Biological variation of cortisol level in milk of domestic goats in natural habitat

Texto integral

Глюкокортикоиды (ГК) играют многогранную и важную роль в регуляции практически всех физиологических процессов. Они способны напрямую влиять на транскрипцию генов, связываясь с ядерными рецепторами непосредственно на молекулах ДНК. Их часто называют стрессорными гормонами, поскольку у позвоночных животных ГК обеспечивают адаптацию к изменениям внешней или внутренней среды путем координации метаболических, иммунных и поведенческих реакций [1]. Таким образом, изучение ГК представляет интерес как для физиологии, так и для более прикладных областей, например медицины и ветеринарии. В частности, ГК могут быть использованы как биомаркеры адаптивной реакции организма на изменение условий среды или гомеостаза [1]. Кортизол и другие ГК – химически стабильные аналиты, методы их определения отличаются простотой и высокой аналитической точностью [2, 3]. Однако интерпретация измеряемых in vivo концентраций кортизола довольно затруднительна, поскольку индивидуальный уровень гормона складывается под влиянием многих факторов, среди которых могут быть пол и возраст [4, 5], время года [6], наличие острых и хронических стрессоров [7, 8, 9], воспалительных процессов [10, 11] и др. [12]. Например, существенные изменения в уровне кортизола у животных может вызывать реакция на отбор крови, а также на другие ветеринарные манипуляции [2, 3].

Обычными матрицами для анализа кортизола или его метаболитов служат кровь, слюна, моча и фекалии. В этих биологических материалах измеренные уровни кортизола представляют собой концентрацию гормона в определенный момент времени или усредненный уровень за 1…2 дня [2, 5]. Более предпочтительным для мониторинга кортизола может стать использование альтернативных неинвазивных методов отбора проб (молока, шерсти) [5, 13, 14]. Однако это требует уточнения ряда методических аспектов. Кортизол может быть использован как биомаркер адаптивной реакции организма на изменение условий среды или гомеостаза животных, что позволяет контролировать стресс и благополучие животных [15, 16, 17].

Цель исследований – определение пределов изменения концентрации гормона кортизола в молоке свободноживущих в природной среде обитания домашних коз и изучение потенциального влияния индивидуальных и средовых факторов на физиологический уровень этого гормона в молоке для оценки возможности применения молока как удобной неинвазивной матрицы при исследовании факторов, влияющих на благополучие животных (условия содержания, манипуляции с животными и др.).

Методика. Образцы молока отбирали от лактирующих домашних коз (Capra hircus), принадлежащих к свободноживущей в природных условиях популяции, созданной и поддерживаемой на опытной биологической станции «Шаховская» ИОГен РАН. Эта популяция используется в рамках экспериментальной парадигмы изучения поведения и других сложных явлений, полноценная реализация которых происходит в естественней среде. Животные сохраняют контакт с человеком, приучены к ветеринарным манипуляциям. Образцы собирали во время ручной дойки, на которую козы приходят самостоятельно.

Отбор проб осуществляли во время утренней и вечерней дойки у пяти животных в течение 10 недель в период с августа по октябрь. Молоко отбирали, фиксируя дату, время дня, очередность животного, время, проведенное животным в ожидании, и время, затраченное на дойку. Кроме того, отмечали нетипичные обстоятельства, например, наличие видимого воспалительного процесса. Непосредственно после дойки на целлюлозную фильтровальную бумагу (TE46, Hoefer Scientific Instruments, США) наносили аликвоты проб молока (по 20 мкл) и высушивали при комнатной температуре. Полученные образцы в виде сухих пятен молока на листах фильтровальной бумаги хранили в плотно закрытом пластиковом пакете с осушителем при температуре +4^оС. Всего было собрано и проанализировано 416 образцов. Отбор проб осуществлял один человек на протяжении всего эксперимента, за исключением трех непоследовательных дней, в которые было получено 24 образца. Для проведения анализа пробы перевозили в лабораторию, расположенную на расстоянии 150 км от места их отбора.

