Fractional composition of copper compounds in metal–contaminated soil and its accumulation in plants in application of growth promoting rhizosphere bacteria

Full Text

Медь (Cu) выступает одним из биологически значимых и необходимых элементов для растений, однако при повышенных концентрациях может оказывать токсическое действие [1]. Биоремедиация токсичных тяжелых металлов (ТМ) вызывает значительный и растущий интерес, поскольку это экологически безопасный и эффективный метод восстановления окружающей среды, загрязненной ТМ, с использованием внутренних биологических механизмов микроорганизмов и растений [2]. Для ремедиации загрязненных ТМ почв и повышения продуктивности сельскохозяйственных культур исследуются стимулирующие рост растений ризосферные бактерии (plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR) [3, 4]. Представители PGPR рода Pseudomonas привлекают особое внимание благодаря широкой распространенности и присущим им ряду полезных для растений свойств [3, 5]. Сообщается, что Pseudomonas обладают высокой устойчивостью к ТМ и имеют высокий биоремедиационный потенциал, в том числе в ассоциациях с различными видами растений [6]. Применение PGPR рода Pseudomonas существенно уменьшало фитотоксичность и повышало устойчивость растений к токсическому действию различных ТМ [7, 8]. Установлены значительная стимуляция роста растений подсолнечника и увеличение поглощения Cu вегетативной биомассой и корнями после инокуляции бактерией P. lurida штаммом EOO26 на фоне загрязнения почвы CuSO₄·5H₂O [1]. Применение ростостимулирующей ризосферной бактерии P. thivervalensis улучшило параметры роста растений рапса (Brassica napus L.), в том числе увеличило биомассу и потребление Cu растениями на загрязненной металлом почве [9]. В последние годы, несмотря на то, что имеются многочисленные данные, свидетельствующие о значительной стимуляции роста растений под влиянием PGPR, исследований по изучению растительных и в особенности почвенных механизмов ремедиации загрязненных ТМ почв, в том числе Cu, под влиянием этих бактерий проведено относительно недостаточно.

Цель исследований – изучение влияния внесения PGPR рода Pseudomonas на фракционный состав соединений Cu в почве, массу растений яровой пшеницы и усвоение Cu растениями при их выращивании на загрязненной ТМ в повышенной концентрации агросерой почве.

Методика. Исследования проводили при выращивании яровой пшеницы T. aestivum L. сорта Злата (ФИЦ «Немчиновка») в вегетационном опыте при искусственном загрязнении Cu(NO₃)₂·3H₂0 пахотной среднесуглинистой агросерой почвы (слой 0…20 см) юга Московской области. В сосудах, содержащих 800 г почвы, выращивали по 9 растений до фазы трубкования в течение 27 дней. В контрольном варианте растения выращивали в почве без внесения меди и без инокуляции бактериями. Вариант с внесением меди без бактерий рассматривали для оценки влияния загрязнения почвы на распределение металла по почвенным фракциям и на ее усвоение растениями. В почву вносили Cu из расчета 300 мг/кг, что в 2,3 раза превышало ориентировочно допустимую концентрацию (ОДК) для аналогичных почв. С этой солью было внесено 106 мг N/сосуд, поэтому в контрольном варианте (без внесения Cu(NO₃)₂·3H₂0 и бактерий) применяли азот в виде NH₄NO₃ в такой же дозе, какая была использована в загрязненных вариантах. То есть, доза азота была выровнена во всех вариантах опыта, растения выращивали на фоне внесения PK-удобрений в виде однозамещенного фосфорнокислого калия и сернокислого калия по 106 мг действующего вещества/сосуд, исходя из соотношения N : P : K = 1:1:1. Для изучения влияния бактерий на распределение металла по фракциям в почве использовали варианты с внесением металла в почву и с инокуляцией бактериями штаммов P. fluorescens 20, P. fluorescens 21 и P. putida 23. Поступление металла в растения и их рост рассматривали в вариантах с внесением металла в почву без бактериальной инокуляции. При посеве стерилизованные семена инокулировали суспензиями бактерий из расчета 10⁸ клеток на растение. В вариантах без инокуляции бактериями применяли автоклавированные бактериальные суспензии. Влажность почвы в течение роста растений поддерживали не ниже 60 % полной полевой влагоемкости (21 % мас. %).

