Мыши В6.А-Dysf^prmd/GeneJ как генетическая модель дисферлинопатии

Полный текст

Список сокращений: Bla/J – B6.A-Dysf^prmd/GeneJ; КК – креатинкиназа; ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота; ПЦР – полимеразная цепная реакция; п.о. – пар оснований, WT – мыши дикого типа; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; Gas M – M. gastrocnemius medialis; Gas L – M. gastrocnemius lateralis; tib – M. tibialis.

ВВЕДЕНИЕ

Дисферлинопатия – это фенотипически гетерогенная прогрессирующая мышечная дистрофия, вызванная мутациями в гене DYSF (2p13), который кодирует трансмембранный белок дисферлин (230 кДа), участвующий в восстановлении сарколеммы. [1]. Дисферлинопатия включает в себя пресимптоматический этап бессимптомного повышения уровня креатинкиназы (КК) в крови и манифестный этап, характеризующийся прогрессирующим поражением проксимальных и/или дистальных мышц конечностей [2]. Различают пять основных фенотипов дисферлинопатии: дистальная миопатия Миоши (OMIM # 254130), поясно-конечностная мышечная дистрофия R2 (LGMD R2, OMIM # 253601); дистальная миопатия переднего ложа голени (дистальная, с началом в передней большеберцовой мышце (DMAT, OMIM # 606768); проксимально-дистальная форма (переходная форма) и врожденный фенотип [3]. Дисферлин состоит из семи доменов C2 и является трансмембранным белком скелетных мышц, также экспрессируемый кардиомиоцитами и моноцитами [4]. Основная роль дисферлина – Ca²⁺ зависимая репарация участков повреждения сарколеммы [5]. Дисферлинопатия манифестирует в диапазоне от позднего подросткового возраста, раннего взрослого возраста, с последующим неуклонным повышение проявлений признаков заболевания [6].

Манифестация заболевания приходится на поздний подростковый возраст – ранний взрослый возраст с последующим неуклонным прогрессированием мышечной слабости и утратой амбулаторного статуса в 35–45 лет [7].

Надлежащее проведение клинического испытания требует понимания особенностей прогрессирования заболевания и реагирования на различные показатели результатов с течением времени [8]. Сложность выбора показателей для клинических исследований дисферлинопатии определяется вариабельностью возраста манифестации, фенотипом, выраженностью мышечно-дистрофического процесса, переменной скоростью прогрессирования, модифицирующими факторами, которые в полной мере не выявлены [9]. Ранее показано, что оценка двигательной функции при дисферлинопатии, является надежными методом объективизации, однако изменчивость скорости прогрессирования заболевания затрудняет демонстрацию реакции в небольших когортах [10, 11]. Установлено, что, несмотря на отсутствие экспрессии белка дисферлина в скелетных мышцах, наблюдается варьирование возраста манифестации, клинических проявлений и тяжести заболевания. Аналогичным образом, дисферлинопатия может прогрессировать с различной скоростью, даже при наличии одной и той же мутации [12, 13]. Описан ряд факторов, модифицирующих фенотип и скорость прогрессирования дисферлинопатии: степень и продолжительность физической активности и тип мутации (гомозиготность по нонсенс-мутациям), при отсутствии устойчивых клинико-генетических корреляций [14, 15].

ЦЕЛЬ. Поведенческое и патоморфологическое фенотипирование мышей, нокаутных по гену DYSF, играющему важнейшую роль в развитии и прогрессировании дисферлинопатии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные

В работе использована сублиния мышей B6.A-Dysf^prmd/GeneJ (Bla/J), полученная из испытательного центра «Виварно-экспериментальный комплекс ООО «НИИ Митоинженерии МГУ». Когорты животных получены в результате скрещивания мышей линии A/J (#:000646), у которых была случайно обнаружена спонтанная инсерция в интроне 4, с мышами дикого типа C57BL/6J. Поддержание и размножение колонии проводили путем скрещивания мутантных животных между собой из одного помета.

