Email this article Study of ASIP and MC1R gene polymorphism horses of the kabardian breed
- Authors: Khaudov A.D.1, Zhekamukhov M.H.2, Zaitsev A.M.3, Amshokova Z.H.2, Berbekova N.V.2, Amshokov H.K.2
-
Affiliations:
- Federal Scientific Center Kabardino-Balkar Scientific Center of the Russian Academy of Sciences
- Institute of Agriculture – branch of the Kabardino-Balkarian Scientific Center of the Russian Academy of Sciences
- Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства
- Issue: No 1 (2024)
- Pages: 47-50
- Section: Animal science and veterinary medicine
- URL: https://journals.eco-vector.com/2500-2627/article/view/657992
- DOI: https://doi.org/10.31857/S2500262724010099
- EDN: https://elibrary.ru/CSHWZJ
- ID: 657992
Cite item
Full Text
Full Text
Кабардинская порода лошадей одна из самых древних в России. Ее высоко ценят за выносливость и устойчивость к различным климатическим условиям табунного содержания в средне- и высокогорье. Благодаря прочности копыт кабардинские лошади надежны и безопасны для езды в горных условиях. Кроме того, они обладают высокой скоростной выносливостью и легкостью движения, что позволяет им быть успешными участниками различных соревнований.
На сегодняшний день существует несколько программ по улучшению и развитию породы, которые включают в себя подбор качественных жеребцов и кобыл для разведения, а также проведение специальных мероприятий для дальнейшего совершенствования породы. Для их реализации необходимо определить характеристику породы на морфологическом и генетическом уровне, что служит первым шагом в разработке селекционной стратегии и установлении приоритетов развития породы.
Лошади относятся к числу самых разнообразных по окраске животных, которые существуют на нашей планете. При этом цвет шерсти имеет не только визуальную функцию, но и может служить индикатором здоровья, уровня стресса и даже способностей к выполнению определенных задач [1]. Наиболее известные варианты мастей лошадей – гнедая и ее оттенки, вороная, серая и рыжая. Как и у многих других видов животных, процесс формирования масти у лошадей довольно сложен [2].
Белок, кодируемый геном MC1R, находится на поверхности меланоцитов и активируется меланоцитстимулирующим гормоном (MSH), что приводит к образованию эумеланина, который представляет собой черный пигмент, обусловленный экспрессией гена дикого типа (аллель E). Мутация MC1R C901T приводит к образованию рецессивного аллеля e, влияние которого обусловливает образование в меланоцитах только феомеланина [3], который представляет собой красно-желтый пигмент. Меланоциты, гомозиготные по рецессивной мутации e/e в гене MC1R, не могут быть активированы MSH, что приводит к образованию только феомеланина [4, 5].
Ген ASIP кодирует сигнальный белок агути (аллель A – дикий тип). Этот белок – антагонист MSH и может блокировать функцию MC1R, что приводит к ингибированию синтеза эумеланина в меланоцитах лошади [2]. Мутация в виде делеции длиной 11 п. н. в экзоне 2, гена ASIP, которая соответствует аллелю a, приводит к потере функции сигнального белка агути и обусловливает черный окрас шерсти у лошадей [6].
Гены MC1R и ASIP полиморфны, то есть они имеют множество различных вариантов, которые могут влиять на окраску шерсти у лошадей [7]. Кроме того, их мутации могут взаимодействовать между собой, что приводит к более сложным вариантам окраски.
Также следует отметить, что на масть лошадей могут влиять и другие гены, например, отвечающие за формирование пятен, полос и других отметин на теле лошади [8]. Однако важность генов MC1R и ASIP в этом процессе неоспорима, и они остаются предметом активных исследований [9].
Исходя из изложенного, гены MC1R и ASIP играют важную роль в формировании окраски шерсти у лошадей и могут быть использованы для прогнозирования масти в селекционной работе [10].
Масти в кабардинской породе разнообразны, но наибольшее распространение имеют гнедые, темно-гнедые, вороные и караковые лошади. Так, среди животных производящего состава, записанных в VIII том государственной племенной книги лошадей кабардинской породы [11], светло-гнедых был 0,1%, гнедых – 33,3%, темно-гнедых – 21,7%, вороных – 24,0%, караковых – 20,4%, серых – 0,5%.
Цель исследования – установить распределение аллелей генов пигментообразования MC1R и ASIP в существующей популяции кабардинской породы для определения ее характеристик по этим ДНК-маркерам.