Вегетативную массу (листья и стебли) после срезания растений высушивали при 70 ^oС, взвешивали и озоляли (0,5 г) в смеси концентрированных кислот HNO₃ : HClO₄ (2:1). В почве фракционировали соединения Cu методом последовательных селективных экстракций. Выделяли следующие фракции Cu: водорастворимую; обменную (экстрагент – 0,05 М Са(NO₃)₂); специфически сорбированную, связанную с карбонатами (2,5 % CH₃COOH); связанную с органическим веществом (0,1 K₄P₂O₇); связанную с железистыми минералами (реактив Тамма при ультрафиолетовом облучении). Содержание Cu в остаточной фракции, прочно связанной с глинистыми минералами, устанавливали по разности между внесенным в почву количеством металла и его суммой в выделенных фракциях. Концентрацию меди в растворах, полученных при последовательной экстракции из почвы, а также в растворах озоленных растительных препаратов измеряли методом эмиссионно-оптической спектроскопии индуктивно-связанной плазмы на спектрометре ICP-OES 5110 (Agilent, США). Статистическую обработку полученных данных проводили, используя функции F.TEST (оценка вероятности сходства выборок), ДОВЕРИТ.НОРМ (определение доверительного интервала для среднего при нормальном распределении), КВАДРОТКЛ (оценка отклонений точек от среднего) и НОРМ.РАСП (оценка нормального распределения) пакета MS Excel 2010.

Результаты и обсуждение. Анализ распределения по фракциям показал, что медь находится во всех выделенных фракциях почвы примерно через месяц после выращивания растений (табл. 1). В модельном эксперименте при внесении Cu(NO₃)₂·3H₂0 в дерново-подзолистую почву и чернозем медь была представлена во всех фракциях, выделенных аналогичным использованным в наших исследованиях методом [10].

 

Табл. 1. Фракционный состав соединений Cu в почве при внесении бактерий на фоне загрязнения почвы металлом

Вариант	Водораство-римая	Обменная	Специфически сорбированная	Связанная		Остаточная
				с органическим веществом	с железистыми минералами
Cu без внесения бактерий	0,6±0,08 0,2±0,07	0,7±0,10 0,2±0,03	26,0±3,2 8,7±1,2	102,3±15,0 34,1±5,1	40,9±5,9 13,6±1,7	123,5±18,0 43,2±6,4
Cu + + P. fluorescens 20	0,9±0,13 0,3±0,04	0,5±0,07 0,2±0,03	37,8±5,5 12,6±1,6	113,0±14,8 37,7±5,2	101,7±15,0 33,9±4,9	46,1±6,7 15,3±2,1
Cu + + P. fluorescens 21	0,9±0,12 0,3±0,03	0,4±0,06 0,1±0,01	36,1±5,4 12,0±1,6	119,8±17,1 39,9±5,6	74,2±11,0 24,7±3,5	68,6±10,1 23,0±2,9
Cu + + P. putida 23	0,9±0,12 0,3±0,04	0,4±0,06 0,1±0,01	37,0±5,5 12,3±1,7	131,9±19,0 44,0±6,6	56,1±8,2 18,7±2,5	73,7±10,3 24,6±3,5

*в числителе – мг/кг почвы, в знаменателе – % от внесенного количества.

 

В водорастворимой и обменной фракциях во всех вариантах содержалась незначительная доля металла – 0,1…0,3 % от внесенного количества. Медь аккумулировалась вне зависимости от применения бактерий, главным образом во фракции, связанной с органическим веществом (34,1…44,0 %), и фракции, связанной с оксидами и гидроксидами Fe и Mn (13,6…33,9 %), и в меньшей степени – в специфически сорбированной фракции, связанной с карбонатами (8,7…12,6 %). На примере дерново-подзолистой почвы и чернозема показано, что для Cu характерно большое сродство к органическому веществу при загрязнении азотнокислой медью [10]. В остаточной фракции, связанной с глинистыми минералами, было сосредоточено 15,3…43,2 % ТМ.