Экспериментальные и контрольные (Bla/J, n=20; C57BL/6J, n=10 и 13) животные содержались в условиях беспатогенного вивария Белгородского государственного национального исследовательского университета (НИУ БелГУ) в условиях искусственно регулируемого светового дня (12 ч тёмного и 12 ч светлого времени) при температурном режиме от +22 до +26°C и имели свободный доступ к корму и воде. В работе руководствовались этическими принципами обращения с лабораторными животными в соответствие с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (ETS No. 170). Все болезненные манипуляции с животными проводились в соответствии с регламентирующими стандартами: Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Экспериментальные исследования были одобрены Биоэтической комиссией Белгородского государственного национального исследовательского университета (протокол № 15/10 от 29.10.2021). Вивисекция проводилась в соответствии с этическими принципами обращения с лабораторными животными, изложенными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (CETS No. 123).

Поведенческие тесты проводились преимущественно в утренние часы при фиксированном «домашнем» освещении (для минимизации стрессового фактора). Были сформированы репрезентативные группы экспериментальных животных (гомозиготные нокауты – Bla/J, n=20), тестирование групп проводили на двух возрастных точках 12 и 24 недель и контрольных животных без модификации генома (WT, n= 10 и 13 соответственно).

Тест «Перевернутая сетка»

Перевернутая сетка представляет собой проволочную сетку 45×45 см с размером ячеек 12×12 мм с диаметром проволоки 1 мм, окруженную перегородкой размером 4 см, предотвращающей попытку мыши перелезть на другую сторону. Тест используется для оценки координации движений и мышечной силы обеих пар конечностей. Мышей помещали в центр проволочной сетки, которую переворачивали и устанавливали на высоте 50 см над мягкой поверхностью. Регистрировалось время падения животного или животное снималась с сетки, если время достигало 180 сек. Оценка теста проводилась в баллах: чем больше времени животному удалось удержаться, тем выше был его балл [16–18].

Тест «Сила хватки»

Установка представляет собой сетку из нержавеющей стали, подключенной к датчику для измерения силы хватки (в граммах) передних конечностей мыши. Животному давали ухватиться за горизонтальную сетку передними лапами, а затем мышь оттягивали назад за хвост, пока ее хватка не ослабевала, при этом задние лапы мыши не должны касаться сетки. Датчик измерения силы сохранял пиковое значение силы тяги. Тест используется для изучения функции нейромышечной системы. Для анализа использовались среднее значения из 5 успешных измерений силы передних конечностей [19, 20].

Тест «Удержание на проволоке»

Тест основан на инстинкте мышей избегать падения. Мышь помещается на горизонтально натянутую проволоку с захватом всеми четырьмя конечностями (диаметр 3 мм, высота над поверхностью 60 см). Способность удерживаться на проволоке измеряется путем оценки времени удержания мыши до момента падения при помощи секундомера. В качестве итогового значения был взят наилучший результат двух попыток, пауза между которыми была 20 мин [21, 22].

Тест «Вынужденное плавание с грузом»

Физическую работоспособность животных в данном тесте оценивали по длительности плавания с грузом, который составляет 5% от массы тела (масса груза была найдена экспериментальным путем), прикрепленным к корню хвоста животного при помощи резиновой повязки. Массу животных определяли с точностью до 0,1 г, груз подбирали с точностью 0,01 г. Длительность тестирования (плавания) регистрировали при помощи секундомера с точностью до 1 сек. Окончанием эксперимента считался момент утомления животного, признаком которого являлась неспособность животного всплыть в течение 5 сек на поверхность воды или отказ от плавания (погружение на дно более, чем на 5 сек). Признаком утомления животного являлось нарушение моторно-координационной функции (вращением вокруг своей оси и заваливание на бок в толще воды).

Плавание проводили в сосудах из органического стекла с внутренним диаметром 30 см и высоты 60 см. Высота столба воды составляла 30 см, температура воды 23±1°C [23, 24].