Методика. Материалом для исследований послужили образцы крови от 127 взрослых лошадей кабардинской породы из хозяйств Кабардино-Балкарии, Краснодарского края, Адыгеи и Карачаево-Черкесии (Хабезский район). Образцы крови собирали в стерильные вакуумные пробирки с антикоагулянтом (K3EDTA) объемом 6 мл. Сбор материала проводили квалифицированные специалисты в присутствии ветеринаров. При взятии проб строго соблюдались все пункты Федерального Закона от 27.12.2018 г. № 498-ФЗ об ответственном обращении с животными (справка № 1671 от 25.04.2022 г.).
Геномную ДНК выделяли с использованием реагентов «ДНК-Экстран-1» (СИНТОЛ, Россия). Амплификация фрагментов проводили на амплификаторе Biorad T100. Состав ПЦР смеси для обоих локусов, общим объемом 25 мкл включал: 1×ПЦР-буфер, 2,5 мМ MgCl2, смесь дНТФ по 0,2 мМ каждого нуклеотида, 0,2 мМ каждого праймера 0,5 ед. Taq ДНК-полимеразы («SibEnzyme», Россия) и 50 нг ДНК.
Генотипирование по SNP-маркеру 248C > T (см. рисунок, а) гена MC1R осуществляли методом PCR-RFLP согласно описанию L. Marklund с соавт. [12] c использованием опубликованных последовательностей праймеров: 5´-CCTCGGGCTGACCACCAACCAGACGGGGCC-3´, 5´-CCATGGAGCCGCAGATGAGCACAT-3´.
Амплификацию локуса MC1R проводили по следующей схеме: 10 мин при 95 °C; 30 с при 95 °C, 40 с при 60 °C, 1 мин 30 с при 72 °C (33 цикла); 10 мин при 72 °C (финальная элонгация). Детекцию полиморфизма 248C > T в амплифицированном фрагменте (317 п. н.) ДНК осуществляли с использованием эндонуклеазы рестрикции TaqI («SibEnzyme», Россия). Эта эндонуклеаза рестрикции распознает замену 248C > T, которая приводит к образованию однонуклеотидного полиморфизма в позиции 180 амплифицированного фрагмента. По окончании гидролиза нерестрицированный фрагмент длиной 317 п. н. соответствовал генотипу E/E, наличие трех фрагментов длиной 317, 180 и 137 п. н. – генотипу E/e, два фрагмента длиной 180 и 137 п. н. – генотипу e/e.
Вариации в генах MC1R и ASIP: а) миссенс-мутация в гене MC1R обозначена рамкой; б) позиция делеции 11 п. н. в гене ASIP обозначена рамкой (референсный геном EquCab3.0).
Условия рестрикции соответствовали рекомендациям производителя, дальнейшее разделение полученных фрагментов проводили путем электрофореза в 2 %-ном агарозном геле.
Детекцию делеции 11 п. н. (см. рисунок, б) в позиции 58135 локуса ASIP проводили методом, предложенным S. Rieder с соавт. [6], с использованием последовательностей праймеров: 5´- CTTTTGTCTCTCTTTGAAGCATTG-3´, 5´-GAGAAGTCCAAGGCCTACC- TTG-3´. Режим амплификации: 10 мин при 95 °C; 30 с при 95 °C, 40 с при 55 °C, 1 мин 30 с при 72 °C (33 цикла); 10 мин при 72 °C (финальная элонгация). Полученные ампликоны размером 102 п. н. (аллель А) и 91 п. н. (аллель А) разделяли электрофорезом в 3 %-ном агарозном геле.
Обозначения аллельных вариантов исследуемых генов MC1R (E – доминантный аллель дикого типа, e – рецессивный (мутантный) аллель) и ASIP (A – доминантный аллель дикого типа, a – рецессивный (мутантный) аллель) соответствуют номенклатуре Л. В. Калинковой [1].
Масти лошадей классифицировали в соответствии с результатами ранее проведенных исследований [2, 6]. В исследованной выборке идентифицированы лошади с гнедой (33 гол.), темно-гнедой (23 гол.), вороной (33 гол.), караковой (21 гол.) и серой (17 гол.) мастью. Было установлено, что серые лошади рождаются с исходным окрасом шерсти (например, вороными или гнедыми) и постепенно теряют пигментацию шерсти с увеличением возраста, но сохраняют темную кожу. Для вороной масти характерен черный окрас шерсти на всех частях тела, хотя у некоторых есть белые отметины. Лошади с караковой мастью имеют черную шерсть на гриве, хвосте, ногах, а также почти по всему телу, но красноватые или коричневые пигменты вокруг глаз, морды и в паху. У животных с темно-гнедой мастью черная грива, хвост и ноги, шерсть на туловище черно-бурого или шоколадно-черного цвета при ярких черных подпалах на морде и ярко выраженном черном оплечье на холке. У гнедых лошадей коричневое или красноватое тело, черная грива, ноги и хвост.
