтриаксон	0	0	0	0	0	18,1±2,3	18,8±2,2	19,3±2,2	22,5±3,6	22,7±3,2
В отношении штаммов Staphylococcus aureus
VMA-13-05	0	0	0	29,5±2,4 ***	32,1±3,1 ***	38,4±3,8 **	59,4±4,7 ***	65,3±4,2 ***	65,8±5,6 ***	68,3±5,4 ***
VMA-17-01	0	0	0	28,3±2,1 ***	33,8±3,7 ***	39,9±4,2 **	64,4±4,3 ***	65,7±4,1 ***	65,6±6,6 ***	69,3±6,1 ***
VMA-17-04	0	0	0	0	27,3±3,1 ***	28,1±2,8 *	78,4±5,9 ***	81,3±7,1 ***	83,6±7,3 ***	85,2±6,5 ***
В отношении штаммов Streptococcus pneumoniae
VMA-13-05	0	0	0	14,3±1,8 ***	16,4±2,1 ***	26,3±1,8 *	61,3±4,8 ***	63,8±5,6 ***	66,4±5,2 ***	71,6±6,9 ***
VMA-17-01	0	0	12,3±1,8 ***	14,9±2,0 ***	15,7±1,9 ***	25,9±1,8 *	27,3±2,0 *	56,4±4,6 ***	62,3±4,9 ***	68,3±6,0 ***
VMA-17-04	0	0	10,2±1,3 ***	12,7±1,8 ***	12,8±1,4 ***	13,2±1,9	26,2±1,9 *	28,6±2,2 **	53,8±5,2 ***	55,7±5,2 ***

Примечание: * – р<0,05; ** – p<0,01; *** – р<0,001 – по отношению к показателям антибактериального действия цефтриаксона

 

Анализируя среднестатистические результаты антибактериального действия наиболее активных субстанций в отношении патогенных микроорганизмов, можно сделать вывод о том, что бактерицидная активность соединений VMA-13-05, VMA-17-01 и VMA-17-04 сопоставима с действием цефтриаксона в концентрациях 128 и 64 мкг/мл; в отношении Staphylococcus aureus – в концентрации 32 мкг/мл. При анализе антимикробного действия наиболее активных соединений хиназолина в последующих концентрациях установлено, что бактерицидная активность VMA-13-05, VMA-17-01 и VMA-17-04 статистически значимо снижается по мере уменьшения концентрации веществ по отношению к препарату сравнения – цефтриаксону.

Гетероциклическая природа веществ хиназолинонового ряда обуславливает их способность ингибировать активность PBP2а за счет образования водородных связей с аминокислотами аллостерического сайта фермента: лизином, глутамином и аспарагином. Вследствие такого взаимодействия происходит открытие активного сайта, в котором карбонильная группа и атом азота другой молекулы противомикробного агента ковалентно связываются с карбоксильной и аминогруппой лизина и аргинина. Происходит подавление работы фермента и, как следствие, блокирование биосинтеза клеточной стенки бактерии [37-40]. Анализ влияния различных заместителей в молекуле производных хиназолинона позволил выявить функциональные группы и структурные фрагменты, принимающие участие в образовании химической связи с остатками аминокислот фермента за счет чего, вероятно, реализуется фармакологический эффект веществ. Исследования взаимосвязи структуры и активности производных хиназолинона показали, что наличие замещенного ароматического кольца в положении 3 и метильной группы, является существенным для проявления соединением противомикробной активности [34]. При этом соединения хиназолинонов, содержащие фенильный радикал, характеризуются более высокой аффинностью связывания, чем вещества с метильной группой, что может быть объяснено увеличением числа гидрофобных связей с аминокислотами активного сайта [35]. Показано, что заместитель в фенильном кольце также оказывает значительное влияние на антибактериальную активность. Метокси-, метил-, гидрокси-группы, а также атомы брома и хлора, увеличивают противомикробный эффект [24]. Доказано, что объединение двух или более биологически активных фрагментов в одной молекуле также способствует повышению антибактериального эффекта вследствие изменения степени полярности молекулы лекарственного вещества [1].