Тест «Удержание животного на скользком вертикальном стержне»

В исследованиях на лабораторных животных для скрининга и оценки сохранности физической работоспособности использовалась в основном данная методика. Установка представляет из себя штатив с диаметром стержня 7 мм, высотой 60 см с установленным на верхушке пластиковым ограждением. Для проведения эксперимента животное помещали на одинаковом расстоянии от верхушки стержня строго вверх головой, не менее 1 м над полом. Фиксировали время падения животного со стержня при помощи секундомера. О сохранности физической работоспособности судили путем сравнения с контрольной группой [25].

Генотипирование трансгенных животных

Геномную ДНК для анализа получали с помощью биопсии уха (около 30 мг ткани). Биопсионный материал помещали в лизирующий раствор, содержащий 100 мМ хлорида натрия, 50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 2 мг/мл протеиназы К и инкубировали при 55°С в течение 12–16 ч, после чего прогревали реакционную смесь при 85°С в течение 40 мин. Центрифугировали лизат с помощью лабораторной центрифуги Thermo SL16R (Thermo Scientific, США) в течение 1 мин при 10 000 g и использовали 1 мкл супернатанта в качестве матрицы в реакции ПЦР.

Использовали последовательности праймеров из протокола JAX (Protocol 26095), амплифицирующие одновременно участок ретротранспазона (в случае его присутствия) и участок геномной ДНК животного. В реакции использовали смесь из 3-х праймеров:

1) обратный праймер DYSF-R (5’: CTT CAC TGG GAA GTA TGT CG), гомологичный последовательности смысловой цепи интрона 4 гена DYSF, является общим;

2) прямой праймер DYSF-F (5’: TTC CTC TCT TGT CGG TCT AG), гомологичный последовательности антисмысловой цепи интрона 4 гена Dysf, является общим;

3) специфичный прямой праймер ETn-oR (5’: GCC TTG ATC AGA GTA ACT GTC), гомологичный последовательности длинных концевых повторов (3’ LTR) в составе встраиваемого в 4 интрон ретротранспозона.

Реакционная смесь содержала 1х Taq Turbo буфер (Евроген, Россия), 0,2 мМ каждого dNTP (Евроген, Россия), 0,5 мкМ каждого прямого праймера и 1 мкМ общего обратного праймера, 2 единицы HS Taq ДНК-полимеразы (Евроген, Россия). Программа амплификации состояла из следующих этапов:

1. Активация HS Taq ДНК-полимеразы при 95°C в течение 3 мин;
2. Денатурация при 95°C в течение 20 сек;
3. Отжиг при 60°C в течение 20 сек;
4. Элонгация при 72°C в течение 20 сек;
5. Цикличное повторение этапов 2–4 30 раз;
6. Конечная элонгация при 72°C в течение 2 мин.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 3% агарозном геле в 1х ТАЕ буфере (40 мМ Трис-HCl, 20мМ уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при 90 V в течение 60 мин.

Патогистологическое исследование

Материал включал тканевые фрагменты скелетных мышц M. gastrocnemius medialis (Gas M), M. gastrocnemius lateralis (Gas L), M. tibialis (tib), полученных от мышей линии Bla/J и мышей дикого типа (WT) с функциональным геном DYSF.

