Соединение ДФ-5 замедляет развитие диабетической нефропатии у крыс

Полный текст

Список сокращений: БСА – бычий сывороточный альбумин; ВКМ – внеклеточный матрикс; ГБМ – гломерулярная базальная мембрана; ДМСО – диметилсульфоксид; ИК – инфракрасная спектроскопия; ИФА – иммуноферментный анализ; КПГ – конечные продукты гликирования; Т_пл – температура плавления; ЯМР – ядерный магнитный резонанс; IDF – Международная диабетическая федерация; HbA1c – гликированный гемоглобин.

ВВЕДЕНИЕ

Диабет является серьезным хроническим заболеванием, значимость которого определена его распространенностью в мире, затратами на лечение и последствиями для здоровья [1]. По оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)¹, в 2014 г. в мире в общей сложности 422 млн взрослых людей были больны диабетом, а уже в 2019 г. оценочная смертность, связанная непосредственно с данным заболеванием, достигла 1,5 млн случаев. По данным Международной диабетической федерации (International Diabetes Federation – IDF), в 2021 году во всем мире насчитывалось около 537 млн человек с диабетом, что подтверждает высокую скорость распространения заболевания.

Диабет и его осложнения стремительно приобретают характер самой значимой причины заболеваемости и смертности в мире. В условиях хронической гипергликемии глюкоза и другие восстанавливающие сахара реагируют с белками в каскаде неферментативных реакций, образующих класс гетерогенных соединений, именуемых – конечные продукты гликирования (КПГ) [2, 3]. Некоторые КПГ представляют собой стабильные поперечные сшивки, образующиеся на многих крупных белках, таких как коллаген и эластин, на протяжении всего периода их существования, ковалентно модифицируя их структуру и нарушая функцию. По данным многих исследований, образование КПГ в долгоживущих компонентах соединительной ткани и внеклеточного матрикса является причинным фактором развития поздних осложнений диабета и возрастных заболеваний [4–10]. КПГ играют важную роль в патогенезе таких осложнений диабета, как нефропатия, нейропатия, ретинопатия, катаракта, кардиомиопатия. КПГ принимают участие в формировании иммунопатологий, неопластических заболеваний и атеросклероза [2, 11, 12].

При диабетической болезни почек КПГ могут накапливаться в гломерулярной базальной мембране (ГБМ), мезангиальных клетках, эндотелиальных клетках и подоцитах. Следовательно, КПГ играют важную роль в развитии и прогрессировании нефропатии, что в свою очередь приводит к формированию гломерулосклероза и тубулоинтерстициального фиброза [7]. Кроме этого, сильно гликированные белки устойчивы к разрушению протеасомными и лизосомальными протеолитическими системами [13]. Способность анти-КПГ агентов снижать уровень КПГ в тканях считается потенциально эффективным терапевтическим подходом к восстановлению эластичности внеклеточного матрикса (ВКМ) сосудов, а также к лечению сосудистых диабетических осложнений и предотвращению их прогрессирования.

В настоящем исследовании мы приводим усовершенствованную методику синтеза нового представителя антисшивающих агентов, 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (соединение ДФ-5, I), представляем результаты оценки его активности in vivo, а именно: влияние на уровни гликированного гемоглобина (HbA1c), массу тела, уровень глюкозы в крови и развитие ранних проявлений поражения почек у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином. Активность этого нового антисшивающего агента in vivo была сопоставлена с активностью хорошо известного разрушителя КПГ-сшивок – соединения ALT-711 (алагебриум) [14].

ЦЕЛЬ. Оценка способности нового антисшивающего соединения ДФ-5 влиять на количество конечных продуктов гликирования и коллагена в почках, на массу тела, уровни глюкозы и гликированного гемоглобина, а также на развитие ранних проявлений поражения почек у крыс со стрептозотоциновым сахарным диабетом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Все химические вещества, использованные в настоящем исследовании, имели аналитическую чистоту и доступны для приобретения. Стрептозотоцин и 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин были приобретены от Sigma-Aldrich (США); глюкоза приобретена от «Агат-Мед» (Россия); бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция V – Biowest (Франция); диметилсульфоксид (ДМСО) был приобретен от Fisher Scientific (США); кроличьи поликлональные антитела к БСА и козьи вторичные антитела к кроличьим IgG были приобретены от Cloud-Clone (США); 10% нейтральный забуференный формалин, набор реактивов для окраски по Массону и гематоксилин были приобретены от «Модитех» (Россия); гомогенизированные парафиновые среды – от фирмы «Био Витрум» (Россия); кроличьи поликлональные антитела к КПГ были приобретены от Abcam (США); соединение ALT-711 было приобретено от Kailu Xingli Pharmaceutical Co., Ltd. (Китай).

Синтез 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (соединение ДФ-5)

Синтез соединения ДФ-5 (I·HCl) был проведен в Институте физической и органической химии Южного федерального университета (Ростов-на-Дону, Россия) из 2-амино-1-бензилбензимидазола (II).

