Изучение метода культуры in vitro как способа вегетативного размножения хвойных древесных пород

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Исследования направлены на совершенствование технологии вегетативного размножения хвойных древесных пород в условиях in vitro путем подбора оптимальных сред для стерилизации эксплантов вегетативных частей растений, использования регуляторов роста для получения каллуса и стимуляции корнеобразования пробирочных растений. В качестве объектов исследования были вегетативные части хвойных растений: почки и части годичных побегов. Растительные объекты простерилизованы и высажены на питательные среды различного состава согласно схеме опытов. Проведены лабораторные исследования, на основании которых отмечено успешное применение гипохлорита натрия по сравнению с другими реагентами при стерилизации эксплантов. По результатам опытов выявлена питательная среда Woody Plant Medium, способствующая наилучшей приживаемости эксплантов хвойных растений. Также определено влияние на приживаемость эксплантов и их жизнеспособность в культуре in vitro таких регуляторов роста, как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и 2,4-динитрофенол в составе питательных сред. Данная методика позволяет при дальнейшем культивировании и размножении хвойных растений получить посадочный материал, наиболее полно сохраняющий в потомстве хозяйственно ценные признаки и свойства материнского растения.

Полный текст

Одно из перспективных направлений развития науки XXI в. – микроклональное размножение растений. Основные его преимущества по сравнению с традиционным вегетативным способом: высокий коэффициент размножения, расширение сезонности выполняемых работ и выпуск растений к определенному сроку, а также возможность размножать и укоренять растения, которые не размножаются или затруднительно размножаются обычными способами [1].

Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых сортов. Они предполагают принципиально новые пути, такие как сомаклональная изменчивость, мутагенез на клеточном уровне, клеточная селекция, соматическая гибридизация для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании безвирусного материала вегетативно размножаемых растений [2].

Поскольку продукция лесной отрасли находит применение практически в каждой производственной сфере, лесной сектор очень привлекателен для внедрения биотехнологий [3, 4]. Сейчас достигнуты достаточно хорошие результаты по различным направлениям лесной биотехнологии, но, несмотря на это, пока не наблюдается их широкое внедрение в лесохозяйственную практику [5]. В начальные этапы развития лесной биотехнологии методы культуры тканей in vitro, обеспечивающие быстрое размножение травянистых растений, были применены и на древесных породах. Изначально эти методы были малоэффективны, особенно при работе с взрослыми формами деревьев [6]. Однако разработке и совершенствованию технологии выращивания посадочного материала древесных культур улучшенного качества уделяют внимание зарубежные авторы [7-9].

В биотехнологии микроклонального размножения хвойных растений существует два направления – соматический и микроспориальный эмбриогенез. Большинство исследований, посвященных проблеме микроклонального размножения хвойных пород древесных растений in vitro, выполнено методом соматического эмбриогенеза. Использование в качестве эксплантов мегагаметофитов незрелых зиготических зародышей, семядолей, гипокотиля, микроспороцитов, микроспор и пыльцы лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb), сосны сибирской (Pinus sibirica Rupr.), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и кедрового стланика (Pinus pumila Regel.) позволило получить у этих видов растений соматические зародыши и зародышеподобные структуры [10 - 13, 14].

Недостатком данного метода служит наличие контролируемого опыления для получения чистых линий. Строго учитываются сроки взятия образцов: семена собирают в предсемядольной стадии развития зародыша. Данный способ требует специализированного оборудования для контроля над опылением и сбором семян. Исследования показали, что успешное формирование эмбрионально-суспензорной массы зависит от срока сбора семян, стадии введения зародышей в культуру и растения-донора [15].

Экспланты из семян или проростков (ювенильный материал) обычно наиболее пригодны для культивирования in vitro. Однако посадочный материал, полученный таким способом, аналогичен посадочному материалу из семян, и уровень наследуемости ценных признаков будет всего 10-20% [16]. Использование семенного поколения не позволяет полностью воспроизвести генотип исходного растения. В зрелом растении генотип реализуется в фенотип, и отбором среди таких экземпляров можно выбрать плюсовые деревья для клонирования in vitro. Однако такой способ занимает довольно много времени на выращивание дерева, что не соответствует требованиям ускоренного размножения.