Криоконсервированный материал переносили в камеру криостата Thermo Fisher Scientific HM525 NX (США), где ориентировали на замораживающей платформе в монтирующем геле NEG-50 (Richard-Allan Scientific, TS, США). Получали срезы толщиной 3–7 мкм. Предметные стекла с криосрезами на 10 мин фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (Биовитрум, Россия). Далее 3 раза по 5 мин промывали в буферном растворе Трис-HCL pH 7,4 (Невареактив, Россия); наносили раствор Background Block (Cell Marque, США), перемещали криосрезы во влажную камеру, где инкубировали в течение 1 ч. Протеиновый блок удаляли смахиванием, затем на криосрезы наносили первичные рекомбинантные моноклональные кроличьи антителами к дисферлину (клон: JAI-1-49-3; ab124684; Abcam, Великобритания), разведённые в соотношении 1:200 с раствором Diamond: Antibody Diluent (Cell Marque, 938B-05, США), в которых выдерживали криосрезы 2 ч при комнатной температуре во влажной камере. По прошествии времени срезы трехкратно промывали в буферном растворе Трис-HCL, после чего проводили 1-часовую инкубацию при комнатной температуре во влажной камере с вторичными козлиными анти-кролик антителами IgG H&L (Alexa Fluor 555, abcam, ab150078, Великобритания), разведёнными в соотношении 1:500 с раствором Diamond: Antibody Diluent. По прошествии часа, срезы промывали 4 раза в буферном растворе Трис-HCL, и инкубировали в рабочем растворе DAPI (Thermo FS, D1306, США) на протяжении 10 мин. Заключение осуществляли в монтирующую среду глицерогеля по Кайзеру.

Для изготовления парафиновых срезов, тканевый материал после фиксации подвергали стандартной гистологической проводке, заливке в парафин и микротомированию. После депарафинирования срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике. Фотодокументацию осуществляли с помощью компьютерного видеокомплекса (IBM PC + микроскоп Leica DM 1000, Германия) и пакета программ ImageScope-M (Россия).

В качестве оцениваемых параметров, для морфометрии на основании ранее проведенных исследований [26, 27], были выбраны: площадь поперечного сечения мышечного волокна, а также число волокон с интернализированным ядром и число некрозов по отношению к общему числу волокон в поле зрения.

Статистическая обработка

Статистическую обработку проводили с помощью программы GraphPad Prism Software 8.0 (“GraphPad Software Inc”, США). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела-Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна-Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p ≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для формирования репрезентативных групп экспериментальных и контрольных животных, синхронизированных по возрасту, сначала получали соответствующее задачам эксперимента количество родственных производителей. Скрещивание гомозиготных мышей с мутацией производили с мышами такого же генотипа на том же генетическом фоне, полученными в предыдущих скрещиваниях. Потомство генотипировали методом конвенционной ПЦР с использованием трёх праймеров, один из которых специфичен к мутации.

Схематическое изображение положения праймеров для амплификации встроенного ретротранспазона представлено на рисунке 1.

 

Рисунок 1 – Схема положения праймеров для амплификации геномного участка (дикий тип) и участка 3’ LTR ретротранспозона (мутант). Примечание: ДТ – дикий тип; DYSF-F – общий прямой праймер; DYSF-R – общий обратный праймер; ETn-OR – прямой праймер, гомологичный участку 3’ LTR ретротранспозона; 5’LTR – 5’-длинные концевые повторы; 3’LTR – 3’ – длинные концевые повторы.

 

У мутантных мышей ретротранспозон размером более 6 тыс. пар оснований (п.о.) встроен в последовательность четвёртого интрона гена DYSF, что позволяло использовать систему из трёх праймеров для идентификации локализованной мутации в аллеле. DYSF-F гомологичен участку геномной последовательности интрона, находящегося перед встраиваемой последовательностью ретротранспозона. Благодаря этому в случае отжига праймера на мутантном аллеле синтезируемая цепь не успеет амплифицироваться до участка, гомологичного обратному праймеру – ампликон размером более 6 тыс. п.о. не будет формироваться и накапливаться в большом количестве в ходе ПЦР. ETn-oR гомологичен участку ретротранспозона в составе длинных концевых повторов (со стороны 3’ LTR), что в сочетании с обратным праймером DYSF-F, гомологичным участку геномной последовательности интрона, позволяет фланкировать 193 нуклеотидные пары. Такая схема расположения праймеров приводила к успешному разделению мутантных и дикотипных животных в результате проведения конвенционной ПЦР (Рис. 2) [28, 29].

 

Рисунок 2 – Детектирование наличия ретротранспозона у Bla/J мышей методом ПЦР. Примечание: размер продукта WT (дикий тип) 204 п.о.; размер продукта Bla/J 237 п.о.; NTC – отрицательный контроль без матрицы.

