OPTIMIZATION OF THE METHOD FOR OBTAINING NANOCAPSULES, DEVELOPMENT OF THE METHODS OF DETERMINING THE DEGREE OF CINNARIZINE INCLUSION IN A PROLONGED DOSAGE FORM BASED ON POLY-D, L-LACTID-CO-GLICOLIDE, AND ITS VALIDATION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ При цереброваскулярных расстройствах отмечается прогрессирующее повреждение нейронов с последующим их апоптозом вследствие метаболических нарушений,недостатка питательных веществ и кислорода. Это геморрагический и ишемический инсульт, энцефалопатия, мигрень, деменция, нарушение когнитивных функций. Одним из ведущих патогенетических факторов развития данных расстройств является изменение свойств церебральных сосудов, под воздействием таких факторов, как атеросклероз, артериальная гипертензия, приводящих к нарушению мозгового кровообращения [1-4]. Основной группой лекарственныхпрепаратов, назначаемых при данной патологии, являются блокаторы кальциевых каналов,в частности циннаризин, эффективность которого доказана многочисленными клиническими исследованиями [5]. Существующие лекарственные формы циннаризина имеют ряд недостатков, а именно: частота приема, наличие побочных эффектов [6, 7]. Решением по нивелированию данных нежелательных факторов является разработка пролонгированной формы циннаризина, позволяющей уменьшить частоту приемов и тем самым избежать резких изменений концентрации препарата в организме, то есть способной поддерживать концентрацию препарата в организме относительно постоянной и терапевтический эффективной. Современные фармацевтические технологии позволяют создавать пролонгированные лекарственные формы нано- и микроразмеров с контролируемым высвобождением активных субстанций на основе полимерных носителей при помощи метода инкапсулирования [8, 9]. Одним из перспективных полимеров является сополимер молочной и гликолевой кислот (50:50) - поли-D,L-лактид-ко-гликолид (PLGA). Нанокапсулы на основе данного биополимера обеспечивают высокий уровень сорбции,пролонгируемое и программируемое высвобождение препаратов. Также полимер является биосовместимым и биодеградируемым, в организме метаболизируется до эндогенных соединений - молочной кислоты (разлагается до углекислого газа и воды) и гликолевой кислоты (выводится в неизменном виде). Разработана инновационная пролонгированная лекарственная форма циннаризина в виде микро- и нанокапсулна основе биодеградируемого полимера PLGA, предположительно способная нивелировать побочные эффекты препарата. ЦЕЛЬ исследования - корректировка стандартной технологии, разработка и валидация методики определения степени включения циннаризина в полученные микрочастицы, с учётом особенностей инкапсулирования и физико-химических свойств соединений, используемых при производстве. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В данном исследовании была использована субстанция циннаризина, PLGA (50:50), ПВС. Остальные реактивы и растворители соответствовали марке х.ч. 1. Методика определения степени включения циннаризина в нанокапсулы Методика 1 Объектом исследования послужил водный раствор супернатанта, получаемый после центрифугирования [10-14]. Супернатант помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки водой очищенной (раствор А). Учитывая растворимость циннаризина в спирте этиловом и данные литературы по определению степени включения лекарственных веществ в микрокапсулах на основе PLGA, была предложена следующая методика. Степень включения циннаризина устанавливали спектрофотометрически [15-21]. Для этого определяли содержание свободного циннаризина, а затем содержание циннаризина включенного в микрочастицы. Из раствора А отбирали аликвоту объемом 0,4 мл и помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки спиртом этиловым 95% [22-24]. Методика 2 Из раствора А отбирали аликвоту, объемом 20 мл, помещали в делительную воронку, добавляли 5 мл хлороформа и экстрагировали. Спектр хлороформного извлечения измеряли в интервале 220-360 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовали хлороформ. Предварительно измеряли спектр стандартного образца циннаризина в хлороформе. Полноту извлечения циннаризина из раствора А контролировали повторным прибавлением 5 мл хлороформа к водному раствору, полученному после первого экстрагирования. Спектр второго хлороформного извлечения измеряли в интервале 220-360 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовали хлороформ. Методика 3 В данном случае объектом исследования служил раствор супернатанта в хлористоводородной кислоте. Весь объем переносили в мерную колбу вместимость 50 мл, доводили до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной. Предварительно был измерен спектр стандартного образца циннаризина в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной, наблюдали максимум поглощения А=0,576 при длине волны 253 нм. Оценку степени включения циннаризина в нанокапсулы проводили, измеряя спектр поглощения в области 220-360 нм на спектрофотометре СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 1 см, в качестве раствора сравнения использовали раствор кислоты хлористоводородной 0,1 