ИК-спектры (ν/см^–1) новых соединений регистрировали с применением спектрофотометра Varian Excalibur 3100 FT-IR (Varian, USA) для порошкообразных образцов, с применением метода ослабленного полного отражения; спектры ¹Н ЯМР зарегистрированы с применением спектрометра Bruker Avance 600 (Германия). Химические сдвиги для ¹H даны в виде значений δ в миллионных долях (ppm) относительно сигналов остаточных протонов дейтерированного растворителя ДМСО-d₆ и CDCl₃ (δ 2,49 и 7,24 соответственно), а константы связи выражены в герцах (Гц). Температуры плавления определяли с применением Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher Scientific, США). Элементный анализ проводили классическим методом [15]. Ход реакции и чистоту полученных соединений контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (пластины с Al₂O₃ III степени активности, элюент CHCl₃, визуализация парами йода во влажной камере).

2-Имино-3-[(2-бифенил-4-ил)-2-оксоэтил)]-1-бензилбензимидазолина гидробромид (III). К горячему раствору 2,23 г 2-аминобензимидазола II (10 ммоль) в 65 мл MeCN добавляли 4-(бромацетил)бифенил (2,75 г, 10 ммоль). Смесь перемешивали до растворения кватернизирующего реагента, затем нагревали до завершения образования осадка и выдерживали 6–8 ч при комнатной температуре. После этого осадок соли III отфильтровывали и тщательно промывали ацетоном. Выход 94%, Т._пл. 254–256°С. ИК, ν/см^-1: 3207, 3240 (NH₂), 1687 (С=О). Установлено: C 67,47; H, 4,85; Br, 16,03; N, 8,43%. Элементный анализ для C₂₈H₂₄BrN₃O: С 67,45; Н, 4,88; Br, 16,00; Н, 8,39%. ¹Н ЯМР (600 МГц, ДМСО-d6), δ: 5,57 (s, 2Н, СH₂CO); 6,07 (s, 2H, N_BzmCH₂); 7,30–7,36 (m, 5H, 5,6-H_Bzm + 3H_Ph); 7,40–7,48 (m, 3Н, 2H_Ph + 1H_Biph); 7,51–7,55 (m, 3Н, 7-H_Bzm +2H_Biph); 7,67–7,68 (m, 1Н, 4-H_Bzm); 7,81 (d, 2Н, 2H_Biph, J 7,2 Гц); 7,97 (d, 2Н, H_Biph, J 8,4 Гц); 8,19 (d, 2Н, H_Biph, J 8,4 Гц); 9,06 (s, 2H, N+H₂).

9-Бензил-2-(бифенил-4-ил)-9Н-имидазо[1,2-а]бензимидазол (I). Смесь 2 г (4,0 ммоль) бромида II, 0,89 г тонкоизмельченного Na₂CO₃, 40 мл EtOH и 9 мл воды кипятили до завершения реакции (20–25 ч). Затем из реакционной смеси отгоняли спирт, добавляли воду (25–30 мл), продукт отфильтровывали и сушили на воздухе. Полученное основание очищали колоночной хроматографией на Al₂O₃, CHCl₃ использовали в качестве элюента, собирали фракцию с R_f=0,9. После выпаривания растворителя остаток перекристаллизовывали из ДМФА. Получали 1,3 г (81%) соединения I.

Смесь 2,0 г (4 ммоль) амина III и 0,33 г (4 ммоль) свежерасплавленного ацетата натрия кипятили в ледяной уксусной кислоте (5 ч), контролируя полноту реакции тонкослойной хроматографией. Затем реакционную массу охлаждали до комнатной температуры, отфильтровывали осадок имидазо[1,2-а]бензимидазола (I), промывали водой и сушили при 85°С. Выход 1,5 г (92%), Т._пл. 228–229°С. ИК, ν/см^-1: 1513, 1617 (С=С), 1664 (С=N). Установлено: С 84,21; Н, 5,38; Н, 10,46%. Элементный анализ для C₂₈H₂₁N₃: С 84,10; Н, 5,30; Н, 10,52%. ¹H ЯМР (600 МГц), δ: 5,76 (s, 2H, CH₂); 7,29–7,53 (m, 10Н, 5H_Ph, 6,7-H_Bzm +3H_Biph), 7,76 (d, 2Н, H_Biph, J = 7,9 Гц), 7,84 (d, 2Н, 5,8-Н_Bzm, J = 8,3 Гц) , 7,97 (d, 1Н, Н_Ar, J 7,8 Гц), 8,03 (d, 2Н, Н_Ar, J 8,3 Гц); 8,64 (s, 1H, 3-H).

Гидрохлорид 9-бензил-2-(бифенил-4-ил)-9H-имидазо[1, 2-a]бензимидазола (ДФ-5). Соединение получали обработкой имидазо[1,2-а]бензимидазола I конц. HCl. Выход 93%, Т._пл. 237–238°С. ИК, ν/см^-1: 1512, 1614 (С=С), 1663 (С=N). Установлено: C, 77,11; H, 5,13; Cl, 8,08; N, 9,58%. Элементный анализ для C₂₈H₂₁N₃• HCl: C, 77,14; H, 5,09; Cl 8,13; N, 9,64%.

Расщепление в условиях in vitro комплексов «КПГ-БСА-коллаген»

Способность ДФ-5 расщеплять предварительно сформированный комплекс КПГ-БСА-коллаген проверяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) [16], с незначительными модификациями. Детально методика описана в RU 2627769 С1, Россия (2017) [17].