 

Ho M. и соавт. было показано встраивание ретротранспозона в определённый участок интрона 4 (495 пар оснований от экзона 4 и около 4400 пар оснований до экзона 5) с замещением 6 п.о. [30]. Результаты проведённого нами генотипирования подтверждали наличие мутации в гомозиготной форме исследуемых животных.

В результате амплификации образов животных дикого типа образовывался фрагмент размером 204 п.о. У животных Bla/J, гомозиготных по мутантной аллели, после амплификации последовательности гена DYSF формировался фрагмент длиной 237 п.о. (маркер 100+bp DNA Ladder).

Для исследования двигательной функции были сформированы репрезентативные группы экспериментальных животных (гомозиготные нокауты – Bla/J) (n=20), тестирование групп проводили на двух возрастных точках 12 и 24 недель и контрольных животных без модификации генома (WT) (n=10 и 13 соответственно).

Сила передних конечностей в тесте «Сила хватки» была значительно снижена у контрольных мышей по сравнению с мышами линии Bla/J в обеих возрастных точках (Рис. 3 А и В). При проведении теста «Принудительное плавание с грузом» (Рис. 3 C и D) было выявлено различие между контрольной группой мышей и экспериментальной в возрасте 24 недели и в возрасте 12 недель соответственно. Это свидетельствовало о снижении выносливости мышей в возрасте 24 недели при развивающейся патологии.

 

Рисунок 3 – Физиологические параметры мышей линии Bla/J. Примечание: анализ оценки силы хватки передних конечностей в тесте «Сила хватки» (A и B), выносливость в тесте «Принудительное плавание с грузом» ( С и D), физическую работоспособность в тестах «Проволочный тест» (E и F) и «Удержание животного на скользком вертикальном стержне» (G и H), координации движений и мышечной силы конечностей в тесте «Перевёрнутая сетка» (K и L). Экспериментальные Bla/J и контрольные мыши без модификации генома (WT) были протестированы в возрасте 12 (A, C, E, G, K) и 24 недель (B, D, F, H, L). Представлены медианы и стандартная ошибка среднего, количество животных указано в нижней части соответствующего столбца. Выборки проверены на нормальность, а статистическая достоверность оценивалась с помощью U-критерия Манна-Уитни (** p <0,01; ***p <0,0004, ****p <0,0001).

 

Были проведены тесты на сохранность физической работоспособности: «Удержание на проволоке» (Рис. 3 E и F) и «Удержание животного на скользком вертикальном стержне» (Рис. 3 G и H). В результате проведенных тестов было выявлено, что в 24 недели наблюдалось снижение физической работоспособности у мышей линии Bla/J по сравнению с линией С57BL/6J.

Координация движений и мышечная сила конечностей в тесте «Перевёрнутая сетка» у животных обеих групп (Рис. 3 K и L) статистически значимо не различались. Таким образом, в данных возрастных отметках исследуемые показатели не изменялись.

При постановке иммунофлюоресцентных реакций с антителами к белку дисферлину в образцах мутантных животных указанный протеин не был обнаружен; в контрольных тканях выявлена сарколеммальная локализация дисферлина, что соответствует каноническим описаниям для скелетной мышечной ткани (Рис. 4).

 

Рисунок 4 – Иммунофлюоресцентная реакция с антителами к дисферлину. Примечание: А – мышь C57Bl; Б – мышь линии Bla/J. Красный цвет – детектируемый дисферлин саркоплазматической локализации, синий цвет – ядра. Докраска: DAPI. Ув. ×200

 