Для измерения кортизола в молоке использовали диагностический набор «ИФА-кортизол» (Иммунотех, Россия). Для проведения анализа на том же целлюлозном носителе аналогично образцам молока были приготовлены сухие пятна стандартных растворов (0…1200 нмоль/л) и контрольный образец из ИФА-набора. Содержание кортизола определяли в соответствии с инструкцией к набору с некоторыми изменениями. Для анализа использовали выбитые дыроколом диски целлюлозной бумаги диаметром 0,5 см с высушенным стандартом/образцом. Бумажные диски помещали в лунки ИФА планшета и предварительно смачивали 20 мкл дистиллированной воды. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгата (кортизол-фермент). Планшет инкубировали в течение 15 мин с постоянным перемешиванием при 37 °C для пропитки дисков раствором, а затем еще 1 ч при тех же условиях. Все остальные процедуры выполняли в соответствии с инструкцией к набору.

Результаты анализа обрабатывали методами описательной статистики (с применением t-критерия Стьюдента) и корреляционного анализа по методу Пирсона с использованием программы SPSS Statistics v. 26 (IBM, США). Оценивали диапазон наблюдаемых концентраций кортизола для каждого животного, а также взаимосвязь его физиологического уровня в молоке с индивидуальными (возраст, объем выдоенного молока за одну дойку) и средовыми (время дня, время ожидания дойки, дневная и ночная температуры) факторами, а также очередности подхода на дойку, которую исследуемые животные определяли самостоятельно.

Результаты и обсуждение. Содержание кортизола в молоке коз в большинстве случаев не превышало 100 нмоль/л (рис. 1). Коэффициент индивидуальной вариации величины этого показателя составил 53 %, межиндивидуальной – 26 %. Как было показано ранее при исследовании растущих козлят, c возрастом средний выявленный уровень кортизола повышается [4]. В нашем исследовании принимали участие козы возрастом от двух до девяти лет и прямой зависимости между возрастом и уровнем кортизола в молоке не установлено (табл. 1). Например, для трехлетней и девятилетней особи предельные значения кортизола находились на одном уровне и превышали 100 нмоль/л, при этом медианные значения также были близки (32 и 21 нмоль/л соответственно). Кроме того, не отмечено явной тенденции к увеличению либо к уменьшению средних значений и медианы концентраций кортизола в выборке при увеличении возраста особи (табл. 1). При этом в ходе анализа образцов молока был обнаружен факт резкого повышения уровня кортизола (до 330…460 нмоль/л) для болеющего животного за несколько дней перед наступлением летального исхода.

 

Рис. 1. Изменение содержания кортизола в молоке пяти домашних коз в течение 10 недель (различные символы обозначают разных животных).

 

Табл. 1. Статистические показатели уровня кортизола в молоке для каждого из пяти животных и итоговые для всей выборки*

Код	Возраст	N	M	Медиана	SEM	SD	Асимметрия	Эксцесс	Диапазон	5 %	95 %
I	4	92	20	13	2	18	1,3	1,2	76	2	56
II	7	63	25	18	3	23	1,5	1,9	95	2	78
III	9	61	26	21	3	22	1,6	3,8	113	2	68
IV	3	106	36	32	3	28	0,9	0,2	116	4	93
V	2	94	23	16	2	20	1,3	1,1	84	2	72
Все		416	26	18	1	23	1,4	1,7	116	2	73

*N – количество образцов в выборке, М – среднее значение, SD – стандартное отклонение, SEM – стандартная ошибка среднего.

 

По результатам расчета коэффициентов корреляции Пирсона между объемом молока, сдоенного за одну дойку (утром или вечером), и наблюдаемой в нем концентрацией кортизола (табл. 2) значимая связь была обнаружена только у животного IV (p < 0,01). Соответствующие значения для этой особи отображены на диаграмме, на которую также была помещена аппроксимирующая линия (рис. 2). Как видно из диаграммы, по мере увеличения объема молока возрастает содержание в нем кортизола, причем эта закономерность становится несколько более выраженной с ростом объема. Возможно, что такая зависимость, которая не наблюдается в группе в целом, может носить индивидуальный характер. Для ответа на вопрос о существовании какой-либо закономерности необходимо провести исследования на большем числе особей и в течение более продолжительного временного промежутка.

 

Табл. 2. Коэффициенты корреляции между концентрацией определяемого кортизола и объемом сдоенного молока за одну дойку, рассчитанные для каждого животного

Животное	r	p
I	0,13	0,20
II	-0,13	0,33
III	-0,22	0,09
IV	0,33*	0,01
V	0,15	0,15

*корреляция достоверна при р < 0,01.