Коллаген экстрагировали из крысиных хвостов 0,1% (вес/объем) раствором уксусной кислоты в течение 7 сут, затем центрифугировали (8000 g, 10 мин) для осаждения нерастворившихся фрагментов. Полученный гель использовали для покрытия лунок планшета. Для получения гликированного БСА (БСА-КПГ) раствор БСА (50 мг/мл) инкубировали с глюкозой (0,5 М) в фосфатном буферном растворе в течение 3-х мес. В лунки планшета добавляли БСА-КПГ и проводили инкубацию при 37°C в течение 4 ч для образования поперечных связей (комплексы КПГ-БСА-коллаген). Растворы ДФ-5 или ALT-711 добавляли в лунки планшета после инкубации, затем планшет инкубировали вновь при 37°C в течение 16 ч. После промывки в лунки планшета добавляли 80 мкл/лунка кроличьих антител к БСА (1:500) и планшет инкубировали в течение 50 мин при 37°С. После следующей промывки добавляли 80 мкл/лунка меченных пероксидазой хрена козьих антикроличьих вторичных антител IgG (1:1000) и инкубировали в течение 50 мин при 37°С, затем добавляли по 100 мкл/лунка субстрата 3,3›,5,5’-тетраметилбензидина. После 20 мин инкубации в темноте при комнатной температуре реакцию останавливали с применением раствора кислоты серной 2М. Оптическую плотность проб определяли при длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера Infinite M200 Pro (Tecan, Австрия).

При оценке активности каждого соединения были сформированы 4 группы данных: 1) гликированный БСА + коллаген, 2) гликированный БСА + коллаген + исследуемое соединение, 3) негликированный БСА + коллаген, 4) негликированный БСА + коллаген + исследуемое соединение. Для минимизации интерференции из-за неспецифической адгезии БСА на коллагеновую матрицу из результатов проб, содержащих гликированный БСА, были вычтены результаты проб соответствующего состава, содержащих негликированный БСА.

Животные

Эксперименты на животных проводились в соответствии со стандартами, установленными законодательством Российской Федерации (ГОСТ Р 33044-2014 и ГОСТ Р 33647-2015) и техническими стандартами надлежащей лабораторной практики EASC. Исследование было одобрено локальным комитетом по этике научных исследований (Волгоград, Россия) [регистрационный номер: IRB 00005839 IORG 0004900 (OHRP)] от 5 июня 2015 г. (протокол № 2016-2015).

Самцы крыс Sprague-Dawley (возраст 5–6 недель, масса тела 200–230 г) были приобретены в ООО «НИЦ БМТ», (Москва, Россия). Животные находились в виварии ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России. Адаптацию животных к условиям содержания проводили в помещении с 12/12-часовым циклом свет/темнота при температуре окружающей среды 25°С в течение 2 недель после доставки. До начала исследования животные имели свободный доступ к пище и воде.

Моделирование сахарного диабета крыс

Диабет у крыс моделировали путем однократной внутрибрюшинной инъекции стрептозотоцина (65 мг/кг в цитратном буфере, рН 4,5) после ночного голодания. Процедуру моделирования выполнили на 40 животных. Животным из группы недиабетического контроля вводили цитратный буфер (n = 10). Через 3 сут после инъекции стрептозотоцина только крысы с тощаковым уровнем глюкозы в крови, превышающим 15 ммоль/л, были классифицированы как диабетические и включались в исследование (n=30). Животные, не достигшие этого критерия, были исключены из текущего эксперимента (n=10). Пять крыс с развившимся диабетом погибли в течение следующих 2-х мес после введения стрептозотоцина (до начала разделения на группы и лечения).

Выбор эффективной дозы (12,5 мг/кг) для ALT-711 и ДФ-5 был основан на результатах экспериментальных исследований ALT-711 на различных животных моделях осложнений сахарного диабета [18-20]. Через два месяца после развития диабета животные с экспериментальной патологией (n=24) были случайным образом разделены на три группы: контрольная группа с диабетом без лечения (получала дистиллированную воду, 5 мл/кг внутрижелудочно) и две опытные группы, получавшие либо ДФ-5, либо ALT-711 (12,5 мг/кг соответствующего соединения, растворенного в дистиллированной воде, 5 мл/кг внутрижелудочно). Для достижения равных объемов групп (8 животных в группе) до начала лечения из исследования были исключены 3 объекта (2 крысы без диабета и 1 крыса с диабетом). В течение 4-недельного периода лечения введение соединений осуществляли через внутрижелудочный зонд 1 р/сут утром (спустя 1 ч после включения света). Группа здоровых животных, не получавших лечения, находилась в таких же условиях, включая манипуляции с введением (дистиллированная вода, 5 мл/кг). У всех животных периодически определяли уровень глюкозы в крови и масса тела. Общее время, отведенное на исследование, составляло более 12 недель.

Биохимические исследования

Уровень глюкозы в крови измеряли с помощью глюкометра (Glucocard, Arkray, Япония) после забора образцов крови из хвостовой вены. Концентрацию HbA_1c определяли в конце исследования с помощью набора Diabet-Test Assay Kit (HbA_1c) (ООО «Фосфосорб», Россия) согласно инструкции производителя.