Внесение бактерий оказало существенное влияние на распределение в почве Cu. Под влиянием бактерий P. fluorescens 20 и P. fluorescens 21 обнаружено увеличение в 1,8…2,5 раза содержания ТМ во фракции, связанной с оксидами и гидроксидами Fe и Mn, в варианте с P. putida 23 величина этого показателя увеличилась в 1,4 раза. Кроме того, внесение бактерий способствовало увеличению содержания меди в специфически сорбированной фракции, связанной с карбонатами, в 1,4 … 1.5 раза. Бактерии достоверно увеличили содержание Cu во фракции, связанной с органическим веществом – на 11…29 %. Вследствие всех этих изменений в вариантах с бактериями содержание меди в остаточной фракции уменьшилось с 43,2 % до 15,3…24,6 % от внесенного количества и составило 37…60 % по отношению к варианту без применения бактерий. То есть, при внесении бактерий значительная часть металла после выращивания пшеницы до фазы трубкования сосредотачивалась в относительно подвижных формах, при этом уменьшаясь в остаточной фракции.

При загрязнении почвы Cu установлено значительное ингибирование роста яровой пшеницы (табл. 2). Это выражалось в уменьшении на 13…24 % массы вегетативных органов и целых растений относительно контроля – без загрязнения ТМ и бактериальных инокуляций. Применение бактерий уменьшило токсическое действие Cu и стимулировало рост растений. При внесении бактерий вегетативная масса растений, подвергнутых Cu-стрессу, была на 13…16 % больше, в сравнении с вариантом с загрязнением ТМ без бактериальных инокуляций. Бактерии при загрязнении Cu также способствовали лучшему росту корневой системы – масса корней увеличилась на 20…24 %.

 

Табл. 2. Масса растений яровой пшеницы при внесении бактерий на фоне загрязнения почвы медью (сухое вещество), г/сосуд

Вариант	Вегетативная масса	Корни	Целое растение
Без внесения Cu и бактерий – контроль	2,65	0,61	3,26
Cu без внесения бактерий	2,01	0,41	2,42
Cu + P. fluorescens 20	2,32	0,50	2,82
Cu + P. fluorescens 21	2,28	0,49	2,77
Cu + P. putida 23	2,33	0,51	2,84
НСР05	0,26	0,08	0,34

 

Загрязнение Cu почвы вне зависимости от внесения бактерий до полутора раз увеличило содержание ТМ в вегетативной массе (табл. 3).

 

Табл. 3. Содержание в растениях и усвоение Сu растениями при внесении бактерий на фоне загрязнения почвы металлом

Вариант	Содержание Сu в растениях, мг/кг		Усвоение Сu растениями, мкг/сосуд
	вегетативная масса	корни	вегетативная масса	корни
Без внесения Сu и бактерий – контроль	11	24	29	15
Сu без внесения бактерий	15	399	30	164
Сu +P. fluorescens 20	15	456	35	263
Сu +P. fluorescens 21	17	441	39	255
Сu + P. putida 23	15	440	35	259
НСР05	2	74	4	31

 

При загрязнении почвы Cu величина этого показателя в корневой системе увеличилась в значительно бóльшей степени, чем в вегетативной массе. В варианте без внесения бактерий содержание Cu в корнях увеличилось в 17 раз, при внесении бактерий – в 18…19 раз по сравнению с контролем. Относительно варианта с загрязнением Cu без бактерий содержание ТМ в корнях при инокуляции P. fluorescens 20 увеличилось на 14 %, при применении P. fluorescens 21 и P. putida 23 – в виде тенденции – на 10…11 %. Применение бактерий в загрязненных условиях увеличило усвоение или вынос металла (в мкг/сосуд) из почвы вегетативной массой на 17…30 %, в наибольшей степени – в варианте с P. fluorescens 21, в сравнении с загрязнением ТМ без бактерий (табл. 3). То есть, внесение бактерий усилило фитоэкстракцию – очистку загрязненной почвы. Под влиянием бактерий усвоение Cu корнями в загрязненных условиях увеличилось в 1,5…1,6 раза. Усвоение Cu корнями вне зависимости от внесения бактерий было в 6…8 раз больше, чем вегетативной массой из-за его более высокого содержания.

