OPTIMIZATION OF THE METHOD FOR OBTAINING NANOCAPSULES, DEVELOPMENT OF THE METHODS OF DETERMINING THE DEGREE OF CINNARIZINE INCLUSION IN A PROLONGED DOSAGE FORM BASED ON POLY-D, L-LACTID-CO-GLICOLIDE, AND ITS VALIDATION
- 作者: Sorokoumova M.V.1, Blagorazumnaya N.V.1, Kompantsev V.A.1, Shcherbakova L.I.1, Zyablitseva N.S.1, Medvetskaya Y.G.1, Vasina T.M.1, Miroshnichenko K.A.1
-
隶属关系:
- Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
- 期: 卷 7, 编号 3 (2019)
- 页面: 138-147
- 栏目: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/2307-9266/article/view/111592
- DOI: https://doi.org/10.19163/2307-9266-2019-7-3-138-147
- ID: 111592
如何引用文章
全文:
详细
全文:
ВВЕДЕНИЕ При цереброваскулярных расстройствах отмечается прогрессирующее повреждение нейронов с последующим их апоптозом вследствие метаболических нарушений,недостатка питательных веществ и кислорода. Это геморрагический и ишемический инсульт, энцефалопатия, мигрень, деменция, нарушение когнитивных функций. Одним из ведущих патогенетических факторов развития данных расстройств является изменение свойств церебральных сосудов, под воздействием таких факторов, как атеросклероз, артериальная гипертензия, приводящих к нарушению мозгового кровообращения [1-4]. Основной группой лекарственныхпрепаратов, назначаемых при данной патологии, являются блокаторы кальциевых каналов,в частности циннаризин, эффективность которого доказана многочисленными клиническими исследованиями [5]. Существующие лекарственные формы циннаризина имеют ряд недостатков, а именно: частота приема, наличие побочных эффектов [6, 7]. Решением по нивелированию данных нежелательных факторов является разработка пролонгированной формы циннаризина, позволяющей уменьшить частоту приемов и тем самым избежать резких изменений концентрации препарата в организме, то есть способной поддерживать концентрацию препарата в организме относительно постоянной и терапевтический эффективной. Современные фармацевтические технологии позволяют создавать пролонгированные лекарственные формы нано- и микроразмеров с контролируемым высвобождением активных субстанций на основе полимерных носителей при помощи метода инкапсулирования [8, 9]. Одним из перспективных полимеров является сополимер молочной и гликолевой кислот (50:50) - поли-D,L-лактид-ко-гликолид (PLGA). Нанокапсулы на основе данного биополимера обеспечивают высокий уровень сорбции,пролонгируемое и программируемое высвобождение препаратов. Также полимер является биосовместимым и биодеградируемым, в организме метаболизируется до эндогенных соединений - молочной кислоты (разлагается до углекислого газа и воды) и гликолевой кислоты (выводится в неизменном виде). Разработана инновационная пролонгированная лекарственная форма циннаризина в виде микро- и нанокапсулна основе биодеградируемого полимера PLGA, предположительно способная нивелировать побочные эффекты препарата. ЦЕЛЬ исследования - корректировка стандартной технологии, разработка и валидация методики определения степени включения циннаризина в полученные микрочастицы, с учётом особенностей инкапсулирования и физико-химических свойств соединений, используемых при производстве. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В данном исследовании была использована субстанция циннаризина, PLGA (50:50), ПВС. Остальные реактивы и растворители соответствовали марке х.ч. 1. Методика определения степени включения циннаризина в нанокапсулы Методика 1 Объектом исследования послужил водный раствор супернатанта, получаемый после центрифугирования [10-14]. Супернатант помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки водой очищенной (раствор А). Учитывая растворимость циннаризина в спирте этиловом и данные литературы по определению степени включения лекарственных веществ в микрокапсулах на основе PLGA, была предложена следующая методика. Степень включения циннаризина устанавливали спектрофотометрически [15-21]. Для этого определяли содержание свободного циннаризина, а затем содержание циннаризина включенного в микрочастицы. Из раствора А отбирали аликвоту объемом 0,4 мл и помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки спиртом этиловым 95% [22-24]. Методика 2 Из раствора А отбирали аликвоту, объемом 20 мл, помещали в делительную воронку, добавляли 5 мл хлороформа и экстрагировали. Спектр хлороформного извлечения измеряли в интервале 220-360 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовали хлороформ. Предварительно измеряли спектр стандартного образца циннаризина в хлороформе. Полноту извлечения циннаризина из раствора А контролировали повторным прибавлением 5 мл хлороформа к водному раствору, полученному после первого экстрагирования. Спектр второго хлороформного извлечения измеряли в интервале 220-360 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовали хлороформ. Методика 3 В данном случае объектом исследования служил раствор супернатанта в хлористоводородной кислоте. Весь объем переносили в мерную колбу вместимость 50 мл, доводили до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной. Предварительно был измерен спектр стандартного образца циннаризина в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной, наблюдали максимум поглощения А=0,576 при длине волны 253 нм. Оценку степени включения циннаризина в нанокапсулы