Определение функции почек

Функцию почек оценивали в конце исследования путем измерения суточного диуреза, общей концентрации белка в моче и его экскреции. В ходе забора материала крыс помещали в метаболические камеры («Открытая наука», Россия) для сбора суточной мочи. Общий белок мочи определяли с помощью соответствующего набора для анализа – Общий белок-ПК-Витал (Кат. № Б 06.03, ОАО «Витал Девелопмент Корпорэйшн», Россия) согласно инструкции производителя.

Гистологические и иммуногистохимические исследования почек

По окончании эксперимента животных декапитировали (предварительно наркотизировав хлоралгидратом, 400 мг/кг внутрибрюшинно). Почки удаляли, образцы коркового и мозгового вещества почек фиксировали в течение 24 ч в 10% (масса/объем) нейтральном забуференном формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной 3–5 мкм окрашивали трихромом по Массону для оценки гломерулосклеротических изменений и отложений соединительной ткани. Другие фиксированные формалином срезы почек помещали на предметные стекла и окрашивали с применением кроличьих поликлональных антител к КПГ в соответствии с инструкциями производителя. После протекания иммунологической реакции ткани окрашивали гематоксилином. Визуализация выполнялась с помощью микроскопа Axiostar Plus (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия) и цифровой камеры Axiocam 105 Color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Изображения анализировали с помощью программного обеспечения Zeiss Zen Pro 2012 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Результаты выражали как процент площади с положительным окрашиванием.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., США). Данные анализировали с применением ANOVA с пост-тестом Тьюки (множественное сравнение с контрольной группой), предварительную проверку нормальности распределения данных проводили с применением критерия Шапиро-Уилка. Уровень p≤0,05 считался пороговым при определении статистической значимости. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M+SD).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Химический синтез

Соединение I синтезировано из 2-амино-1-бензилбензимидазола (III) в ходе последовательных реакций, изображенных на рисунке 1, как описано ранее [21], но с дополнительной модификацией стадии 2. На первой стадии амин III кватернизовали с применением эквимолярного количества 4-(бромацетил)бифенила (MeCN, комнатная температура, 6–8 ч) с получением выхода соли III. Затем на завершающей стадии эту соль подвергли циклизации в среде MeCOOH (кипячение, 5 ч) в присутствии ацетата натрия. Выход соединения I составил 92%, что значительно больше, чем при циклизации соли III в водн./EtOH среде [21], а время реакции в этом случае значительно меньше. Отметим, что при кипячении ДМФА циклизация протекает еще быстрее (15–20 мин), но с низким выходом.

 

Рисунок 1 – Схема синтеза гидрохлорида 9-бензил-2-бифенилимидазо[1,2-а]бензимидазола (соединение ДФ-5)

 

Разрушение комплексов КПГ-БСА-коллаген, предварительно сформированных in vitro

Было установлено, что соединение ДФ-5 проявляет выраженную антисшивающую активность в отношении предварительно сформированных поперечных сшивок, стабилизирующих комплекс КПГ-БСА-коллаген (IC₅₀=0,31 мМ), что в 6 раз превосходит соответствующую активность соединения ALT-711 (Рис. 2) (IC₅₀=1,89 мМ). Способность соединения ALT-711 разрушать поперечные сшивки была многократно описана, хотя механизм действия до настоящего времени не установлен. Более подробное описание активности соединения ДФ-5 дано в патенте RU 2627769 С1, Россия (2017) [17]. Мы отмечаем, что на основании описанного эксперимента нельзя предположить точный механизм воздействия соединения на преформированные комплексы, поэтому мы называем соединение ДФ-5 «антисшивающим агентом», а не «разрушителем поперечных сшивок».

 

Рисунок 2 – Химическая структура соединения ALT-711 (алагебриум)

 

В дизайне эксперимента учтена поправка на интерференцию, связанную с неспецифической адгезией БСА к поверхности коллагеновой матрицы и к пластику планшета. По этой причине мы полагаем, что установленная активность соединений ДФ-5 и ALT-711 связана именно с действием на определенный комплекс, образующийся в результате взаимодействия продуктов гликирования на альбумине с аминокислотными остатками негликированного коллагена. Именно этот комплекс, мы полагаем, и позволяет закрепить альбумин на коллагеновой матрице и является мишенью для действия соединений.

Циклические катионы бета-кетоиминия хорошо подходят на роль продуктов, реагирующих на стороне альбумина и быстро образующих поперечную связь с аминокислотными остатками коллагена. Такие ионы являются результатом циклизации глюкозона или пентозона Ледерера. Реагируя со свободной гуанидиновой группой аргинина, они способны в несколько стадий образовывать глюкозепан или пентозидин. Возможно, что упомянутые глюкозон и пентозон Ледерера, а также предшествующие им продукты Амадори также важны для образования комплексов, фиксирующих БСА на коллагеновом матриксе, но их вклад еще предстоит установить.

Оценка массы тела животного

В конечной точке исследования средняя масса тела у животных с диабетом была значительно ниже (p≤0,05), чем у крыс без диабета (табл. 1). Крысы с диабетом, получавшие соединения ДФ-5 и ALT-711, показали небольшой прирост массы тела по сравнению с больными животными без лечения, но разница была статистически значимой только в случае крыс с диабетом, получавших ДФ-5.