Увеличение усвоения Cu вегетативной массой и корневой системой инокулированных бактериями рода Pseudomonas растений, вероятно, было обусловлено увеличением подвижности в почве металла, о чем свидетельствуют уменьшение его доли и содержания в остаточной фракции и повышенное содержание в почве в других формах, кроме водорастворимой и обменной фракций. PGPR способны влиять на подвижность в почве и биодоступность металлов через процессы подкисления, комплексоообразования, осаждения и окислительно-восстановительные реакции [11, 12]. Продуцирование PGPR ряда веществ, в том числе сидерофоров – низкомолекулярных органических соединений, также переводит ТМ в растворимые и биодоступные формы и наряду с другими полезными свойствами ризобактерий стимулирует рост растений и уменьшает неблагоприятное действие ТМ [11, 12, 13]. Так, установлено, что дитиокарбоновая кислота – сидерофор, продуцируемый Pseudomonas spp., образует растворимые комплексы с Cr, Cu, Fe, Mn, Ni и Zn, но осаждает из раствора Cd, Pb и As [13]. Повышенное содержание Cu в почве в составе вышеупомянутых фракций, при внесении всех бактерий, вероятно, связано с продуцированием бактериальных сидерофоров, которые образуют растворимые комплексы с Cu. Бόльшее усвоение Cu растениями при применении бактерий, а, следовательно, усиление фитоэкстракции, было обусловлено тем, что значительная часть меди сосредотачивалась в относительно подвижных формах, уменьшаясь в остаточной фракции и, вероятно, вследствие этого, увеличением подвижности и биодоступности металла.

Повышение устойчивости растений яровой пшеницы к токсическому действию меди и усиление фитоэкстрации при применении PGPR имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение. Впервые показано, что бактерии не только повышают продуктивность загрязненных растений. Учитывая то, что, вне зависимости от формы поступления техногенных соединений ТМ, Cu в загрязненных почвах локализуется в основном в труднодоступных формах [15], бактерии переводят медь в более подвижные формы и, увеличивая фитоэкстракцию, уменьшают ее содержание в почве, тем самым, способствуют очистке почвы. Кроме того, при дефиците подвижной меди в почве с достаточно высоким валовым содержанием микроэлемента, ее поступление в растения из почвы во многом определяется активностью почвенных микроорганизмов [16], и применение исследованных бактерий будет способствовать увеличению продуктивности сельскохозяйственных культур.

Выводы. Внесение PGPR рода Pseudomonas обеспечило повышение устойчивости яровой пшеницы к высокой концентрации Сu в почве и увеличение массы растений, значительно уменьшая фитоксичность металла. Положительное действие бактерий при загрязнении почвы Cu было обусловлено увеличением содержания и накопления ТМ в корнях – ответной протекторной реакцией растений на загрязнение почвы. Внесение бактерий повышало усвоение ТМ вегетативной массой из почвы, тем самым, усиливая фитоэкстракцию – очистку почвы от загрязнения и улучшая ремедиацию загрязненной почвы. Под влиянием бактерий содержание Сu в почве возросло главным образом в специфически сорбированной и связанной с железистыми минералами фракциях, в меньшей мере – в органической фракции, одновременно содержание металла в остаточной фракции уменьшилось. Увеличение усвоения Cu растениями при внесении бактерий обусловлено тем, что значительная часть металла переходила в относительно более подвижные формы, вследствие этого, вероятно, увеличилась его биодоступность.

Финансирование работы.

Работа финансировалась за счет средств бюджета в рамках государственных заданий Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН 121041500050-3 (60 % затрат), 121040500038-3 (20 % затрат) и Института фундаментальных проблем биологии РАН 122041200035-2 (20 % затрат).

Соблюдение этических стандартов.

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов.

Авторы этой работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности.

Авторы выражают благодарность д. с.- х. н. Н. В. Давыдовой, ФИЦ «Немчиновка» за предоставление высококачественных семян для проведения опыта.

About the authors

V. P. Shabayev

Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: vpsh@rambler.ru

доктор биологических наук

Russian Federation, 142290, Moskovskaya obl., Pushchino, ul. Institutskaya, 2

M. P. Volokitin

Institute of Basic Biological Problems, Russian Academy of Sciences

Email: vpsh@rambler.ru

кандидат сельскохозяйственных наук

Russian Federation, 142290, Moskovskaya obl., Pushchino, ul. Institutskaya, 2

V. E. Ostroumov

Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science, Russian Academy of Sciences

Email: vpsh@rambler.ru
Russian Federation, 142290, Moskovskaya obl., Pushchino, ul. Institutskaya, 2

References

Supplementary files