Патогистологически изученная мышечная ткань при исследовании поперечных срезов характеризовалась возрастным нарастанием миопатического паттерна и нарушением архитектуры ткани. В отличие от поперечных срезов мышечной ткани мышей WT, волокна оцениваемых животных характеризовались полиморфностью поперечных сечений и разноразмерностью. Кроме этого, по сравнению с мышами WT, поперечное сечение у Bla/J было большего диаметра: в значительном количестве присутствовали так называемые круглые мышечные волокна. Для мышечной ткани исследуемых животных были характерны некрозы единичных мышечных волокон, чье число увеличивалось к возрасту 24 недели. Вокруг фокальных некрозов может быть отмечено скопление лейкоцитов, а также инвазия макрофагов под базальную мембрану волокна и фагоцитоз наркотизированной части саркоплазмы. Важным диагностическим критерием являлось выраженное число волокон с центрально расположенными ядрами (центральноядерные мышечные волокна), что в научной литературе трактуется как деструкция цитоскелета мышечных волокон и/или активная регенерационного процесса с появлением мышечных трубочек.

Обращает на себя внимание отек эндомизия и перимизия, а также маловыраженная лимфомакрофагальная инфильтрация (Рис. 5). С увеличением продолжительности жизни мутантных животных отмечалась гиперплазия эндомизия и перимизия, что выражалось в увеличении доли соединительной ткани в составе мышечного органа (Рис. 6).

 

Рисунок 5 – Поперечно-полосатая скелетная мышечная ткань изученных животных. Примечание: А – контроль, C57Bl; Б–Г – Bla/J. 1 – эндомизиальный и перимизиальный отек; 2 – волокна с центрально расположенными ядрами; 3 – лимфо-макрофагальная инфильтрация вокруг некротизированных мышечных волокон; 4 – некротизированные мышечные волокна, в т.ч. с макрофагальной инвазией; 5 – округлые мышечные волокна. Окраска: эозин. Ув.: А–В ×200, Г ×400

 

Рисунок 6 – Морфометрические параметры поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани мышей линии Bla/J на сроках 12 и 24 недель жизни. Примечание: А – доля некротизированных мышечных волокон; Б – Средняя площадь поперечного сечения мышечного волокна; В – доля центральноядерных мышечных волокон (ЦЯМВ); Г – доля соединительной ткани в скелетной мышце (*p < 0,05)

 

При морфометрической оценке и статистической обработке основных параметров ткани установлены значимые отличия у мышей WT по числу некротизированных мышечных волокон – как при сравнении показателя на сроках 12 и 24 недели, так и между линиями животных. Установлены внутри- и межгрупповые значимые различия по показателям: доля центральноядерных мышечных волокон, средняя площадь поперечного сечения мышечных волокон и доля соединительной ткани (Рис. 6). Как показали ранее проведённые исследования, увеличение поперечного сечения мышечных волокон следует рассматривать как компенсаторную рабочую гипертрофию в связи с гибелью части структурных единиц мышцы. При более длительном сроке наблюдения за животными установлен срыв этого процесса и постепенная атрофия мышцы, что в дальнейшем сопровождалось снижением этого показателя.

ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация репрезентативной in vivo модели дисферлинопатии имеет важное значение для поиска новых терапевтических мишеней и изучения фармакологической активности новых лекарственных средств, направленных на лечение эданной патологии. Основные линии мышей-моделей дисферлинопатии с полным отсутствием экспрессии дисферлина включают линии животных A/J^dysf-/- (A/J), SJL/J^dysf-/- (SJL/J) и BLA/J^dysf-/- (BLAJ; B6.A-Dysf^prmd/GeneJ), которые имеют сходные, с незначительными изменениями, фенотипические проявления заболевания [31] и выраженную гистопатологию [32].

Результаты исследований, изучающих мышечную функцию у мышей c с отсутствием экспрессии дисферлина (Dysf^-/-), показали противоречивые результаты. Отсутствие достаточной повторяемости и воспроизводимости результатов доклинических исследований, характеризующих линии мышей с диферлинопатией, могут быть частично обусловлены разницей в тяжести заболевания и фенотипическими проявлениями у конкретных линий Dysf^-/- мышей различного происхождения и/или отсутствием подходящих контрольных колоний мышей дикого типа для их сравнения [33].