 

Таблица 1 – Масса тела, уровень глюкозы в крови, уровень HbA1c и смертность, наблюдаемые в конечной точке исследования в группах крыс без диабета (ND), крыс с диабетом (D), а также крыс с диабетом, получавших или не получавших соединения ДФ-5 или ALT-711

Опытная группа	Масса тела (g)	Глюкоза крови (ммоль/л)	HbA1c (%)	Смертность
ND + растворитель	455,25±17,82	5,37±0,18	6,42±0,49	0/8
D + растворитель	323,80±18,75a	26,83±1,14a	19,77±0,08a	3/8
D + ДФ-5 (12,5 мг/кг)	358,00±32,35	27,93±0,95a	11,46±1,39ab	2/8
D + ALT-711 (12,5 мг/кг)	335,83±20,80	25,78±0,43a	12,30±1,88ab	2/8

Примечание: ^a – p≤0,05 при сравнении со здоровыми крысами (ND); ^b – p≤0,05 при сравнении с диабетическими крысами, не получавшими лечения (D).

 

Уровень глюкозы крови

По сравнению с недиабетическими крысами, животные с сахарным диабетом имели значительно более высокий уровень глюкозы в крови, равно как и уровень HbA1c (табл. 1; p≤0,05). Повышенное содержание HbA1c, наблюдаемое у животных с диабетом, было почти на 40% устранено в группах, получавших лечение как соединением ДФ-5, так и ALT-711 (табл. 1; p≤0,05). В то же время введение указанных соединений приводило лишь к незначительному снижению концентрации глюкозы в крови, не имевшему статистической значимости.

Оценка функции почек и их гистологическое исследование

В результате исследования установлено, что у животных с диабетом наблюдалось увеличение объема мочи и повышение количества отделяемого общего белка (p≤0,05 по сравнению с контрольной группой животных без диабета; табл. 2). В то же время соединения ДФ-5 и ALT-711 статистически значимо предотвращали повышение концентрации общего белка в моче по сравнению с животными без лечения (≈50%, p≤0,05), при этом не влияли на объем отделяемой мочи (табл. 2).

 

Таблица 2 – Показатели функции почек и экскреции белка, наблюдаемые в конечной точке исследования в группах крыс без диабета (ND), крыс с диабетом (D), а также крыс с диабетом, получавших или не получавших соединения ДФ-5 или ALT-711

Опытная группа	Объем отделяемой мочи (мл/сут)	Концентрация общего белка в моче (г/л)	Экскреция общего белка с мочой (мг/сут)
ND + растворитель	15,00 ± 1,54	0,017 ± 0,004	0,26 ± 0,08
D + растворитель	23,20 ± 1,62a	0,058 ± 0,005a	1,32 ± 0,08a
D + ДФ-5 (12.5 мг/кг)	21,83 ± 1,58a	0,025 ± 0,007ab	0,59 ± 0,21ab
D + ALT-711 (12.5 мг/кг)	22,83 ± 4,15a	0,033 ± 0,005ab	0,72 ± 0,13ab

Примечание: ^a – p≤0,05 при сравнении со здоровыми крысами (ND); ^b – p≤0,05 при сравнении с диабетическими крысами, не получавшими лечения (D).

 

Гистологическое исследование животных с сахарным диабетом позволило выявить повреждения тканей почек. Характерным для диабета является прогрессирующее поражение клубочков и канальцев нефронов. В почках диабетических крыс, в сравнении со здоровым контролем, были выявлены значительные морфологические изменения (Рис. 3). В клубочках нефронов наблюдали утолщение ГБМ и экспансию мезангиального матрикса. Утолщение ГБМ было распространенным, степень выраженности экспансии мезангиального матрикса градировалась от лёгкой до умеренной и провоцировала сужение просветов капилляров. По сравнению с контрольными животными, не страдающими диабетом, средняя площадь клубочков была немного уменьшена, но различия не носили характер статистически значимых. В то же время средняя и относительная площади клубочковой соединительной ткани в группе животных с сахарным диабетом были значительно увеличены, в 4,8 и в 5,8 раз соответственно (табл. 3; p≤0,05). Лечение диабетических животных соединением ДФ-5 или ALT-711 значительно уменьшало степень повреждения клубочков (Рис. 3). Средние относительные площади гломерулярной соединительной ткани, наблюдаемые у крыс со стрептозотоциновым диабетом, получавших либо соединение ДФ-5, либо ALT-711, были статистически значимо ниже (p≤0,05), в 1,6 и 2,3 раза соответственно, в сравнении с диабетическими животными, не получавшими лечения (табл. 3).