проводили, измеряя спектр поглощения в области 220-360 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовали раствор кислоты хлористоводородной 0,1 М. 2. Оптимизация способа получения нанокапсул Из литературных данных известно, что циннаризин растворим в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной, соответственно было проведено исследование на растворимость PLGA в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной. Навеску PLGA помещали в 50 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. При перемешивании в течение трех часов полимер не растворился, в связи с чем, было предложено изменить стандартную технологию нанокапсул. Стандартная технология нанокапсул Для получения микрочастиц циннаризина на основе PLGA был использован метод соосаждения. Точные навески циннаризина и PLGA растворяют в небольшом объеме хлороформа, а затем по каплям вводят в водный раствор ПВС, при гомогенизации с помощью аппарата Ultra-TurraxT-18 (IKA, ФРГ). Полученный раствор, содержащий микрочастицы, центрифугируют при скорости вращения 10000 об/мин в течение 20 минут. Надмикрокапсульную жидкость - супернатант декантируют. Скорректированная технология нанокапсул Точные навески циннаризина и PLGA растворяют в небольшом объеме хлороформа, а затем по каплям вводят в 0,1 М хлористоводородный раствор ПВС, при гомогенизации с помощью аппарата Ultra-Turrax T-18 (IKA, ФРГ). Полученный раствор, содержащий микрочастицы, центрифугируют при скорости вращения 10000 об/мин в течение 20 минут. Надмикрокапсульную жидкость - супернатант декантируют. 3. Методика количественного определения циннаризина в нанокапсулы и ее валидация 3.1. Количественное определение На основе данных, полученных при определении уровня включения циннаризина в нанокапсулы, для количественного анализа были выбраны условия, соответствующие методике №3. Измерения проводились при комнатной температуре шестикратно, данные усреднялись. Расчет содержания циннаризина в супернатантепроизводилипо формуле 1: (1), где Аx - оптическая плотность супернатанта; Cст - концентрация СО циннаризина, г/мл; W1 , W2 - объем мерных колб, мл; Aст - оптическая плотность СО циннаризина; a - навеска циннаризина, г; Va - объем аликвоты, мл. 3.2. Валидация методики количественного определения циннаризина в нанокапсулы Осуществлена валидационная оценка разработанной методики количественного определения циннаризина в микрочастицах. Разработанную методику оценивают по следующим показателям: специфичность, линейность, предел обнаружения, повторяемость, воспроизводимость. Определение специфичности При испытании на специфичность методики определяют влияние растворителя и вспомогательных веществ на оптическую плотность раствора модельной смеси. В качестве растворителя используют 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты. Готовят два раствора: первый - раствор модельной смеси микрочастиц с циннаризином, второй - растворитель и вспомогательные вещества. Определение линейности методики Определение линейности методики количественного анализа циннаризина осуществляют спектрофотометрическим методом. Для этого проводят 6 параллельных определений в навесках модельной смеси микрочастиц. Приготовление модельных смесей Навески микрочастиц циннаризина равные соответственно 0,01 г, 0,02 г, 0,03 г, 0,04 г, 0,05 г и 0,06 г помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, доводят тем же растворителем до метки, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре СФ-56 в максимуме поглощения при длине волны 253 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Определение предела обнаружения При определении предела обнаружения готовят модельную смесь: 0,03 г микрочастиц циннаризина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты и доводят до метки тем же растворителем (раствор А). Из раствора А готовили модельные растворы с концентрацией 1·10-3 г/мл, 1·10-4 г/мл, 1·10-5 г/мл циннаризина. Определение начинали с раствора с наибольшей концентрацией, устанавливая концентрацию, при которой будет отсутствовать максимум поглощения циннаризина при длине волны 253 нм. Определение сходимости Сходимость характеризуется, такими показателям, как повторяемость и воспроизводимость методики. Для определения использовали спектрофотометрический метод анализа, в диапазоне длин волн 220-360 нм. Повторяемость исследуют на образце модельной смеси микрочастиц циннаризина в 10 повторностях. Воспроизводимость методики оценивают на пяти образцах модельных смесей в двух повторностях. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Используя методику определения № 1, было установлено, что при добавлении спирта этилового в водный раствор супернатанта наблюдается образование белой опалесценции и помутнение. Причиной этих явлений является взаимодействие ПВС со спиртом этиловым, в связи с чем, данную методику невозможно использовать для спектрофотометрического определения степени включения циннаризина. Используя методику № 2, в супернатанте было определено количественное содержание циннаризина в размере 1% от введенной навески циннаризина, что подтверждается растворимостью циннаризина в воде [25]. Исходя из полученных результатов, было предложено изменить стандартную технологию микрочастиц путем использования хлористоводородного раствора ПВС, взамен водного раствора, что позволит перевести невключившийся циннаризин в раствор, с последующим определением степени включения [26, 27]. Применение методики №3, позволило определить количественное содержание циннаризина в хлористоводородном растворе супернатанта. Соответственно по разности концентраций представляется возможным вычислить степень инкапсуляции препарата в микрочастицы. Произведя серию определений, получены следующие данные. На рисунке 1 представлен УФ-спектр поглощения раствора супернатанта, полученного по скорректированной технологии. Данный УФ-спектр поглощения совпадает с результатами предыдущих исследований. Исходя из результатов исследования, усредненная оптическая плотность при длине волны 253 нм составила 0,447. Содержание циннаризина в супернатанте рассчитывали по формуле 1. По разности вычисляют степень включения циннаризина: 100% - х = 100 - 36,26=63,74% (таб. 1) Валидационная оценка методики Определение специфичности Полученные растворы анализировали спектрофотометрическим методом. На рисунке 2 представлен УФ-спектр модельной смеси микрочастиц с циннаризином, как видно, в области 230-270 нм наблюдается максимум поглощения характерный для препарата. На рисунке 3 приведен спектр поглощения второго раствора, состоящего из растворителя и вспомогательных веществ. Наглядно представлено, что поглощение в области 230-270 нм практически отсутствует. Исходя из полученных данных определения, можно судить о специфичности разработанной методики [28]. Определение линейности методики По результатам испытаний был построен градуировочный график зависимости значения оптической плотности от навески модельной смеси и рассчитано уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции. График представлен на рисунке 4. Показатель линейности характеризуется коэффициентом корреляции, его значение составило 0,998875, что соответствует требованию не ниже 0,995. Градуировочный график подчиняется линейной зависимости. Показатель коэффициента корреляции соответствует установленным требованиям НД [28]. Следовательно, можно утверждать, что линейная зависимость наблюдается в области концентраций циннаризина, во взятой навески модельной смеси микрочастиц 0,000345-0,002%. Определение предела обнаружения Данные, полученные в ходе исследования, отражены в таблице 2. Разработанная методика позволяет определить предел обнаружения, концентрацию, при которой не будет наблюдаться характерное поглощение для циннаризина при длине волны 253 нм. Установлен предел обнаружения циннаризина в микрочастицах, который составил 1·10-4 г/мл. Определение сходимости Сходимость характеризуется такими показателями, как повторяемость и воспроизводимость методики. Повторяемость оценивают по показателю -коэффициент вариации, его значение по требованию НД не должно превышать 2,0% [28]. Данные о повторяемости методики приведены в таблице 3. Установленный коэффициент вариации составил 1,4%, что входит в область допустимых значений. Результаты тестирования по показателю воспроизводимость методики представлены в таблице 4. Установленный коэффициент вариации составил 1,4%, что входит в область допустимых значений. Результаты тестирования по показателю воспроизводимость методики представлены в таблице 4. Показателем приемлемости выступал коэффициент вариации, его значение, согласно требованиям НД, не должно превышать 3% [28]. Для 10 параллельных измерений в двух сериях он составил 0,60%, что не выходит за пределы допустимого показателя критерия приемлемости. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе проведенных исследований была скорректирована стандартная технология микрочастиц на основе биодеградируемого полимера ПЛГА, путем использования в качестве растворителя 0,1М раствор хлористоводородной кислоты. Разработана методика определения степени включения циннаризина в микрокапсулы методом УФ-спектрофотометрии. Содержание циннаризина в микрокапсулах составило 63,7% от введенной навески циннаризина. Относительная погрешность не превышает ±2,67%. Произведена валидация разработанной методики по показателям: специфичность, линейность, предел обнаружения, повторяемость, воспроизводимость. По результатам тестирования получены данные, по которым можно судить о валидности методики.作者简介
M. Sorokoumova
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: mariya_026@mail.ru
N. Blagorazumnaya
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: nataliyva@rambler.ru
V. Kompantsev
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: l.i.sherbakova@pmedpharm.ru
L. Shcherbakova
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: l.i.sherbakova@pmedpharm.ru
N. Zyablitseva
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: n.s.zyablitseva@yandex.ru
Yu. Medvetskaya
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
T. Vasina
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: tatyana.vasina.5959@mail.ru
K. Miroshnichenko
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University
Email: k220436@yandex.ru
参考
- Щукин И.А., Лебедева А.В., Бурд С.Г., Фидлер М.С., Шихкеримов Р.К., Исмаилов А.М., Болотов А.В., Бельгушева М.Х. Хронические цереброваскулярные заболевания: вопросы диагностики и лечения // Consilium Medicum. - 2016. - №2. - С. 85-94.