Описан механизм взаимодействия веществ с ДНК-гиразой, который также зависит от природы заместителей, определяющих полярность молекулы, ее способность образовывать различные химические связи с ферментом. Известно, что в данном случае гибель бактериальной клетки опосредована нарушением синтеза ДНК при ингибировании ДНК-гиразы, участвующей в раскручивании (отрицательной суперспирализации) молекулы нуклеиновой кислоты (НК), производным хиназолинона [37]. Установлено, что его влияние может быть объяснено образованием промежуточного комплекса «ДНК-топоизомераза-хиназолинон» за счет донорно-акцепторного взаимодействия атома кислорода карбонильной группы антимикробного агента и фосфатной группы ДНК, азота с гуанином и аспарагином НК, заместителей хиназолиноновой молекулы с ее неполярными группами. Связывание с активным сайтом фермента происходит за счет водородных связей производного хиназолинона с аминокислотными остатками серина и аргинина [37].

Не исключается возможность взаимодействия производных хиназолинона с предшественниками пептидогликана, что приводит к ингибированию его полимеризации (трансгликозилирования) и последующей стадии перекрестного связывания (транспептидации). Бактерицидное действие лекарственного вещества реализуется при образовании промежуточного комплекса «хиназолинон – производное пептидогликана», вследствие чего возникает деполяризация оболочки, увеличивается ее проницаемость и происходит утечка ионов калия и цитоплазматического АТФ, приводящая к гибели клетки [41, 42].

Представление о функционировании эффлюксных насосов увеличивает ряд требований, предъявляемых к исследуемым противомикробным веществам, в виде сочетания высокой эффективности с устойчивостью к оттоку, одним из вариантов достижения которой может являться диссипация мембранного потенциала [29, 34]. Доказано, что присутствие кето-группы, бензильного радикала и атомов азота в хиназолиноновой структуре способствует снижению липофильности; ковалентно связанный бром в ядре хиназолина, метоксифенильный и метильный заместители, наоборот, повышают гидрофобность [35, 36]. Насыщенность молекул хиназолиноновых производных центрами, снижающими гидрофобность, позволяет сделать предположение о незначительной степени связывания с белками оттока и, как следствие, низкой вероятности возникновения резистентности к этим веществам с точки зрения теории оттока [5, 7, 28].

Анализ полученных результатов показывает, что соединение VMA-17-04, и в меньшей мере VMA-13-05, активны в отношении Staphylococcus aureus и обладают бактериостатическим действием. Структура вещества VMA-13-05 содержит нафтильный заместитель, который делает молекулу более липофильной и, как следствие, повышает ее проникновение в клеточную мембрану патогенной культуры. Полярность VMA-17-04, обусловленная амидной группой, связанной с хиназолиноновой составляющей и бензольным кольцом, обуславливает увеличение степени взаимодействия электронодонорного центра в виде атома азота с активными сайтами ферментов, катализирующих процессы репликации ДНК и синтеза белков.

Оценка антимикробной активности исследуемых соединений в отношении Streptococcus pneumoniae показывает проявление бактериостатического эффекта производным VMA-13-05. Соединения VMA-17-04 и VMA-17-01 характеризуются слабо выраженным противомикробным действием.

Вещество VMA-10-10 практически не влияет на Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae.

Вероятно, различие в химическом составе компонентов мембраны грамположительных бактерий может служить причиной неодинакового проявления фармакологической активности веществами VMA-17-04 и VMA-13-05 в отношении патогенов. Присутствие в молекулах производных хиназолинона отличающихся по строению заместителей обуславливает различие в механизме их связывания с веществами клеточной оболочки патогенов, выполняющих роль адгезивов, являющихся одним из факторов вирулентности данных микроорганизмов. Установлено, что основную роль в процессе адгезии Streptococcus pneumoniae играют коллагенсвязывающий и фибронектинсвязывающий протеины, липотейхоевая кислота, а также поверхностный фосфорил-холин, входящий в составе тейхоевой кислоты с прикрепленными к нему холинсвязывающими белками. Адгезивная активность Staphylococcus aureus осуществляется за счет фибриноген-связывающего белка, молекулы которого связаны с пептидогликаном клеточной стенки, коллагенового адгезина, внеклеточного белка, связывающих фибронектин белков, тейхоевой кислоты, а также стафилококкового гаптоглобинового рецептора, состоящего из 145 остатков аминокислот [43].