 

Рисунок 3 – Гистологическая картина клубочков. Изменения в тканях почек, вызванные сахарным диабетом, а также эффект от лечения соединениями ДФ-5 или ALT-711

Примечание: окраска трихромом по Массону: (A) здоровый контроль, (B) животные с сахарным диабетом без лечения, (C) диабет + соединение ALT-711 и (D) диабет + соединение ДФ-5. Увеличение ×100

 

Таблица 3 – Морфометрический анализ повреждений клубочков в срезах почек, окрашенных трихромом по Массону, проведенный у крыс без диабета (ND) и с диабетом (D), а также крыс с диабетом, получавших или не получавших соединения ДФ-5 или ALT-711

Опытная группа	Общая клубочковая площадь (мкм2)	Площадь клубочковой соединительной ткани (мкм2)	Относительная площадь клубочковой соединительной ткани (٪)
ND + растворитель	14885,17±1932,23	695,92±195,25	4,6
D + растворитель	12572,63±1015,25	3356,46±1871,64a	26,7a
D + ДФ-5 (12.5 мг/кг)	14753,21±975,23	2397,29±832,43	16,2b
D + ALT-711 (12.5 мг/кг)	13968,94±856,26	1640,38±543,19	11,7b

Примечание: ^a – p≤0,05 при сравнении со здоровыми крысами (ND); ^b – p≤0,05 при сравнении с диабетическими крысами, не получавшими лечения (D).

 

Уровень КПГ в тканях почек

Иммуногистохимическое окрашивание КПГ показало, что в клубочках нефронов крыс с диабетом наблюдается более выраженное распространение антиген-позитивного материала по сравнению с материалом контрольных крыс без диабета. Интенсивность окрашивания была менее выражена в тканевом материале животных с сахарным диабетом, получавших лечение соединениями ДФ-5 или ALT-711 (Рис. 4). Средние относительные площади антиген-позитивного материала в клубочках диабетических животных, получавших либо соединение ДФ-5, либо ALT-711, были статистически значимо ниже, чем в группе животных без лечения (p≤0,05), в 1,6 и 1,8 раз соответственно (табл. 4).

 

Рисунок 4 – Влияние соединений ДФ-5 и ALT-711 на накопление КПГ в почках, вызванное сахарным диабетом

Примечание: Иммуногистохимическое окрашивание КПГ в почках: (A) контроль без диабета, (B) животные с диабетом без лечения, (C) диабет + соединение ALT-711 и (D) диабет + соединение ДФ-5. Увеличение ×100

 

Таблица 4 – Иммуногистохимическое окрашивание КПГ в почках, проведенное в конечной точке исследования у крыс без диабета (ND) и с диабетом (D), а также крыс с диабетом, получавших или не получавших соединения ДФ-5 или ALT-711

Опытная группа	Общая клубочковая площадь (мкм2)	Площадь клубочкового КПГ-позитивного материала (мкм2)	Относительная площадь клубочкового КПГ-позитивного материала (٪)
ND + растворитель	15287,35 ±1759,13	1634,04 ± 759,17	10,68
D + растворитель	12121,19 ±1234,57	3746,13 ±1098,73	30,90a
D + ДФ-5 (12.5 мг/кг)	12982,17 ±971,56	2471,09± 658,81	17,48b
D + ALT-711 (12.5 мг/кг)	13106,82 ± 1346,49	2117,85 ± 732,43	19,03b

Примечание: ^a – p ≤0,05 при сравнении со здоровыми крысами (ND); ^b – p≤0,05 при сравнении с диабетическими крысами, не получавшими лечения (D).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Гликирование белков и образование КПГ играют важную роль в патогенезе поздних осложнений сахарного диабета, таких как ретинопатия, нефропатия, нейропатия, кардиомиопатия, а также ревматоидного артрита, остеопороза и старения [2]. Гликирование и поперечное сшивание белков не только приводит к снижению эластичности сосудов, но и влияет на структурную целостность и физиологические функции внутренних органов.

Гликирование представляет собой стадийный процесс, включающий образование гемиаминалей, оснований Шиффа, енаминолов, продуктов Амадори, ендиолов, глюкозонов (или пентозона) Ледерера, которые затем подвергаются внутримолекулярной конденсации между аминогруппой и концевой альдегидной группой, что дает положительно заряженные кольцевые продукты – циклические бета-кетоиминиевые ионы (6- или 7-членные) [2, 22]. Последние, реагируя с гуанидиновой группой аргинина, образуют сложные и стабильные поперечные сшивки, такие как глюкозепан или пентозидин. Помимо этого, ранние продукты гликирования способны распадаться на карбонильные соединения (метилглиоксаль, глиоксаль и др.), которые образуют другие виды сшивающих КПГ, такие как MOLD и GOLD [22]. Для всех КПГ характерна высокая стабильность.

Диабетическую нефропатию определяют как прогрессирующее на фоне диабета снижение скорости клубочковой фильтрации, сопровождающееся протеинурией и другими осложнениями со стороны почек [2]. В отношении почек отмечаются гликирование и активация каскада комплемента через распознавание гликированных белков маннан-связывающим лектином и/или дисфункция регуляторных белков комплемента [23], активация сигнальных каскадов рецепторов к КПГ и т.д. [24]. Ключевые события в ГБМ, мезангиальном и тубулоинтерстициальном матриксе, напрямую или опосредованно связаны с гликированием: увеличение количеств коллагена типов IV и VI, усиление гликирования коллагена IV, интенсификация поперечного сшивания в коллагене IV, увеличение количеств ламинина и фибронектина, увеличение количества коллагена типа I и т. д. [25]. Наблюдаются экспансия мезангиального матрикса и утолщение ГБМ, повреждение подоцитов, гломерулосклероз и почечный фиброз [26–28].