Методы вегетативного размножения растений in vitro включают в себя культуру побегов с размножением пазушных или придаточных побегов, а также каллусную культуру с регенерацией побегов или эмбриоидов [1]. Метод культуры побегов применяли для многих видов древесных растений, включая плодовые, лесные и декоративные. Каллусную культуру использовали реже, которая, однако, оказалась эффективной для таких важных древесных культур, как Citrus и гвинейская масличная пальма. До сих пор наиболее усложненные варианты размножения in vitro с использованием клеточных суспензий, культивируемых пыльников и протопластов редко успешно завершаются при работе с деревьями [17].

В связи с этим задачей настоящей работы было выявить наиболее эффективный способ ускоренного размножения хвойных пород для нужд лесного и садово-паркового хозяйства с применением метода культуры in vitro.

Методика. Работы с культурой in vitro проводили в стерильных условиях меристемной лаборатории Удмуртского научно-исследовательского института сельского хозяйства. Cбор эксплантов c модельных особей древесных растений ели европейской Picea abies (L.) Karst. и ели колючей Picea pungens Engelm., характеризующихся высокой функциональной активностью и хорошим жизненным состоянием, проводили на базе Удмуртского государственного университета [18]. В качестве посадочного материала в культуре in vitro использовали верхушечные почки и части молодых стеблей взрослых древесных растений. Кроме того, для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве эксплантов использовали молодые слабо дифференцированные ткани: верхушечные почки растений, молодые побеги от 1 до 10 см длиной. Для сбора почек подходящее время – январь-апрель, когда почки уже набухают, но еще не раскрыты. В мае-июле проводили сбор молодых побегов, находящихся в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту).

Стерилизацию растительного материала осуществляли путем погружения эксплантов в дезинфицирующий раствор (5%-ный раствор гипохлорита натрия, экспозиция – 30 мин; 5%-ный спиртовой раствор хлоргексидина, экспозиция – 10 мин; 6%-ный раствор хлорамина, экспозиция – 10 мин). После стерилизации растительные ткани промывали в 3-4 порциях стерильной дистиллированной воды.

Метод культуры in vitro проводили на различных средах: Мурасиге-Скуга, Woody Plant Medium (WPM), Андерсона с уровнем рН 5,6-5,8. К стандартному минеральному составу среды были добавлены витамины, антибиотики, регуляторы роста, антиоксиданты. Для адсорбции ингибиторов роста, выделяемых тканями растений, и ускорения роста побегов голосеменных добавляли активированный уголь в концентрации 2%. Добавление гормонов роста проводили по схеме в выделившуюся в предыдущем опыте питательную среду WPM: 1 – без гормонов (контроль); 2 – 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) – 2 мг/л; 3 – 2,4-динитрофенол – 0,092 мг/л; 4 – 2,4-Д + 6-БАП (6-бензиламинопурин) – 2 мг/л + 2 мг/л; 5 – 2,4-динитрофенол + 6-БАП – 0,092 мг/л + 2 мг/л. Пробирки с эксплантами культивировали в комнате без доступа света при температуре 22-25 оС и влажности 70% в течение 2 нед. Дальнейшее культивирование проводили при 26 °C, световом периоде 16 ч и освещенности 4–5 тыс. люкс. Для поддержания пролиферирующих культур каждые 2-3 нед экспланты пересаживали на свежую питательную среду.

Результаты и обсуждение. В ходе исследований лучшим стерилизующим агентом оказался 5%-ный раствор гипохлорита натрия с 30- минутной экспозицией стеблей и 10- минутной – почек хвойных растений. При стерилизации гипохлоритом натрия приживаемость почек ели колючей составила в среднем 67%, ели европейской – 61%. Для стерилизации стеблевых черенков потребовалось увеличить концентрацию этого раствора до 7-10%, при этом приживаемость почек была на уровне 17-19%. Использование растворов хлоргексидина и хлорамина с экспозицией 10 мин не обеспечило асептики тканей стеблевых черенков растений. Экспланты очень быстро поражались патогенной микрофлорой и дальнейший их рост был невозможен.