- Smith E.E., Saposnik G., Biessels G.J., Doubal F.N., Fornage M., Gorelick P.B., Greenberg S.M., Higashida R.T., Kasner S.E., Seshadri S. American Heart Association Stroke Council; Council on Cardiovascular Radiology and Intervention; Council on Functional Genomics and Translational Biology; and Council on Hypertension. Prevention of Stroke in Patients With Silent Cerebrovascular Disease: A Scientific Statement for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association // Stroke. - 2017. - Vol. 48, №2. - P. e44-e71. doi: 10.1161/STR.0000000000000116.
- Thrift A.G., Howard G., Cadilhac D.A., Howard V., Rothwell P.M., Thayabaranathan T., Feigin V.L., Norrving B., Donnan G.A. Global stroke statistics: An update of mortality data from countries using a broad code of «cerebrovascular diseases» // International Journal of Stroke. - 2017. - Vol. 12, №8. - P. 796- 801. doi: 10.1177/1747493017730782.
- Patel R.A.G., McMullen P.W. Neuroprotection in the Treatment of Acute Ischemic Stroke // Prog Cardiovasc Dis. - 2017. - Vol. 59, №6. - P. 542-548. doi: 10.1016/j.pcad.2017.04.005.
- Ashrafi M.R., Salehi S., Malamiri R.A., Heidari M., Hosseini S.A., Samiei M., Tavasoli A.R., Togha M. Efficacy and safety of cinnarizine in the prophylaxis of migraine in children: a double-blind placebo-controlled randomized trial // Pediatr Neurol. - 2014. - Vol. 51, №4. - P. 503-8. doi: 10.1016/j.pediatrneurol.2014.05.031.
- Сорокоумова М.В., Компанцев В.А., Щербакова Л.И., Мирошниченко К.А., Платонова А.Ю. Общая характеристика, применение в медицине, методы качественного и количественного анализа циннаризина // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация. - 2017. - №4. - С. 135-140.
- Raghuvanshi S., Pathak K. Recent Advances in Delivery Systems and Therapeutics of Cinnarizine: A Poorly Water Soluble Drug with AbsorptionWindow in Stomach // Journal of Drug Delivery. - 2014., 2014:479246 doi: 10.1155/2014/479246.
- Shahba A.A., Mohsin K., Alanazi F.K. Novel self-nanoemulsifying drug delivery systems (SNEDDS) for oral delivery of cinnarizine: design, optimization, and in-vitro assessment.//AAPS PharmSciTech. - 2012. - Vol. 13. - P. 967-977. doi: 10.1208/s12249-012-9821
- Nguyen T.H., Hanley T., Porter C.J., Boyd B.J. Nanostructured liquid crystalline particles provide long duration sustained-release effect for a poorly water soluble drug after oral administration // Journal Control Release. - 2011. - Vol. 153, №2. - P. 180- 186. doi: 10.1016/j.jconrel.2011.03.033.
- Сорокоумова М.В., Компанцев В.А., Мирошниченко К.А. Разработка и исследование пролонгированного лекарственного средства циннаризина на основе поли-D,L-лактид-когликолида // Евразийский союз ученых. - 2017. - № 10-1(43). - С. 75-79.
- Verma S., Nagpal K., Singh S.K., Mishra D.N. Unfolding type gastroretentive film of Cinnarizine based on ethyl cellulose and hydroxypropylmethyl cellulose // International journal of biological macromolecules. - 2014, Vol. 64. - P. 347-352. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2013.12.030
- Shahba A.A., Ahmed A.R., Alanazi F.K., Mohsin K., Abdel-Rahman S.I. Multi-Layer Self-Nanoemulsifying Pellets Delivery System for the Poorly Water-Soluble Drug Cinnarizine // AAPS PharmSciTech. - 2018. - Vol. 19, №5 - P. 2087-2102. doi: 10.1208/s12249-018-0990-7
- Sassene P.J., Mosgaard M.D., Löbmann K., Mu H., Larsen F.H., Rades T., Müllertz A.. Elucidating the Molecular Interactions Occurring during Drug Precipitation of Weak Bases from Lipid-Based Formulations: A Case Study with Cinnarizine and a Long Chain Self-Nanoemulsifying Drug Delivery System // Molecular Pharmaceutics - 2015. - Vol. 12, №11. - P. 4067-4076. doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.5b00498.