Считается, что разрушение образовавшихся в почках КПГ посредством применения разрушителя поперечных сшивок, такого как соединение ALT-711, может обеспечить нефропротекцию в условиях диабета. Forbes J.M. и соавт. (2001) представляли соединение ALT-711 как потенциально способное стать новой основой для терапии диабетической нефропатии. Применение ALT-711 с 16-й по 32-ю неделю исследования способно улучшить как состояние функциональных параметров почек (альбуминурия), так и маркеров структурного повреждения, в том числе гломерулосклероза, тубулоинтерстициального повреждения и окислительного стресса [29].

Механизм действия при разрыве поперечных сшивок окончательно не выяснен. Согласно первоначальным предположениям, выдвинутым для аналога соединения ALT-711 – фенилтиазолия бромида [16], механизм его действия включает разрыв С–С связи между двумя соседними карбонильными группами. Однако КПГ, содержащие подобный 1,2-дикарбонильный фрагмент, в условиях эксперимента установлены не были, хотя разрыв поперечных сшивок был доказан экспериментально, иммунологически, с применением антител к тому или иному из двух сшитых белков [30–33]. Следует отметить, что такая С–С связь, расположенная между двумя соседними карбонильными группами, присутствует в некоторых ранних продуктах гликирования [22]. Кроме того, имеются убедительные данные из экспериментов in vivo, демонстрирующие положительный эффект соединения ALT-711 в условиях диабетической нефропатии [34, 35]. Несмотря на убедительные доказательства активности разрушителей поперечных КПГ-сшивок в условиях диабетической нефропатии, концепция непосредственного разрушения в целостном организме является спорной [36]. Механизм антисшивания теоретически может быть реализован за счет гидролиза, путем расщепления незрелых поперечных сшивок, образующихся на ранних стадиях процесса сшивания (антисшивающая активность), а также посредством инактивации ранних продуктов гликирования.

Можно предположить, что в условиях целостного организма механизм действия связан с инактивацией промежуточных предварительно сшитых электрофильных продуктов гликирования и дериватов глюкозы, существующих как в виде аддуктов, так и свободных соединений. Их структура аналогична структуре теоретической дикарбонильной сшивки, которая так и не была обнаружена [14, 16]. К таким продуктам могут относиться основания Шиффа, карбонильные соединения, аддукты α-оксоальдегидов, расположенные на белках и др. Для α-оксоальдегидов доказано их участие в образовании поперечных сшивок, а именно: 2-аммонио-6-({2-[(4-аммонио-5-оксидо-5-оксопентил)амино]-4,5-дигидро-1H-имидазол-5-илиден}амино)гексаноат (GODIC), 2-аммонио-6-({2-[(4-аммонио-5-оксидо-5-оксопентил)амино]-4-метил-4,5-дигидро-1H-имидазол-5-илиден}амино)гексаноат (MODIC), глюкозепан [37, 38] и многих других. Следующий важный продукт – циклический b-кетоиминиевый ион, обладающий электрофильными свойствами [22] и образующий при взаимодействии с гуанидиновой группой в одну стадию пентозинан, в две стадии пентозидин (если кольцо b-кетоиминиевого иона было 6-членным) или глюкозепан (если это кольцо было 7-членным).

Возможность разрушения ранних аддуктов α-оксоальдегида разрывателями поперечных сшивок уже описана [39] с использованием модели гликирования аполипопротеина A-I метилглиоксалем в присутствии соединения ALT-711. Данный механизм обсуждался как возможный для разрушителей поперечных сшивок в работе Kim T. и соавт. [40], а возможность прямого связывания метилглиоксаля (представителя α-оксоальдегидов) соединением ALT-711 рассмотрена там же [40].

Таким образом, предлагаемая гипотеза о механизме действия разрушителей поперечных сшивок предполагает их способность производить нуклеофильные атаки на электрофильные интермедиаты гликирования и ранние продукты сшивания (антисшивающая активность). Детальный молекулярный механизм требует уточнения, но, учитывая нуклеофильность ДФ-5 и ALT-711, это является возможным.

Исследование in vivo было проведено для проверки способности соединения ДФ-5 предотвращать развитие ранней стадии диабетической болезни почек у крыс в условиях диабета, индуцированного стрептозотоцином. Объект исследования, как и эталон ALT-711, экспериментальным животным вводили внутрижелудочно в течение 30 cут. На протяжении всего исследования уровень глюкозы в крови крыс с диабетом составлял не менее 15 ммоль/л, что способствовало развитию диабетических сосудистых осложнений. В конце исследования мы оценили и сопоставили результаты оценки массы тела животных, уровни глюкозы и HbA1c в крови, а также функцию почек и гистологическую картину их тканей в группах здоровых крыс, крыс с диабетом, а также крыс с диабетом, получавших соединения ДФ-5 или ALT-711. Регулярное внутрижелудочное введение ДФ-5 статистически значимо снижало уровень HbA1c в крови, но не влияло на уровень глюкозы натощак. Этот факт, вероятно, указывает на способность ДФ-5 действовать так, как предполагалось выше – разрушать продукты, образующиеся на ранних стадиях гликирования, в том числе так называемые продукты Амадори (HbA1c имеет структуру продуктов такого типа) [41]. Согласно ранее упомянутой гипотезе о механизме действия разрушителей поперечных КПГ-сшивок, такие агенты могут быть способны отщеплять глюкозу из ее обратимых аддуктов с белками (основания Шиффа и/или продукты Амадори) [42].