 

Табл. 1. Приживаемость (%) эксплантов на различных питательных средах

Эксплант (В)

Питательная среда (А)

Среднее В

½ Мурасиге-

Скуга

Мурасиге-

Скуга

Андерсона

Woody

Plant Medium

Ель европейская

Почки

50

38

43

73

51

Стебли

42

43

35

62

46

Среднее А

46

41

39

68

49

НСР05

главных эффектов

частных различий

 

А

16

23

 

В

16

32

 

Ель колючая

Почки

38

42

42

63

46

Стебли

35

27

26

44

33

Среднее А

37

34

34

54

40

НСР05

главных эффектов

частных различий

 

А

20

29

 

В

19

39

 

 

Табл. 2. Приживаемость (%) эксплантов при использовании регуляторов роста

Эксплант (В)

Регуляторы роста (А)

Среднее В

без

гормонов

2,4-Д

ИД-82

2,4-Д+ БАП

ИД-82 +БАП

Ель европейская

Почки

39

25

41

43

59

41

Стебли

39

56

37

69

59

52

Среднее А

39

40

39

56

59

47

НСР05

главных эффектов

частных различий

 

А

18

26

 

В

11

30

 

Ель колючая

Почки

38

43

28

27

42

36

Стебли

39

26

41

41

43

38

Среднее А

37

35

34

34

42

36

НСР05

главных эффектов

частных различий

 

А

13

19

 

В

11

30

 

 

Оптимальной питательной средой для посадки эксплантов определена среда WPM, на которой продолжили развитие 63% почечных эксплантов ели колючей и 73% – ели европейской (табл. 1). У ели европейской прижились 62 % стеблевых черенков, у ели колючей – 44 %. На средах Андерсона и Мурасиге-Скуга количество жизнеспособных почечных эксплантов двух видов ели достигало 38-50 %, стеблевых черенков – 25-42 %. В сравнении с другими средами экспланты на среде WPM имели ярко-зеленую окраску и свежий вид более длительное время, интенсивный верхушечный рост и рост каллуса продолжался в течение 6 мес.

Добавление гормонов роста в выделившуюся питательную среду также повлияло на рост эксплантов и образование каллуса (табл. 2). Лучший результат получен при совместном добавлении в среду WPM ауксина и цитокинина (ИД –82% +БАП – 59%), при этом к 3-й неделе культивирования был заметен верхушечный рост черенков, тогда как на среде без гормонов рост начинался на 2 нед позже. Сочетание гормонов в питательной среде ускорило каллусообразование, которое началось на 10-й день после посадки. При добавлении только ауксинов нарастание каллуса стало заметно лишь на 15-17-й день, а на безгормональной среде каллус образовался на 22-25-й день или вообще не формировался.

Результаты трехлетних исследований показали, что введение в культуру in vitro вегетативных частей растений хвойных пород – длительный и сложный процесс, требующий детального подхода к каждому этапу культивирования. Эффективная стерилизация растительного материала достигнута только при использовании 5%-ного раствора гипохлорита натрия (NaOCl). Наиболее оптимальной питательной средой для введения в культуру in vitro хвойных растений определена среда WPM с добавлением ауксинов и цитокининов. Сочетание гормонов способствовало более активному росту и развитию каллусных клеток, что позволяет длительное время культивировать экспланты перед высадкой в грунт.