- Morrison J.S., Nophsker M.J., Haskell R.J. A combination turbidity and supernatant microplate assay to rank-order the supersaturation limits of early drug candidates // Journal of pharmaceutical sciences. - 2014. - Vol. 103, №10 - P. 3022-3032. doi: 10.1002/jps.24090.
- Ammar H.O., Ghorab M., Kamel R., Salama A.H. Design and optimization of gastro-retentive microballoons for enhanced bioavailability of cinnarizine // Drug Delivery and Translational Research. - 2016. - Vol. 6, №3. - P. 210-224. DOI:1007/s13346-016-0280-4.
- Haress N.G. Cinnarizine: Comprehensive Profile // Profiles Drug Subst Excip Relat Methodol. - 2015. - Vol. 40. - P. 1-41. doi: 10.1016/bs.podrm.2015.01.001
- Ciftci Z., Deniz M., Yilmaz I., Ciftci H.G., Sirin D.Y., Gultekin E. In vitro analysis of a novel controlled release system designed for intratympanic administration of N-acetylcysteine: a preliminary report // Am J Otolaryngol. - 2015. - Vol. 36, № 6. - P. 786-793. doi: 10.1016/j.amjoto.2015.08.004.
- Портнова С.В., Мцариашвили М.Р. Валидация методики количественного определения циннаризина в смывах // Вестник казанского технологического университета. - 2016. - Т. 19. - №12. - С. 75-78.
- Morrison J., Nophsker M., Elzinga P., Donoso M., Park H., Haskell R. A polychromatic turbidity microplate assay to distinguish discovery stage drug molecules with beneficial precipitation properties // Int J Pharm. - 2017. - Vol. 531, №1. - P. 24-34. doi: 10.1016/j.ijpharm.2017.07.086.
- Abdelrahman M.M. Simultaneous determination of Cinnarizine and Domperidone by area under curve and dual wavelength spectrophotometric methods // Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. - 2013. - Vol. 113. - P. 291-296. doi: 10.1016/j.saa.2013.04.120.
- Choudhari V.P., Ingale S., Gite S.R., Tajane D.D., Modak V.G., Ambekar A. Spectrophotometric simultaneous determination of Tenofovir disoproxil fumarate and Emtricitabine in combined tablet dosage form by ratio derivative, first order derivative and absorbance corrected methods and its application to dissolution study// Pharm Methods. - 2011; Vol. 2, №1 - P. 47-52. doi: 10.4103/2229-4708.81096
- Lamie N.T. Comparative study of spectrophotometric methods manipulating ratio spectra: an application on pharmaceutical binary mixture of cinnarizine and dimenhydrinate.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. - 2015 - Vol. 141. - P. 193-201. doi: 10.1016/j.saa.2015.01.033.
- Благоразумная Е.Ю., Дуккардт Л.Н., Благоразумная Н.В. Качественный и количественный анализ триметилоктадецил аммония бромида в лекарственном средстве бактерицид // Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Серия: Естественные науки. - 2006. - № S23. - C. 60-61.
- Береговых В.В., Пятигорская Н.В., Беляев В.В., Аладышева Ж.И., Мешковский А.П. Валидация в производстве лекарственных средств/ Учебное пособие. - М.: Издательский дом Русский Врач, 2010. - 286 с. https://www.twirpx.com/file/1570313/
- Mishra B., Sahoo J., Prasanna K.D. Enhanced bioavailability of cinnarizine nanosuspensions by particle size engineering: Optimization and physicochemical investigations // Materials Science and Engineering: - 2016. - Vol. 63. - P. 62-69. doi: 10.1016/j.msec.2016.02.046.
- Чмелевская Н.В., Илларионова Е.А. Аналитический контроль однородности дозирования таблеток циннаризина // Сибирский медицинский журнал. - 2009. - №3. - С. 50-52.
- Илларионова Е.А., Чмелевская Н.В., Муравьева Г.М. Разработка методик обнаружения пикамилона и циннаризина в комбинированных сочетаниях с психотропными лекарственными средствами. // Сибирский медицинский журнал. - 2015. - №4. - С. 68-71.
- Общая фармакопейная статья ОФС 1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента». - ГФ XIV. - М., 2018.
补充文件
![](/img/style/loading.gif)