Для популяционно-генетического анализа определяли частоту встречаемости аллелей и генотипов в исследуемой породе, а также наблюдаемая гетерозиготность (Ho), которую рассчитывали по формуле: Hо = N/n, где N – количество гетерозигот, n – объем выборки. Вычисление наблюдаемой гетерозиготности (Ho) проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2016.
Результаты и обсуждение. В процессе генотипирования кабардинских лошадей по гену MC1R установлено, что подавляющее большинство (96,9 %) исследованных животных были носителями доминантного аллеля E. Частота аллеля e в этом гене, который приводит к подавлению синтеза пигмента эумеланина, в группе исследованных лошадей составляет 0,280 (табл. 1).
Табл. 1. Частоты встречаемости аллелей генов MC1R и ASIP, детерминирующих пигментацию кожи и волос (n = 127)
Ген | Аллель | Частота | Наблюдаемая герозиготность |
MC1R | E | 0,720 | 0,417 |
e | 0,280 | ||
ASIP | A | 0,496 | 0,236 |
a | 0,504 |
Частота генотипа E/E гена MC1R по мере изменения окраса шерсти с темного (вороного) на более светлый (гнедой) в целом снижается, в отличие от частоты генотипа E/e, которая в основном увеличивалась при переходе с вороной на гнедую масть (табл. 2). При этом генотип E/e был преимущественным у лошадей гнедой масти (81,8 %), у темно-гнедых лошадей частота генотипа E/E составляла 39,1 %, E/e – 60,9 %, большинство вороных (69,7 %) и караковых (71,4 %) лошадей имели генотип E/E. Генотип e/e, который характерен для рыжего окраса шерсти [2], обнаружен только у серых лошадей с частотой 23,5 %. Результаты теста χ2 свидетельствуют, что фенотипы окрасов шерсти лошадей достоверно (p <0,001) связаны с генотипами MC1R.
Частота мутантного аллеля a гена ASIP в популяции кабардинской породы составила 0,504 (см. табл. 1), в том числе 49 особей были его гомозиготными носителями. Ранее Rieder S. с соавторами установили, что генотип a/a встречается только у вороных, караковых и серых лошадей [6]. Однако в нашем исследовании его отмечали у темно-гнедых особей с частотой 4,3 %. От темных (караковых) до светлых (гнедых) мастей частота генотипа А/а постепенно снижалась, а генотипа А/А увеличивалась (см. табл. 2).
Табл. 2. Распределение генотипов MC1R и ASIP по мастям, %
Ген | Генотип | Масть | Значение χ2 | ||||
гнедая | темно гнедая | вороная | караковая | серая | |||
MC1R | E/E | 18,2 | 39,1 | 69,7 | 71,4 | 41,2 | χ2 = 34,56 p < 0,001 |
E/e | 81,8 | 60,9 | 30,3 | 28,6 | 35,3 | ||
e/e | 0 | 0 | 0 | 0 | 23,5 | ||
ASIP | A/A | 84,8 | 56,6 | 0 | 9,5 | 29,4 | χ2 = 98,6 p < 0,001 |
A/a | 15,2 | 39,1 | 0 | 47,6 | 35,3 | ||
a/a | 0 | 4,3 | 100 | 42,9 | 35,3 | ||
Генотипы А/a и a/а у лошадей караковой масти отмечали примерно с одинаковой частотой (47,6 % и 42,9 % соответственно). У гнедых и темно-гнедых лошадей преимущественный генотип изменился на А/А (от 84,8 % для гнедых до 56,6 % для темно-гнедых). Все животные вороной масти имели генотип a/a, как было отмечено и в предыдущих исследованиях [2]. Результаты теста χ2 показывают, что окрасы шерсти лошадей были достоверно связаны с генотипами ASIP (p <0,001).
В исследованиях, проведенных на людях и других млекопитающих, было показано, что ген MC1R играет важную роль в определении цвета волос и шерсти [13, 14, 15].
Выводы. У лошадей кабардинской породы, окрас шерсти меняется преимущественно в зависимости от генотипа MC1R, от более темного при более высокой частоте аллеля E, на светлый при увеличении частоты аллеля e.
Анализ распределения полиморфизмов гена ASIP по мастям показал, что генотип А/а связан с темным окрасом шерсти (например, темно-гнедой и караковый), А/А – с более светлым (например, гнедой).
Полученные результаты могут быть полезны при составлении программ для совершенствования и усилий по сохранению кабардинской породы, а также обеспечат молекулярную основу для дальнейших исследований механизма окраса шерсти лошадей и других млекопитающих.
Supplementary files