×

Об авторах

В. В. Красноперова

Ижевская государственная сельскохозяйственная академия; Удмуртский научно-исследовательский институт сельского хозяйства

Автор, ответственный за переписку.
Email: vlada-vk@bk.ru

аспирант

Россия, Ижевск; Завьяловский район, с. Первомайский

И. Л. Бухарина

Удмуртский государственный университет

Email: buharin@udmlink.ru

доктор биологических наук

Россия, Ижевск

Список литературы

  1. Тимофеева О.А., Румянцева Н.И. Культура клеток и тканей растений: учебное пособие. – Казань: Казанский университет, 2012. – 91 с.
  2. Широков А.И., Крюков Л.А. Основы биотехнологии растений// Электронное учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2012. – 49 с.
  3. Газизуллин А. Х. Современное состояние лесной биотехнологии в мире и в России // Вестник Казанского ГАУ. – 2012. – № 4 (26). – С. 94-98.
  4. Красноперова В.В., Исламова Н. А., Бухарина И.Л. К вопросу о современных технологиях размножения хвойных древесных пород // Международный научно-исследовательский журнал (ВАК). – 2016. – № 5 (47) часть 6. – С. 36-38.
  5. Жигунов А.В. Применение биотехнологий в лесном хозяйстве России // Лесной журнал. – 2013. – № 2. – С. 27–35.
  6. Winton L.L., Thorpe ed. T. A. Morphogenesis in clonal propagation of woody plants. In Frontiers of Plant Tissue Culture // Calgary: Calgary University. – 1978. – Р. 419 – 426.
  7. Hasnain S., Cheliah W.Tissue culture in forestry: economic and genetic potential // Forestry Chronicle. – 1986. V. 62. − № 4. − P. 219-225.
  8. Malabadi R. B., Nataraja K. Genetic transformation of Conifers: Applications in and Impacts on commercial Forestry // Transgenic plant Journal.– 2007. – Т. 1(2). – Р. 289–313.
  9. Lelu-Walter M-A., Bernier-Cardou M., Klimaszewska K. Clonal plant production from self-and cross-pollinated seed families of Pinus sylvestris through somatic embryogenesis // Plant Cell Tiss Organ Cult. − 2008.− V.92.−Р. 31-45.
  10. Tang W. The effect of different plant growth regulation on adventitious shoot formation from Pinus virginiata zygotic embryo // Plant Cell Tiss. Organ Cult. − 2004. − V. 78. − P. 237-240.
  11. Белоруссова А.С. Закономерности соматического эмбриогенеза и андроклинии у лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb): эмбриологические аспекты: автореф. дис. … к-та биол. наук. – Красноярск. – 2007. – 21 с.
  12. Третьякова И.Н., Ижболдина М.В. Особенности роста эмбриогенного каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского // Хвойные бореальной зоны. –2008. – № 1- 2. – С. 71-77.
  13. Третьякова А.В., Демина Е.А., Рекославская Н.И., Саляев Р.К. и др. Особенности получения каллусной культуры пихты сибирской Abies sibirica Ledeb // Известия Иркутского государственного университета. – 2014. – Т. 10. Серия «Биология. Экология». – С. 11–23.
  14. Третьякова И.Н, Ворошилова Е.В., Иваницкая А.С. [и др.]. Эмбриогенные клеточные линии и соматический эмбриогенез in vitro у видов хвойных произрастающих в Сибири // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: сборник тезисов Х Международной конференции, 14-18 Октября 2013 г. – Казань, 2013. – С. 151-152.
  15. Третьякова И.Н., Белоруссова А.С., Носкова Н.Е. Перспективы применения методов биотехнологии для размножения генетически ценных форм лесных древесных видов // Хвойные бореальной зоны. – 2007. – № 2-3. – С. 309-317.
  16. Долголиков В.И., Попивший И.И. Положительные стороны и недостатки клоновой селекции ели // Лесоведение. – 1992. – № 2. – С. 11–18.
  17. Биотехнология сельскохозяйственных растений // Пер. с англ. В.И. Негрука; предисл. Р.Г. Бутенко. – М.: Агропромиздат, 1987. – 301 с.
  18. Ведерников К.Е., Бухарина И.Л., Журавлева А.Н., Загребин Е.А., Красноперова В.В. К вопросу изучения показателей качества семян хвойных растений, произрастающих в городских насаждениях (на примере г. Ижевска) // Успехи современной науки и образования. – 2016. – №10. – Т. 7. – С. 113-116.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2019