Природа заместителей в молекуле обуславливает различную степень липофильности соединений, которая, согласно Гиббонсону, является важным свойством вещества, характеризующим его растворимость в бактериальной мембране и степень связывания с белками оттока или субстратами помпы. Гидрофобность производных служит фактором, снижающим распознавание и транспортировку откачивающим насосом антимикробных агентов, что особенно важно при поиске ингибиторов их оттока [29]. Липофильность структуры VMA-13-05 хоть и предполагает лучшее связывание с белком эффлюксного насоса, что может привести к возникновению резистентности у Staphylococcus aureusи Streptococcus pneumoniae за счет уменьшения концентрации антимикробного средства, однако не может служить объективной характеристикой данного процесса без дополнительных данных, полученных альтернативными методами анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, среди синтезированных производных хиназолин-4(3Н)-она были выявлены вещества, проявляющие выраженную антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus (VMA-17-04) и Streptococcus pneumoniae (VMA-13-05), что, очевидно, обусловлено влиянием липофильного участка их молекул на проявление противомикробного действия. Результаты, полученные в ходе данного исследования, определяют перспективность дальнейшего изучения противомикробных свойств новых соединений хиназолина-4(3Н)-она с целью повышения их фармакологического эффекта и предотвращения развития резистентности патогенных микроорганизмов.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Данная работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения РФ в части проведения НИР по теме «Поиск и разработка перспективных соединений с антибактериальной активностью среди производных пиримидина для создания лекарственных препаратов» 48.2-2021.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

М.А. Самотруева – разработка концепции и дизайна исследования, планирование исследования, проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение для публикации рукописи; А.А. Озеров – разработка схемы синтеза производных, получение данных по физико-химическим свойствам и спектральным характеристикам веществ, редактирование рукописи, окончательное ее утверждение для публикации; А.А. Старикова – сбор данных, написание текста, химическое обоснование протекающих процессов с учетом строения исследуемых веществ, подготовка черновика рукописи; Н.М. Габитова – проведение микробиологического исследования, оценка, обоснование и статистическая обработка полученных данных; Д.В. Мережкина – осуществление синтеза производных хиназолина; А.А. Цибизова – сбор данных, оценка, обоснование и статистическая обработка полученных данных; И. Н. Тюренков – планирование исследования, методология исследования, редактирование рукописи, оценка результатов, полученных микробиологическими методами; окончательное утверждение публикации рукописи.

 

¹ CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. CLSI document M100-S25. Wayne, PA: Clinicaland Laboratory Standards Institute; 2015.

² Национальный Стандарт ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни.

³ МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. – 91 с.

Об авторах

Марина Александровна Самотруева

ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ms1506@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5336-4455

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фармакогнозии, фармацевтической технологии и биотехнологии

Россия, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121

Александр Александрович Озеров

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

Email: prof_ozerov@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-4721-0959

доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии

Россия, 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших Борцов,1; 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших Борцов,1

Алла Андреевна Старикова

ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: alhimik.83@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5210-5248

ассистент кафедры химии фармацевтического факультета

Россия, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121

Нармина Муталлимага-кызы Габитова

ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ФГБУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: narmina85@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-3867-8330

ассистент кафедры фармакогнозии, фармацевтической технологии и биотехнологии; младший научный сотрудник

Россия, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121; 414057, Россия, г. Астрахань, пр. Николая Островского,3

Дарья Владимировна Мережкина

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: merezhkinad@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9848-7149

аспирант кафедры фармацевтической и токсикологической химии

Россия, 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших Борцов,1

Александра Александровна Цибизова

ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: sasha3633@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9994-4751

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии, фармацевтической технологии и биотехнологии

Россия, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121

Иван Николаевич Тюренков

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

Email: fibfuv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7574-3923

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент Российской академии наук, заведующий кафедрой фармакологии и фармации Института непрерывного медицинского и фармацевтического образования факультета усовершенствования врачей

Россия, 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших Борцов,1; 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1

Список литературы

Дополнительные файлы