Настоящее исследование продемонстрировало возможность соединения ДФ-5 предотвратить диабетическкую нефропатию у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином. Как и ожидалось, диабет с течением времени индуцировал увеличение протеинурии. Соединение ДФ-5 существенно уменьшало протеинурию и предотвращало повреждение почек у экспериментальных животных за счет ограничения повреждений клубочков и канальцев. Подобный эффект был также описан для ALT-711 [43]. Замедленный прирост количества соединительной ткани и пониженный уровень КПГ в почках по сравнению с контрольной группой животных, вероятно, являются характерными свойствами антисшивающих агентов.

Накопление КПГ при диабете связано с усиленным образованием в почках компонентов внеклеточного матрикса, и раннее вмешательство в этот процесс может улучшить долгосрочные функциональные и структурные особенности диабетической нефропатии. В этом исследовании накопление КПГ в почках увеличивалось при диабете и уменьшалось при лечении соединением ДФ-5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, мы представили данные о новом антисшивающем агенте, соединении ДФ-5. Однако для выяснения точного механизма действия соединения требуются дальнейшие исследования. ДФ-5 (12,5 мг/кг) ингибирует прогрессирование почечной дисфункции у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, на раннем этапе патологии. В условиях экспериментальной диабетической нефропатии это соединение улучшает состояние как функциональных, так и морфологических параметров. Наблюдаемые улучшения были ассоциированы со сниженным накоплением КПГ в почках. Эти результаты предоставляют исследователям дополнительные возможности для лечения диабетической нефропатии и, возможно, других осложнений диабета.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Химическая часть исследования выполнена в Институте органической и физической химии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственного задания, грант ФЕНВ-2020-0031 (0852-2020-0031). Биологическая часть исследования проведена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 14-25-00139).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

А.А. Спасов – руководство и концептуализация исследования; О.Н. Жуковская, Х.С.А. Аббас, А.С. Морковник – синтез и подтверждение структуры соединения ДФ-5; А.И. Ращенко, А.А. Бригадирова, Р.А. Литвинов, Н.А. Гурова – разработка методологии, проведение исследования, программная обработка, написание рукописи; А.В. Смирнов, Н.Г. Паньшин – проведение исследования, визуализация данных; А.И. Ращенко, А.А. Бригадирова, Н.А. Гурова – обработка полученных результатов; Р.А. Литвинов – разработка гипотезы о механизме действия соединений, не связанном с непосредственным разрушением зрелых поперечных сшивок.

¹ World Health Organization (WHO). Diabetes. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/diabetes

Об авторах

Александр Алексеевич Спасов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Государственное бюджетное учреждение «Волгоградский медицинский научный центр»

Email: aspasov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7185-4826

доктор медицинских наук, академик РАН, заведующий кафедрой фармакологии и биоинформатики, ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России; заведующий лабораторией экспериментальной фармакологии ГБУ ВМНЦ

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1; 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Ольга Николаевна Жуковская

Научно-исследовательский институт физической и органической химии федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Email: zhukowskaia.ol@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2485-2139

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории органического синтеза

Россия, 344090, г. Ростов-на-Дону, пр-т Стачки, д. 194/2

Андрей Игоревич Ращенко

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: a.rashencko@yandex.ru

кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории метаботропных лекарственных средств НЦИЛС

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Анастасия Андреевна Бригадирова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Государственное бюджетное учреждение «Волгоградский медицинский научный центр»

Email: a.brigadirova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0957-7087

кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармакологии и биоинформатики ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России; младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии ГБУ ВМНЦ

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1; 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Роман Александрович Литвинов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Государственное бюджетное учреждение «Волгоградский медицинский научный центр»

Автор, ответственный за переписку.
Email: litvinov.volggmu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0162-0653

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаботропных лекарственных средств НЦИЛС, ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России; научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии ГБУ ВМНЦ

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1; 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Наталия Алексеевна Гурова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: gurova.vlgmed@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0670-1444

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Алексей Владимирович Смирнов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Государственное бюджетное учреждение «Волгоградский медицинский научный центр»

Email: alexey-smirnov@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5351-6105

доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патологической анатомии ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1; 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Николай Геннадьевич Паньшин

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: panshin.nickolay@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4035-4108

кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии

Россия, 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, д. 1

Хайдер Сабри Аббас Аббас

Научно-исследовательский институт физической и органической химии федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Email: vip.haider89@gmail.ru

магистрант лаборатории органического синтеза

Россия, 344090, г. Ростов-на-Дону, пр-т Стачки, д. 194/2

Анатолий Савельевич Морковник

Научно-исследовательский институт физической и органической химии федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Email: asmork@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9182-6101

доктор химических наук, главный научный сотрудник лаборатории органического синтеза

Россия, 344090, г. Ростов-на-Дону, пр-т Стачки, д. 194/2

Список литературы

Дополнительные файлы