В ходе настоящего исследования нами были сформированы репрезентативные группы экспериментальных (гомозиготные нокауты Dysf^-/-– Bla/J) и контрольных животных (C57Bl/6), синхронизированных по возрасту, которые в дальнейшем были прогенотипированы методом конвенционной ПЦР. Авторы использовали последовательности праймеров из протокола JAX (Protocol 26095), амплифицирующие одновременно участок ретротранспазона (в случае его присутствия) и участок геномной ДНК животного. Отсутствие экспрессии гена DYSF у мышей линии Bla/J приводило к мышечной дистрофии, вследствие чего заболевание начинало развиваться с 12 недели жизни животного, а пик фенотепических проявлений можно было наблюдать на 24 неделе.

При проведении поведенческого тестирования авторами было показано, что физическая активность и выносливость исследуемых животных понижается с возрастом в сравнении с контрольной группой. Что подтверждает тест «Сила хватки», в котором показатели снижались в сравнении с контролем на 22,2% в 12 недель, на 25,1% в 24 недели и на 9,5% между опытными группами в двух возрастных точках (54,47±2,659 и 49,27±1,157 соответственно). При проведении теста «Принудительное плавание с грузом» было выявлена разница в сравнении с контролем на 32,3% в 12 недель, на 50,5% в 24 недели и на 53,3% между опытными группами в двух возрастных точках (393,6±59,26 и 183,8±24,94). Сохранность физической работоспособности проверяли при помощи следующих тестов: «Проволочный тест» (68,00±8,809; 31,81±3,637) и «Удержание животного на скользком вертикальном стержне» (13,67±1,875), которые показали снижение результатов у исследуемых животных в 24 недели по сравнению с контролем на 64,4% и 82,9% соответственно. Данные по критериям координации движений и мышечной силы конечностей, исследуемые в тесте «Перевёрнутая сетка», в данных возрастах не изменялись.

Результаты, полученные в ходе проведения поведенческого тестирования, а именно уменьшение силы хватки передних конечностей и снижение физической выносливости с возрастом отражает прогрессирование основного мышечного заболевания у исследуемых животных. На основании этого можно сделать вывод о том, что изученная экспериментальная модель описывает клиническую картину дисферлинопатии у пациентов с данным заболеванием.

Также проведенное гистологическое исследование показало, что с увеличением продолжительности жизни мутантных животных отмечалась гиперплазия эндомизия и перимизия, что выражалось в увеличении доли соединительной ткани в составе мышечного органа. Установлены внутри- и межгрупповые значимые различия по показателям: доля центральноядерных мышечных волокон; средняя площадь поперечного сечения мышечных волокон; доля соединительной ткани. Как показали ранее проведённые исследования, увеличение поперечного сечения мышечных волокон следует рассматривать как компенсаторную рабочую гипертрофию в связи с гибелью части структурных единиц мышцы. При более длительном сроке наблюдения за животными был установлен срыв этого процесса и постепенная атрофия мышцы, что в дальнейшем сопровождалось снижением этого показателя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С использованием таких тестов, как: «Перевернутая сетка», «Сила хватки», «Удержание на проволоке», «Вынужденное плавание с грузом», «Удержание животного на скользком вертикальном стержне» было установлено, что отсутствие экспрессии гена Dysf^-/^- у мышей сублинии Bla/J B6.A-Dysf^prmd/GeneJ (Bla/J) может приводить к мышечной дистрофии. Данная патология проявляла себя с начала развития фенотипических проявлений болезни с 12 недели жизни и пиком фенотипических проявлений к 24 неделе жизни животных. Патогистологические фенотипические проявления болезни в целом неспецифичны и соответствовали данным прижизненного патологоанатомического исследования у пациентов с диферлинопатией.