 

Рис. 2. Зависимость концентрации определяемого кортизола от объема сдоенного за одну дойку молока у животного IV.

 

Также был проанализирован уровень кортизола в молоке в зависимости от очередности доения, которая определялась самими животными. Достоверно более низкие уровни гормона отмечали у первого в очереди животного, по сравнению со вторым, а достоверно наиболее высокие – у второй особи, по сравнению со всеми остальными (рис. 3). У последнего (5-го) в очереди на дойку животного также отмечали высокий средний уровень гормона в выдоенном молоке, однако различия со 2-м, 3-м и 4-м животным в очереди были недостоверными согласно выбранному уровню значимости t-критерия (рис. 3). Вероятнее всего, гормон равномерно поступает в молоко в ходе его образования в альвеолах и скорость диффузии кортизола в молоко сопоставима со скоростью его образования. В то же время изменение психоэмоционального статуса, например, при определении очередности подхода на дойку, которую козы определяли самостоятельно, быстро, в течение нескольких минут, отражаются на концентрации кортизола в молоке. Это предполагает наличие альтернативного пути его поступления.

 

Рис. 3. Зависимость уровня кортизола в молоке от очередности дойки козы (статистически значимое различие наблюдается при переходе от 1 ко 2 особи (t-test, p < 0,05); горизонтальные бары обозначают медианное значение и квартили с шагом 25 %, выбросы отмечены круговыми символами).

 

В целом, полученные данные не выявили выраженного циркадного паттерна в уровне кортизола в молоке. Содержание гормона в утренние и вечерние часы значительно не отличалось (рис. 4а), так же как оно не зависело от времени ожидания дойки (рис. 4б). Значимым предиктором уровня гормона в молоке может быть среднесуточная температура окружающей среды или сочетание дневной и ночной температуры на конкретную дату отбора образца [18]. Это может быть напрямую связано как с физиологической адаптацией животных к ее изменению, так и опосредованно, например, с двигательной активностью, уровень которой различается при разной погоде. Однако в нашем исследовании значимой корреляции между уровнем кортизола и среднесуточной температурой не установлено. Для выявления потенциальной зависимости необходимо проведение годового мониторинга, учитывающего сезонные колебания температуры и освещенности.

 

Рис. 4. Изменение содержания кортизола в молоке пяти домашних коз в зависимости от: а) времени дойки, б) времени ожидания дойки (различные символы и линии обозначают разных животных и соответствующие им линии аппроксимации).

 

Выводы. Молоко можно использовать в качестве удобного неинвазивного биологического образца при исследовании различных факторов, влияющих на благополучие животных, поскольку не выявлено значимого воздействия индивидуальных и средовых факторов на физиологический уровень кортизола. По-видимому, определяющее влияние на уровень кортизола в молоке домашних коз будут оказывать текущие психоэмоциональные реакции, связанные с социальным взаимодействием как внутри вида, так и с человеком, а также наличие заболеваний. Они могут вносить больший вклад в вариацию уровня гормона, чем циркадные ритмы и возраст, а также наполненность молочной железы. Наблюдаемая внутрииндивидуальная вариация уровня кортизола в молоке была значительно выше, чем межиндивидуальная. В связи с изложенным популяционные референтные интервалы могут иметь ограниченную ценность для интерпретации значений, получаемых при анализе молока определенного животного.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 22-76-10053).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Sobre autores

A. Piskunov

Vavilov Institute of General Genetics of the Russian Academy of Sciences

Email: sushk_90@mail.ru

кандидат биологических наук

Rússia, 119991, Moskva, ul. Gubkina, 3

N. Saushkin

Lomonosov Moscow State University

Autor responsável pela correspondência
Email: sushk_90@mail.ru

кандидат химических наук

Rússia, 119991, Moskva, Leninskie gory, 1, str. 11B

J. Samsonova

Vavilov Institute of General Genetics of the Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Email: sushk_90@mail.ru

кандидат химических наук

Rússia, 119991, Moskva, ul. Gubkina, 3; 119991, Moskva, Leninskie gory, 1, str. 11B

Bibliografia

Arquivos suplementares