М. 2. Оптимизация способа получения нанокапсул Из литературных данных известно, что циннаризин растворим в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной, соответственно было проведено исследование на растворимость PLGA в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной. Навеску PLGA помещали в 50 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной. При перемешивании в течение трех часов полимер не растворился, в связи с чем, было предложено изменить стандартную технологию нанокапсул. Стандартная технология нанокапсул Для получения микрочастиц циннаризина на основе PLGA был использован метод соосаждения. Точные навески циннаризина и PLGA растворяют в небольшом объеме хлороформа, а затем по каплям вводят в водный раствор ПВС, при гомогенизации с помощью аппарата Ultra-TurraxT-18 (IKA, ФРГ). Полученный раствор, содержащий микрочастицы, центрифугируют при скорости вращения 10000 об/мин в течение 20 минут. Надмикрокапсульную жидкость - супернатант декантируют. Скорректированная технология нанокапсул Точные навески циннаризина и PLGA растворяют в небольшом объеме хлороформа, а затем по каплям вводят в 0,1 М хлористоводородный раствор ПВС, при гомогенизации с помощью аппарата Ultra-Turrax T-18 (IKA, ФРГ). Полученный раствор, содержащий микрочастицы, центрифугируют при скорости вращения 10000 об/мин в течение 20 минут. Надмикрокапсульную жидкость - супернатант декантируют. 3. Методика количественного определения циннаризина в нанокапсулы и ее валидация 3.1. Количественное определение На основе данных, полученных при определении уровня включения циннаризина в нанокапсулы, для количественного анализа были выбраны условия, соответствующие методике №3. Измерения проводились при комнатной температуре шестикратно, данные усреднялись. Расчет содержания циннаризина в супернатантепроизводилипо формуле 1: (1), где Аx - оптическая плотность супернатанта; Cст - концентрация СО циннаризина, г/мл; W1 , W2 - объем мерных колб, мл; Aст - оптическая плотность СО циннаризина; a - навеска циннаризина, г; Va - объем аликвоты, мл. 3.2. Валидация методики количественного определения циннаризина в нанокапсулы Осуществлена валидационная оценка разработанной методики количественного определения циннаризина в микрочастицах. Разработанную методику оценивают по следующим показателям: специфичность, линейность, предел обнаружения, повторяемость, воспроизводимость. Определение специфичности При испытании на специфичность методики определяют влияние растворителя и вспомогательных веществ на оптическую плотность раствора модельной смеси. В качестве растворителя используют 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты. Готовят два раствора: первый - раствор модельной смеси микрочастиц с циннаризином, второй - растворитель и вспомогательные вещества. Определение линейности методики Определение линейности методики количественного анализа циннаризина осуществляют спектрофотометрическим методом. Для этого проводят 6 параллельных определений в навесках модельной смеси микрочастиц. Приготовление модельных смесей Навески микрочастиц циннаризина равные соответственно 0,01 г, 0,02 г, 0,03 г, 0,04 г, 0,05 г и 0,06 г помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, доводят тем же растворителем до метки, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре СФ-56 в максимуме поглощения при длине волны 253 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Определение предела обнаружения При определении предела обнаружения готовят модельную смесь: 0,03 г микрочастиц циннаризина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты и доводят до метки тем же растворителем (раствор А). Из раствора А готовили модельные растворы с концентрацией 1·10-3 г/мл, 1·10-4 г/мл, 1·10-5 г/мл циннаризина. Определение начинали с раствора с наибольшей концентрацией, устанавливая концентрацию, при которой будет отсутствовать максимум поглощения циннаризина при длине волны 253 нм. Определение сходимости Сходимость характеризуется, такими показателям, как повторяемость и воспроизводимость методики. Для определения использовали спектрофотометрический метод анализа, в диапазоне длин волн 220-360 нм. Повторяемость исследуют на образце модельной смеси микрочастиц циннаризина в 10 повторностях. Воспроизводимость методики оценивают на пяти образцах модельных смесей в двух повторностях. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Используя методику определения № 1, было установлено, что при добавлении спирта этилового в водный раствор супернатанта наблюдается образование белой опалесценции и помутнение. Причиной этих явлений является взаимодействие ПВС со спиртом этиловым, в связи с чем, данную методику невозможно использовать для спектрофотометрического определения степени включения циннаризина. Используя методику № 2, в супернатанте было определено количественное содержание циннаризина в размере 1% от введенной навески циннаризина, что подтверждается растворимостью циннаризина в воде [25]. Исходя из полученных результатов, было предложено изменить стандартную технологию микрочастиц путем использования хлористоводородного раствора ПВС, взамен водного раствора, что позволит перевести невключившийся циннаризин в раствор, с последующим определением степени включения [26, 27]. Применение методики №3, позволило определить количественное содержание циннаризина в хлористоводородном растворе супернатанта. Соответственно по разности концентраций представляется возможным вычислить степень инкапсуляции препарата в микрочастицы. Произведя серию определений, получены следующие данные. На рисунке 1 представлен УФ-спектр поглощения раствора супернатанта, полученного по скорректированной технологии. Данный УФ-спектр поглощения совпадает с результатами предыдущих исследований. Исходя из результатов исследования, усредненная оптическая плотность при длине волны 253 нм составила 0,447. Содержание циннаризина в супернатанте рассчитывали по формуле 1. По разности вычисляют степень включения циннаризина: 100% - х = 100 - 36,26=63,74% (таб. 1) Валидационная оценка методики Определение специфичности Полученные растворы анализировали спектрофотометрическим методом. На рисунке 2 представлен УФ-спектр модельной смеси микрочастиц с циннаризином, как видно, в области 230-270 нм наблюдается максимум поглощения характерный для препарата. На рисунке 3 приведен спектр поглощения второго раствора, состоящего из растворителя и вспомогательных веществ. Наглядно представлено, что поглощение в области 230-270 нм практически отсутствует. Исходя из полученных данных определения, можно судить о специфичности разработанной методики [28]. Определение линейности методики По результатам испытаний был построен градуировочный график зависимости значения оптической плотности от навески модельной смеси и рассчитано уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции. График представлен на рисунке 4. Показатель линейности характеризуется коэффициентом корреляции, его значение составило 0,998875, что соответствует требованию не ниже 0,995. Градуировочный график подчиняется линейной зависимости. Показатель коэффициента корреляции соответствует установленным требованиям НД [28]. Следовательно, можно утверждать, что линейная зависимость наблюдается в области концентраций циннаризина, во взятой навески модельной смеси микрочастиц 0,000345-0,002%. Определение предела обнаружения Данные, полученные в ходе исследования, отражены в таблице 2. Разработанная методика позволяет определить предел обнаружения, концентрацию, при которой не будет наблюдаться характерное поглощение для циннаризина при длине волны 253 нм. Установлен предел обнаружения циннаризина в микрочастицах, который составил 1·10-4 г/мл. Определение сходимости Сходимость характеризуется такими показателями, как повторяемость и воспроизводимость методики. Повторяемость оценивают по показателю -коэффициент вариации, его значение по требованию НД не должно превышать 2,0% [28]. Данные о повторяемости методики приведены в таблице 3. Установленный коэффициент вариации составил 1,4%, что входит в область допустимых значений. Результаты тестирования по показателю воспроизводимость методики представлены в таблице 4. Установленный коэффициент вариации составил 1,4%, что входит в область допустимых значений. Результаты тестирования по показателю воспроизводимость методики представлены в таблице 4. Показателем приемлемости выступал коэффициент вариации, его значение, согласно требованиям НД, не должно превышать 3% [28]. Для 10 параллельных измерений в двух сериях он составил 0,60%, что не выходит за пределы допустимого показателя критерия приемлемости. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе проведенных исследований была скорректирована стандартная технология микрочастиц на основе биодеградируемого полимера ПЛГА, путем использования в качестве растворителя 0,1М раствор хлористоводородной кислоты. Разработана методика определения степени включения циннаризина в микрокапсулы методом УФ-спектрофотометрии. Содержание циннаризина в микрокапсулах составило 63,7% от введенной навески циннаризина. Относительная погрешность не превышает ±2,67%. Произведена валидация разработанной методики по показателям: специфичность, линейность, предел обнаружения, повторяемость, воспроизводимость. По результатам тестирования получены данные, по которым можно судить о валидности методики.

About the authors

M. V. Sorokoumova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: mariya_026@mail.ru

N. V. Blagorazumnaya

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: nataliyva@rambler.ru

V. A. Kompantsev

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: l.i.sherbakova@pmedpharm.ru

L. I. Shcherbakova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: l.i.sherbakova@pmedpharm.ru

N. S. Zyablitseva

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: n.s.zyablitseva@yandex.ru

Yu. G. Medvetskaya

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

T. M. Vasina

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: tatyana.vasina.5959@mail.ru

K. A. Miroshnichenko

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: k220436@yandex.ru

References

Supplementary files