Мыши сублинии B6.A-Dysf^prmd/GeneJ (Bla/J) являются репрезентативной моделью дисферлинопатии и могут быть использованы для оценки новых терапевтических средств для лечения данного заболевания.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено при финансовой поддержке Минобрнауки Российской Федерации, Соглашение №075-15-2021-1346.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

М.В. Корокин – написание статьи, разработка дизайна исследования; Е.В. Кузубова – оценка и проведение поведенческих тестов, интерпретация результатов; А.И. Радченко – оценка и проведение поведенческих тестов, написание статьи; К.Д. Чапров – написание статьи, интерпретация результатов; А.В. Дейкин – анализ литературы; Н.С. Жунусов – подготовка когорт животных, генотипирование; А.М. Краюшкина – подготовка когорт животных, генотипирование; Н.В. Екимова – формализация списка литературы, наблюдение и уход за животными, хендлинг животных; О.А. Пученкова – забор образцов для гистологического исследования; Р.В. Деев – консультация по вопросам планирования, методологии и реализации эксперимента; С.Н. Бардаков – анализ литературы; О.Н. Чернова – пробоподготовка образцов для гистологического исследования, морфологическое описании срезов мышечной ткани; В.М. Покровский – планирование исследования, этапов экспериментальных работ; И.А. Яковлев – разработка дизайна и написание программы исследования; А.М. Емелин – пробоподготовка образцов для гистологического исследования, морфологическое описании срезов мышечной ткани; И.С Лимаев – пробоподготовка гистологических срезов, работа с графическим материалом.

Об авторах

Михаил Викторович Корокин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: korokin@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5402-0697

доктор медицинских наук, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Елена Валерьевна Кузубова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: 1015artek1015@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2425-5027

младший научный сотрудник лаборатории генетических технологий и генного редактирования для биомедицины и ветеринарии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Александра Игоревна Радченко

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: sandrinkaradchenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4554-2116

младший научный сотрудник лаборатории генетических технологий и генного редактирования для биомедицины и ветеринарии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Роман Вадимович Деев

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Публичное акционерное общество «Институт стволовых клеток человека»

Email: romdey@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8389-3841

кандидат медицинских наук, доцент, и.о. заведующего кафедрой патологической анатомии, директор по науке

Россия, 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41; 117292, Москва, пр-т 60-Летия Октября, д. 10а

Иван Антонович Яковлев

Общество с ограниченной ответственностью «Генотаргет»

Email: ivan@ivan-ya.ru
ORCID iD: 0000-0001-8127-4078

генеральный директор

Россия, 121205, Москва, Инновационный центр «Сколково», ул. Нобеля, д. 7, пом. 48

Алексей Васильевич Дейкин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: alexei@deikin.ru
ORCID iD: 0000-0001-9960-0863

кандидат биологических наук, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Никита Сергеевич Жунусов

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: nzhunu@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1969-3615

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Анастасия Михайловна Краюшкина

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: krayushkina_2016@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6830-3820

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Владимир Михайлович Покровский

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: pokrovskiy@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1493-3376

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Олеся Андреевна Пученкова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: lesya759@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7657-0937

ординатор медицинского института

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Кирилл Дмитриевич Чапров

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»; Институт физиологически активных веществ ФГБУН федерального исследовательского центра проблем химической физики и медицинской химии Российской академии наук (ИФАВ РАН)

Email: chapkir@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0258-1879

младший научный сотрудник Лаборатория моделирования и генной терапии заболеваний человека, младший научный сотрудник

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85; 142432, Черноголовка, Северный проезд, д. 1

Наталья Викторовна Екимова

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Email: ekimova@bsu.edu.ru
ORCID iD: 0000-0002-3629-048X

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85

Сергей Николаевич Бардаков

ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Email: epistaxis@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3804-6245

врач-невролог, преподаватель кафедры нервных болезней

Россия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6

Ольга Николаевна Чернова

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: olgachernova92@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6310-9319

ассистент кафедры морфологии человека

Россия, 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41

Алексей Михайлович Емелин

ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»; ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: eamar40rn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4109-0105

ассистент кафедры патологической анатомии, аспирант кафедры патологической анатомии

Россия, 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85; 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41

Игорь Сергеевич Лимаев

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ig.limaev@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0994-9787

старший лаборант кафедры патологической анатомии

Россия, 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41

Список литературы

Дополнительные файлы